Se presenta una estrategia para generar mutaciones en genes de histonas en su ubicación endógena en Saccharomyces cerevisiae.
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En este artículo
Resumen
Resumen
Describimos un sistema basado en PCR y recombinación homóloga para generar mutaciones específicas en genes de histonas en células de levadura en ciernes. Los alelos mutantes resultantes residen en sus sitios genómicos endógenos y no quedan secuencias de ADN exógeno en el genoma después del procedimiento. Dado que en las células de levadura haploides, cada una de las cuatro proteínas histonas principales está codificada por dos genes no alélicos con marcos de lectura abiertos (ORF) altamente homólogos, dirigir la mutagénesis específicamente a uno de los dos genes que codifican una proteína histona en particular puede ser problemático. La estrategia que describimos aquí evita este problema utilizando secuencias fuera, en lugar de dentro, del ORF de los genes objetivo para el paso de recombinación homóloga. Otra característica de este sistema es que las regiones del ADN que impulsan los pasos de recombinación homóloga pueden ser muy extensas, lo que aumenta la probabilidad de eventos de integración exitosos. Estas características hacen que esta estrategia sea particularmente adecuada para la mutagénesis del gen de histonas, pero también se puede adaptar para la mutagénesis de otros genes en el genoma de la levadura.
Introducción
Las cuatro proteínas histonas H2A, H2B, H3, H4 y juegan un papel central en la compactación, la organización y función de los cromosomas eucarióticos. Dos juegos de cada una de estas histonas forman el octámero de histona, un carrete molecular que dirige la envoltura de ~ 147 pares de bases de ADN en torno a sí mismo, en última instancia, resulta en la formación de un nucleosoma 1. Nucleosomas son participantes activos en una variedad de procesos basados en los cromosomas, tales como la regulación de la transcripción de genes y la formación de eucromatina y heterocromatina en todos los cromosomas, y como tales han sido el foco de intensa inv....
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Protocolo
NOTA: La estrategia experimental para objetivo in situ mutagénesis de genes histona incluye varias etapas (que se resumen en la Figura 1). Estos pasos incluyen: (1) Sustitución del gen de la histona de destino con el gen URA3, (2) Generación y purificación de productos de PCR correspondientes a dos fragmentos que se superponen parcialmente del gen de la histona objetivo usando cebadores que albergan la mutación (s) deseado, (3 ) Fusión de PCR de los dos fragmentos que se superponen parcialmente para obtener productos de PCR de tamaño completo para la integración, (4) Co-transformación de los productos de PCR de tamaño completo y el ....
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Resultados
Se describe la generación de un alelo HHT2 que expresa una proteína mutante de la histona H3 que alberga una sustitución en la posición 53 de una arginina a un ácido glutámico (H3-R53E mutante) como un ejemplo representativo del objetivo de la estrategia de mutagénesis situ.
Hemos generado una cepa en la que todo el ORF de HHT2 se sustituye por el gen URA3 (véase la etapa 1.......
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Discusión
El alto grado de homología de secuencia entre los dos genes no alélicos que codifican para cada una de las cuatro proteínas histonas en células haploides de S. cerevisiae puede representar un reto para los investigadores que desean dirigirse específicamente a uno de los dos genes para la mutagénesis. Anteriormente se ha descrito metodologías de mutagénesis de levadura, incluyendo la Delitto Perfetto, mutagénesis genómica específica del sitio (SSG), y métodos de reemplazo de alelo basados en PCR libre d.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a Reine Protacio por sus útiles comentarios durante la preparación de este manuscrito. Expresamos nuestro agradecimiento a la Fundación Nacional de Ciencias (subvenciones n.º 1243680 y 1613754) y al Programa Hendrix College Odyssey por su apoyo financiero.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 kb Escalera de ADN (estándares de ADN) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Mezcla | Sigma | B0394-500G | |
| (10 mM cada una) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| Solución de EDTA (0,5 M, pH 8,0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Etanol (200 pruebas) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica disódica (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Acetato de litio dihidratado | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Termociclador | BioRad | 170-9703 | |
| Poli(etilenglicol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS ADN Polimerasa (ADN polimerasa de alta fidelidad) y tampón 5x | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Solución de ADN de esperma de salmón | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (base Tris, forma de polvo) | Sigma | T1378-1KG | |
| Acetato de sodio trihidrato | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarosa (agarosa a baja temperatura de metling) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polimerasa y tampón 10x | New England BioLabs | M0273X | |
| Palillos de dientes | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| A-D(+)-Glucosa | Fisher Scientific | AC170080025 | para medios de levadura |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | para medios de levadura |
| Peptona | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | para el medio YPD |
| Extracto de levadura | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | para el medio YPD |
| 4-aminobenzoico | Sigma | A9878-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| Adenina | Sigma | A8626-100G | para un medio de pérdida mínima completa |
| Clorhidrato de glicina | Sigma | G2879-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-Alanina | Sigma | A7627-100G | para un medio de puntaje mínimo completo |
| L-Arginina monoclorhidrato Sigma | A5131-100G | para un medio de abandono mínimo completo | |
| L-Asparagina monohidrato | Sigma | A8381-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| Ácido L-aspártico sal sódica monohidrato | Sigma | A6683-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| Clorhidrato de L-cisteína monohidrato | Sigma | C7880-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| Clorhidrato de ácido L-glutámico | Sigma | G2128-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-Glutamina | Sigma | G3126-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-Histidina monoclorhidrato monohidrato | Sigma | H8125-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-isoleucina | Sigma | I2752-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-Leucina | Sigma | L8000-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| Monoclorhidrato de L-lisina | Sigma | L5626-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-metionina | Sigma | M9625-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-fenilalanina | Sigma | P2126-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | para un medio de puntaje mínimo completo |
| L-treonina | Sigma | T8625-100G | para un medio de puntaje mínimo completo |
| L-triptófano | Sigma | T0254-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| L-Tirosina | Sigma | T3754-100G | para un medio de puntaje mínimo completo |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | para un medio de abandono mínimo completo |
| Sulfato de amonio | Fisher Scientific | A702-500 | para un medio de abandono mínimo completo |
| Base de nitrógeno de levadura | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | para un medio de abandono mínimo completo |
| Ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | para medio 5-FOA |
Referencias
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rand....
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Reimpresiones y permisos
