Aquí se describe un protocolo de 4 etapas para diferenciar células madre embrionarias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de líneas de células madre pluripotentes humanas.
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Artículo de método
La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre pluripotentes tienen la capacidad de auto renovarse y diferenciarse a múltiples linajes, por lo que una fuente atractiva para la generación de células progenitoras pancreáticas que se puede utilizar para el estudio de y el tratamiento futuro de la diabetes. En este artículo se describe un protocolo de diferenciación de cuatro etapas diseñado para generar células pancreáticas progenitoras a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs). Este protocolo se puede aplicar a una serie de líneas de células madre pluripotentes humano (HPSC). El enfoque adoptado para generar células progenitoras pancreáticas es diferenciar hESCs para modelar con precisión las etapas clave del desarrollo de páncreas. Esto comienza con la inducción de la endodermo definitivo, que se consigue cultivando las células en presencia de activina A, factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y CHIR990210. Una mayor diferenciación y el patrón con el factor de crecimiento de fibroblastos 10 (FGF10) y Dorsomorphin genera células se asemejan al intestino anterior posterior. La adición de RetinOico, NOGGIN, SANT-1 y FGF10 diferencia a las células del intestino anterior posterior en las células propias del endodermo pancreático. Finalmente, la combinación de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), nicotinamida y NOGGIN conduce a la generación eficiente de PDX1 + / + NKX6-1 células. La citometría de flujo se realiza para confirmar la expresión de marcadores específicos en las etapas clave del desarrollo de páncreas. Los + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos PDX1 al final de la etapa 4 son capaces de generar células beta maduras en el trasplante dentro ratones inmunodeficientes y pueden diferenciarse además para generar células productoras de insulina in vitro. Por lo tanto, la generación eficiente de PDX1 + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos, como se demuestra en este protocolo, es de gran importancia, ya que proporciona una plataforma para estudiar el desarrollo de páncreas humano in vitro y proporciona una fuente de células con el potencial de diferenciarse de células ß que podrían eVentually ser utilizado para el tratamiento de la diabetes.
Introducción
La prevalencia de la diabetes está en aumento y según la Asociación Canadiense de Diabetes, se estima que más de 11 millones de personas en Canadá son diabéticos o prediabéticos, con 5-10% de estas personas que tienen diabetes tipo 1 (DM1) 1. T1D es una enfermedad autoinmune que se produce por la destrucción de las células beta productoras de insulina que se encuentran dentro de los islotes de Langerhans. En la actualidad, las personas que viven con diabetes tipo 1 requieren fuentes exógenas de la insulina 2. A pesar de los avances en la terapia con insulina, los pacientes T1D siguen teniendo dificultades para regular s....
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Protocolo
1. Preparación de Soluciones y Medios
NOTA: Preparar todos los medios para el cultivo de células en un ambiente estéril. Los medios de comunicación tiene que ser realizada y utilizada inmediatamente. Detalles de reactivos se proporcionan en la Tabla de Materiales.
- medio de diferenciación
- Preparar Día 0 Diferenciación Medio: Medio RPMI con 1% de glutamina, 2 mM CHIR 99021, 100 ng / ml de activina A, 10 4 M MTG.
- Preparar Día 1-2 Diferenciación Medio: Medio RPMI con 1% de glutamina, 100 ng / ml de activina A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml de bFGF, ....
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Resultados
Generación eficiente de progenitores pancreáticos se basa en el buen crecimiento y mantenimiento de las células no diferenciadas, seguido de la adición precisa de moléculas de señalización específicas durante el protocolo de diferenciación, como se ilustra en el esquema de la Figura 1A. En el día 0, las células no diferenciadas deben ser 80 a 95% de confluencia y colonias deben tener bordes definidos (Figura 1A). En la etapa 1, los medios de comunicación.......
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Discusión
Generar con éxito NKX6-1 + progenitores pancreáticos de hPSCs in vitro se basa en el uso de cultivos de alta calidad de hPSCs y diferenciación dirigida que implican la regulación precisa de determinadas vías de señalización que regulan etapas de desarrollo clave durante el desarrollo de páncreas. Aunque este protocolo se puede utilizar para inducir la expresión robusta de NKX6-1 través de una variedad de líneas de HPSC como se muestra previamente 3, para asegurar la generación.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este manuscrito fue financiada por la Fundación General de Toronto y Occidental y el Premio de Graduados Red de Salud Banting y Best Diabetes Centro-Universidad.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| medios y citoquinas | |||
| 1-tioglicerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activina A | R& D | 338-AC/CF | |
| Ácido ascórbico | Sigma | A4544 | |
| B-27 Suplemento | Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Tampón Perm/Wash, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R& D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNasa I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorfina | Sigma | P5499 | |
| EGF | R& D | 236-EG | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R& D | 345-FG | |
| Gelatina de piel porcina | Sigma | G1890 | |
| Glutamina | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamida | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R& D | 3344-NG | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies | 15070-063 | |
| Ácido retinoico | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medio 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| Enzima TrypLE Express (1x), rojo fenol | Life Technologies | 12605-010 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Anticuerpos para citometría de flujo (diluciones de trabajo) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Burro Anti-Ratón IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugado (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Burro Anti-Cabra IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc. | 705-546-147 | |
| Ratón de control de isotipo IgG | Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc. | 015-000-003 | |
| Control de isotipo Cabra IgG | R& D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2.000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R& D | AF2419 |
Referencias
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al.
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Reimpresiones y permisos
