Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1

7.5K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/55265

⸱

7 de marzo de 2017

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2McEwen Centre for Regenerative Medicine, University Health Network, 3Department of Physiology, University of Toronto

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un protocolo de 4 etapas para diferenciar células madre embrionarias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de líneas de células madre pluripotentes humanas.

Resumen

Las células madre pluripotentes tienen la capacidad de auto renovarse y diferenciarse a múltiples linajes, por lo que una fuente atractiva para la generación de células progenitoras pancreáticas que se puede utilizar para el estudio de y el tratamiento futuro de la diabetes. En este artículo se describe un protocolo de diferenciación de cuatro etapas diseñado para generar células pancreáticas progenitoras a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs). Este protocolo se puede aplicar a una serie de líneas de células madre pluripotentes humano (HPSC). El enfoque adoptado para generar células progenitoras pancreáticas es diferenciar hESCs para modelar con precisión las etapas clave del desarrollo de páncreas. Esto comienza con la inducción de la endodermo definitivo, que se consigue cultivando las células en presencia de activina A, factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y CHIR990210. Una mayor diferenciación y el patrón con el factor de crecimiento de fibroblastos 10 (FGF10) y Dorsomorphin genera células se asemejan al intestino anterior posterior. La adición de RetinOico, NOGGIN, SANT-1 y FGF10 diferencia a las células del intestino anterior posterior en las células propias del endodermo pancreático. Finalmente, la combinación de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), nicotinamida y NOGGIN conduce a la generación eficiente de PDX1 + / + NKX6-1 células. La citometría de flujo se realiza para confirmar la expresión de marcadores específicos en las etapas clave del desarrollo de páncreas. Los + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos PDX1 al final de la etapa 4 son capaces de generar células beta maduras en el trasplante dentro ratones inmunodeficientes y pueden diferenciarse además para generar células productoras de insulina in vitro. Por lo tanto, la generación eficiente de PDX1 + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos, como se demuestra en este protocolo, es de gran importancia, ya que proporciona una plataforma para estudiar el desarrollo de páncreas humano in vitro y proporciona una fuente de células con el potencial de diferenciarse de células ß que podrían eVentually ser utilizado para el tratamiento de la diabetes.

Introducción

La prevalencia de la diabetes está en aumento y según la Asociación Canadiense de Diabetes, se estima que más de 11 millones de personas en Canadá son diabéticos o prediabéticos, con 5-10% de estas personas que tienen diabetes tipo 1 (DM1) 1. T1D es una enfermedad autoinmune que se produce por la destrucción de las células beta productoras de insulina que se encuentran dentro de los islotes de Langerhans. En la actualidad, las personas que viven con diabetes tipo 1 requieren fuentes exógenas de la insulina 2. A pesar de los avances en la terapia con insulina, los pacientes T1D siguen teniendo dificultades para regular sus niveles de glucosa en sangre y continúan sufriendo tanto hipoglucemia y la hiperglucemia. Una forma prometedora de tratamiento para restaurar la normoglucemia en T1D es el uso de células madre embrionarias humanas (hESCs), que podrían utilizarse para generar un suministro ilimitado de células productoras de ß tanto in vivo como in vitro 3 insulina, 4, 5, 6, 7. La diferenciación de hESCs a ß-como las células podrían hacer posible el estudio de la diabetes in vitro, lo que permite la identificación de nuevas dianas terapéuticas para la diabetes tipo 2 y proporcionar células para el trasplante en pacientes T1D.

El intento más exitoso en la generación de células productoras de insulina a partir de hESCs in vitro es de recapitular los eventos embrionarias que se producen durante el desarrollo de páncreas 4, 5. Esta consiste en la manipulación de distintas vías de señalización para modelar con precisión las etapas clave del páncreas en desarrollo. Desarrollo pancreático comienza con la inducción de la endodermo definitivo, que se caracteriza por la expresión de CXCR4 y CD117 (c-KIT) 8, 9. La regulación precisa de DefinitSe requiere organización endodermo ive para la formación del tubo intestinal, que a continuación se somete anterior-a-posterior patrón y-ventral dorsal. El dorsal y las yemas de páncreas ventral emergen de la región del intestino anterior posterior que expresa el gen homeobox pancreática y duodenal (Pdx1), que es necesaria para el desarrollo de páncreas 10. El dorsal y ventral brotes se fusionan para formar el páncreas, que luego se somete a una amplia remodelación epitelial y expansión 11. Compromiso con el endocrino y exocrino linaje va acompañada de la generación de células progenitoras multipotentes (PSM) que expresan, entre otros, los factores de transcripción Pdx1, Nkx6.1 y Ptf1a 12, 13. PSM que se convertirán en células endocrinas y ductales continúan expresando Nkx6-1 la vez que disminuye la expresión Ptf1a. Contrariamente a esto, las células exocrinas del linaje perderán expression de Nkx6-1 y mantener la expresión Ptf1a 12.

El factor de transcripción Nkx6-1 tiene un papel clave en el desarrollo de páncreas, particularmente durante la diferenciación de las células progenitoras endocrinas a las células ß. Como se ha descrito anteriormente, la supresión de los resultados en la formación de Nkx6-1 deteriorada de las células beta durante el desarrollo de páncreas 14. Por lo tanto, la generación de células beta productoras de insulina tanto in vitro como in vivo requiere la inducción eficiente de Nkx6-1.

Recientemente hemos desarrollado un protocolo para generar eficientemente PDX1 + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos de hPSCs. Estos progenitores pancreáticos derivados de HPSC generan células beta maduras en el trasplante dentro ratones inmunodeficientes 3. El protocolo de diferenciación se puede dividir en 4 etapas características de: 1) la inducción endodermo definitivo, 2) el patrón posterior intestino anterior, 3) la especificación de páncreas y 4) la inducción NKX6-1. A continuación se realiza una descripción detallada de cada paso de la diferenciación dirigida.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Preparación de Soluciones y Medios

NOTA: Preparar todos los medios para el cultivo de células en un ambiente estéril. Los medios de comunicación tiene que ser realizada y utilizada inmediatamente. Detalles de reactivos se proporcionan en la Tabla de Materiales.

  1. medio de diferenciación
    1. Preparar Día 0 Diferenciación Medio: Medio RPMI con 1% de glutamina, 2 mM CHIR 99021, 100 ng / ml de activina A, 10 4 M MTG.
    2. Preparar Día 1-2 Diferenciación Medio: Medio RPMI con 1% de glutamina, 100 ng / ml de activina A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml de bFGF, ácido 50 mg / ml ascórbico.
    3. Preparar Día 3-5 Diferenciación Medio: Medio RPMI con 1% de glutamina, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 M Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
    4. Preparar Día 6-7 Diferenciación Medio: DMEM con 1% de glutamina, 1% B27, 50 mg / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml FGF10, 0,25 M SANT-1, 2 M ácido retinoico, 50 ng / ml NOGGIN.
      NOTA: retinoicoEl ácido debe añadirse a los medios de comunicación y los medios última debe protegerse de la luz para evitar la degradación oxidativa 15.
    5. Preparar Día 8-12 Diferenciación Medio: DMEM con 1% de glutamina, 1% B27, 50 mg / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml de hEGF, mM Nicotinamida 10.
  2. Preparar tampón de FACS: 10% de FBS en PBS, menos calcio y magnesio.

Diferenciación 2. HESC

NOTA: HESC se descongelan, a pases y se expandió en fibroblastos embrionarios de ratón irradiado en presencia de un medio de comunicación basado en KOSR suplementado con bFGF 16. Células madre embrionarias humanas están listos para la diferenciación cuando las células alcanzan 80-95% de confluencia. En este momento las colonias deben ser grandes con bordes definidos y un 'en forma de cúpula "estructura (Figura 1A). Todo cultivo celular se realiza en de fondo plano, placas tratadas de cultivo de tejidos recubiertos con 0,1% de gelatina. Típicamente, las células se cultivan en 6 oplacas de 12 pocillos, en volúmenes de medios de 2 ml o 1 ml, respectivamente.

  1. En el día 0, comienza la diferenciación mediante la sustitución de los medios de comunicación basada en KOSR con el Día 0 Diferenciación de Medios.
  2. En los días 1 y 2, agitar suavemente la placa para eliminar las células muertas de la monocapa antes de aspirar. Reemplazar con el Día 1-2 Diferenciación de Medios.
  3. El día 3, las células de la cosecha para citometría de flujo. Si las células expresan más de un 90% CXCR4 + / CD117 +, continúe en el paso 2.4.
  4. En los días 3 y 5, agitar suavemente la placa para eliminar las células muertas de la monocapa antes de la aspiración. Reemplazar con el Día 3-5 Diferenciación de Medios.
  5. En los días 6 y 7, reemplace con el Día 6-7 Diferenciación de Medios.
  6. En los días 8, 10 y 12, reemplace con el Día 8-12 Diferenciación de Medios.
  7. En el día 13, las células de la cosecha para citometría de flujo para determinar PDX1 y expresión NKX6-1.

3. Las células de cosecha para el análisis de citometría de flujo

  1. Disociar las células consolución de tripsina comercial 1x según el protocolo del fabricante y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
  2. Eliminar la solución de tripsina comercial y resuspender las células individuales en 1.000 l de tampón FACS con 30 l de DNasa I.
  3. celdas de filtración usando un filtro de células de malla de nylon de 35 micras y transferir a un tubo de microcentrífuga.
  4. centrifugar las células a 455 xg durante 5 min. Preparar células para la tinción en vivo o fijo.

4. La tinción para citometría de flujo

  1. El flujo de preparación para la tinción en vivo en el día 3
    1. Resuspender las células en 1.000 l de tampón FACS. Transferencia de 200 l (aproximadamente 1-3 x 10 5 células) en dos pocillos de una placa de 96 pocillos (para ambas muestras no teñidas y manchadas).
    2. Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa.
    3. Mancha con anticuerpos primarios conjugados, CXCR4: APC y CD117: PE (ver Tabla) M ateriales para 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz.
    4. Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa.
    5. Volver a suspender las muestras en 100 l de tampón FACS.
    6. Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa.
    7. Resuspender cada muestra y la transferencia en un volumen total de 300 a 500 l de tampón FACS a 1 ml microtubos de ensayo o tubos de 5 ml de fondo redondo.
    8. Las muestras se ejecutan en el citómetro de flujo 17. Si las muestras no pueden ejecutarse de inmediato, se almacena a 4 ° C al abrigo de la luz.
  2. Flujo preparación para la tinción fija en día 13
    1. Resuspender el sedimento celular en solución de fijación / permeabilización comercial durante 24 horas a 4 ° C.
    2. Centrifugar la muestra a 455 xg durante 5 min. Volver a suspender en 400 l solución de Perm / Wash.
    3. Transferir 200 l de la muestra (aproximadamente 0,5-1 x 10 6 células) a two pocillos de una placa de 96 pocillos (para el control de IgG y PDX1 tinción / NKX6-1). Centrifugar a 931 xg durante 2 min.
    4. Volver a suspender los sedimentos celulares en 100 l solución de Perm / Wash contiene anti-PDX1 y anticuerpos anti-NKX6-1 de control primario o isotipo (véase la Tabla de Materiales). Incubar toda la noche a 4 ° C.
    5. Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. Volver a suspender las muestras en 100 l solución de Perm / Wash.
    6. Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa.
    7. Volver a suspender las muestras en 100 l de Perm / Wash que contienen anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 hora protegido de la luz.
    8. Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa.
    9. Volver a suspender las muestras en 100 l de Perm Solución / lavado.
    10. Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa.
    11. Repscoma paso 4.2.9 y 4.2.10.
    12. Resuspender cada muestra y la transferencia en un volumen total de 300 a 500 l de tampón FACS a 1 ml microtubos de ensayo o tubos de 5 ml de fondo redondo.
    13. Las muestras se ejecutan en el citómetro de flujo 17. Si las muestras no pueden ejecutarse de inmediato, se almacena a 4 ° C al abrigo de la luz.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Generación eficiente de progenitores pancreáticos se basa en el buen crecimiento y mantenimiento de las células no diferenciadas, seguido de la adición precisa de moléculas de señalización específicas durante el protocolo de diferenciación, como se ilustra en el esquema de la Figura 1A. En el día 0, las células no diferenciadas deben ser 80 a 95% de confluencia y colonias deben tener bordes definidos (Figura 1A). En la etapa 1, los medios de comunicación...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Generar con éxito NKX6-1 + progenitores pancreáticos de hPSCs in vitro se basa en el uso de cultivos de alta calidad de hPSCs y diferenciación dirigida que implican la regulación precisa de determinadas vías de señalización que regulan etapas de desarrollo clave durante el desarrollo de páncreas. Aunque este protocolo se puede utilizar para inducir la expresión robusta de NKX6-1 través de una variedad de líneas de HPSC como se muestra previamente 3, para asegurar la generación...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este manuscrito fue financiada por la Fundación General de Toronto y Occidental y el Premio de Graduados Red de Salud Banting y Best Diabetes Centro-Universidad.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
medios y citoquinas
1-tioglicerol (MTG)SigmaM6145
Activina AR& D338-AC/CF 
Ácido ascórbicoSigmaA4544
B-27 SuplementoTechnologies12587-010 
BD Cytofix/Cytoperm BufferBD Bioscience554722
BD Tampón Perm/Wash, 1xBD Bioscience554723
bFGFR& D233-FB
CHIR990210Tocris4423a
Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM)Life Technologies11995
DNasa IVWR80510-412 
DorsomorfinaSigmaP5499
EGFR& D236-EG
Suero Fetal Bovino (FBS)Wisent88150
FGF10R& D345-FG
Gelatina de piel porcinaSigmaG1890
GlutaminaLife Technologies25030
NicotinamidaSigmaNO636
NOGGINR& D3344-NG
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies15070-063
Ácido retinoicoSigmaR2625
RPMI Medio 1640Life Technologies11875
SANT-1Tocris1974
Enzima TrypLE Express (1x), rojo fenolLife Technologies12605-010
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpos para citometría de flujo (diluciones de trabajo)
CD117 PE (1:100)Life TechnologiesCD11705
CXCR4 APC (1:50)BD  Bioscience551966
Burro Anti-Ratón IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugado (1:400)Life TechnologiesA-31571
Burro Anti-Cabra IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc.705-546-147
Ratón de control de isotipo IgG Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc. 015-000-003
Control de isotipo Cabra IgGR& D   AB-108-C
NKX6-1 (1:2.000)DSHBF55A10
PDX1 (1:100)R& DAF2419
Life

Referencias

  1. Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
  2. Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
  3. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  4. Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  5. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
  6. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  7. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  8. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  9. Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
  10. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  11. Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
  12. Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
  13. Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
  14. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
  15. Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
  16. Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
  17. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  18. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  19. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004(2012).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Expresión de NKX6-1citometría de flujoendodermo definitivoprotocolo de diferenciaciónmarcadores de PDX1células madre embrionarias humanascultivo celularratones inmunodeficientes
La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.