Este artículo proporciona una metodología detallada para identificar y cuantificar los subconjuntos de linfocitos T funcionales presentes dentro de riñón murino, la aorta y los ganglios linfáticos mediante tinción intracelular y citometría de flujo. El modelo de hipertensión inducida por angiotensina II fue elegido para explicar, paso a paso, los procedimientos y los principios fundamentales de la citometría de flujo y tinción intracelular.
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Artículo de método
La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión
En este artículo
Resumen
Resumen
Ahora es bien sabido que los linfocitos T desempeñan un papel crítico en el desarrollo de varias enfermedades cardiovasculares1,2,3,4,5. Por ejemplo, estudios de nuestro grupo han demostrado que la hipertensión se asocia a una acumulación excesiva de células T en los vasos y en el riñón durante el desarrollo de la hipertensión experimental6. Una vez en estos tejidos, las células T producen varias citocinas que afectan tanto a la función vascular como a la renal, lo que conduce a la vasoconstricción y a la retención de sodio y agua1,2. Para comprender completamente cómo las células T causan enfermedades cardiovasculares y renales, es importante poder identificar y cuantificar los subconjuntos específicos de células T presentes en estos tejidos. Los subconjuntos de linfocitos T se definen por una combinación de marcadores de superficie, las citocinas que secretan y los factores de transcripción que expresan. La complejidad de la población de linfocitos T hace que la citometría de flujo y la tinción intracelular sean una técnica invaluable para diseccionar los fenotipos de los linfocitos presentes en los tejidos. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para identificar los marcadores de superficie e intracelulares (citocinas y factores de transcripción) en células T aisladas de ganglios linfáticos murinos de riñón, aorta y drenaje aórtico en un modelo de hipertensión inducida por angiotensina II. Se describen en detalle los siguientes pasos: aislamiento de los tejidos, generación de las suspensiones unicelulares, estimulación ex vivo, fijación, permeabilización y tinción. Además, se discuten varios principios fundamentales de los análisis de citometría de flujo, incluida la elección de los controles adecuados y las estrategias de compuerta adecuadas.
Introducción
La evidencia reciente demuestra que el sistema inmune adaptativo, en particular los linfocitos T, juegan un papel crítico en el desarrollo de varias enfermedades cardiovasculares 1,2,3,4,5. Por ejemplo, en el modelo de la hipertensión inducida por la angiotensina II, una acumulación de células T en los vasos y los riñones de ratones se ha descrito 6. La acumulación vascular es predominantemente en la adventicia y la grasa perivascular. En el riñón, las células T se acumulan tanto en la médula y la corteza renal. Dependiendo de qué subconjunto está involucrado, estas células T dan lugar a diferentes citoquinas que pueden afectar la función vascul....
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Protocolo
Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Vanderbilt ha aprobado los procedimientos descritos en el presente documento. Los ratones se encierran y se cuidan de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academies Press. Revisada en 2010).
1. Aislamiento del Drenaje aórtica ganglios linfáticos, riñón y aorta de los ratones
- La eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO2. Pulverizar el pecho con un 70% de etanol y abrir con cuidado la piel y la pared torácica con unas tijeras para exponer el corazón.
- Para la perfusión de la vasculatura, realizar una peque....
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Resultados
El protocolo descrito permite la identificación de marcadores de superficie e intracelulares en células T aisladas de riñón murino, la aorta y aórtica ganglios linfáticos que drenan en un modelo de hipertensión inducida por angiotensina II. Los resultados representativos se presentan a continuación.
La Figura 1 demuestra la estrategia de gating utilizado para identificar la población de células T en una sola s.......
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Discusión
El protocolo descrito en este documento se ha optimizado para identificar adecuadamente los subconjuntos de células T presentes en los riñones, la aorta y los ganglios linfáticos murinos. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para examinar otros subconjuntos de células inmunitarias, como los linfocitos B y las células inmunitarias innatas, y se puede modificar para incluir otros tipos de tejidos. El paso de digestión es crítico y debe modificarse y optimizarse para cada tejido9. Un paso de digestión prolo.......
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Divulgaciones
MSM es apoyado por una beca de Gilead Sciences cardiovasculares.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por un premio de la Asociación Americana del Corazón Fellowship (16POST29950007) a FL, una beca de formación de los Institutos Nacionales de Salud (NIH T32 HL069765) de DAC, un premio de la Asociación de Becarios Americana del Corazón (14POST20420025) para MA Saleh, y un NIH premio K08 (HL121671) a los HSH. El MSM también es apoyado por una beca de investigación de Gilead Sciences, Inc.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colagenasa D | ROCHE | 11088882001 | |
| Colagenasa A | ROCHE | 10103586001 | |
| Colagenasa B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE 10104159001 | ||
| 1x Tampón de lisis de glóbulos rojos | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medio 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS sin calcio y magnesio | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | Para centrifugación en gradiente de densidad |
| GentleMACS™ Tubo C | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Dispositivo disociador GentleMACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Utilice el programa SPLEEN_04 |
| Cóctel de activación celular (con Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | diluido 1:100 |
| VIVO/MUERTO kit de tinción de células muertas violetas fijables | Life Technologies | L34955 | |
| Conjunto de tampones de factores de transcripción | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 cuentas eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clon 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clon 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clon TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clon 9D3.1C8) | BioLegend | ||
| CD4 APC-Cy7 (clon GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clon 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clon 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clon XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
Referencias
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al.
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Reimpresiones y permisos
