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Artículo de método

Murina de linfocitos Etiquetado por

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DOI:

10.3791/55270

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29 de abril de 2017

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1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

En este artículo

Resumen

Después de la preparación de un anticuerpo monoclonal modificado-Cu 64 la unión a un receptor de células T murino transgénico, las células T son radiomarcado in vivo, se analizaron para viabilidad, la funcionalidad, la estabilidad etiquetado y apoptosis, y adoptivamente transferidas en ratones con una vía aérea hipersensibilidad de tipo retardado reacción para formación de imágenes no invasiva mediante tomografía de emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT).

Resumen

Este protocolo ilustra la producción de 64 Cu y el quelante de conjugación / radiomarcaje de un anticuerpo monoclonal (mAb), seguido de cultivo de células de linfocitos murinos y receptor 64 Cu-anticuerpo dirigido de las células. Evaluación in vitro de se describen el radiomarcador y no invasiva en el rastreo de células in vivo en un modelo animal de una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado de la vía aérea (DTHR) por PET / CT.

En detalle, se muestra la conjugación de un mAb con el quelante de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA). Después de la producción de radioactivo 64 Cu, radiomarcaje del mAb DOTA-conjugado se describe. A continuación, la expansión de la ovoalbúmina de pollo (COVA) CD4 específica de + interferón (IFN) -γ productoras se representan las células T helper (cova-Th1) y el posterior radiomarcaje de las células cova-TH1. Diversas técnicas in vitro se presentan para evaluar la efefec- de 64 Cu-radiomarcaje en las células, tales como la determinación de la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano, la tinción para la apoptosis con Anexina V para citometría de flujo, y la evaluación de la funcionalidad mediante la enzima de ensayo inmunoabsorbente ligado a IFN-γ (ELISA) . Además, la determinación de la absorción radiactiva en las células y la estabilidad de etiquetado se describen en detalle. Este protocolo describe además cómo realizar estudios de seguimiento de células en un modelo animal para una DTHR las vías respiratorias y, por lo tanto, se incluye la inducción de la vía aérea DHTR aguda inducida por cova en ratones BALB / c. Por último, se presenta un robusto flujo de trabajo de PET / CT incluyendo la adquisición de imágenes, reconstrucción y análisis.

El enfoque dirigido a un receptor 64 Cu-anticuerpo con la subsiguiente internalización del receptor proporciona una alta especificidad y estabilidad, la reducción de la toxicidad celular, y las bajas tasas de flujo de salida en comparación con PET comunes trazadores para el etiquetado de células, por ejemplo 64 Cubis -pyruvaldehyde (N4-metiltiosemicarbazona) (64 Cu-PTSM). Por último, nuestro enfoque permite no invasivo en el seguimiento in vivo de células mediante PET / CT con una relación óptima de señal a fondo durante 48 h. Este enfoque experimental se puede transferir a diferentes modelos animales y tipos de células con receptores unidos a la membrana que se internalizan.

Introducción

Seguimiento de células no invasiva es una herramienta versátil para controlar la función celular, la migración y homing in vivo. Recientes estudios de seguimiento celular se han centrado en mesenquimales 1, 2 o de médula ósea las células madre derivadas de 3 en el contexto de la medicina regenerativa, las células blancas de la sangre periférica autólogas en la inflamación o linfocitos T en las terapias con células adoptivas contra el cáncer de 3, 4. La elucidación de los sitios de acción y los principios biológicos subyacentes de las terapias basadas en células es de tremenda importancia. Linfocitos T citotóxicos CD8 +, por ingeniería genética del receptor de antígeno quimérico (CAR) las células T o linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) fueron consideradas ampliamente como el estándar de oro. Sin embargo, las células TH1 específicos de antígeno asociado a tumores han demostrado ser una opción de tratamiento alternativa efectiva 4, </ sup> 5, 6, 7.

Como actores clave en la inflamación, enfermedades autoinmunes específicas de órganos (por ejemplo, la artritis reumatoide o el asma bronquial), y células de gran interés en la inmunoterapia del cáncer, es importante para caracterizar los patrones de distribución y homing temporales de células TH1. No invasiva in vivo de formación de imágenes por PET presenta un método cuantitativo, altamente sensible 8 para examinar los patrones de migración de células, en homing vivo, y los sitios de acción y las respuestas de células T durante la inflamación, alergias, infecciones o el rechazo del tumor 9, 10, 11.

Clínicamente, 111 In-oxina se utiliza para la gammagrafía de leucocitos para la discriminación de la inflamación y la infección 12, mientras que 2-desoxi-2- (18F) fluoro-D-glucosa (18 F-FDG) se utiliza comúnmente para estudios de seguimiento celular por PET 3, 13. Una desventaja importante de este trazador PET, sin embargo, es la corta vida media del radionúclido 18 F a 109,7 min y la baja estabilidad intracelular que impide de formación de imágenes en los puntos de tiempo posteriores poste de transferencia de células adoptivas. Para más largo plazo en los estudios de seguimiento de células in vivo por PET, aunque inestable en las células, 64 Cu-PTSM se utiliza con frecuencia para etiquetar de manera no específica las células 14, 15 con efectos perjudiciales minimizadas en la viabilidad de las células T y la función 16.

Este protocolo describe un método para reducir aún más efectos desventajosos sobre la viabilidad celular y la función utilizando un receptor de células T (TCR) mAb radiomarcado específico de. En primer lugar, la producción del radioisótopo 64 Cu, la conjugación del mAb KJ1-26 con ésimoe quelante DOTA, y la posterior 64 Cu-radiomarcaje se muestran. En una segunda etapa, el aislamiento y la expansión de las células cova-TH1 de ratones donantes DO11.10 y el radiomarcado con 64 cargado-Cu DOTA-conjugado mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) se describen en detalle. La evaluación de los valores de captación y de flujo de salida de la radiactividad con un calibrador de dosis y por gamma-conteo, respectivamente, así como la evaluación de los efectos de 64 Cu-radiomarcaje sobre la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano y la funcionalidad con se presentan IFN-gamma ELISA . Para no invasivo en el seguimiento de células in vivo, se describen la obtención de un modelo de ratón de inducida por COVA vías respiratorias aguda DTHR y Adquisición de imágenes por PET / CT después de la transferencia celular adoptiva.

Además, este enfoque de etiquetado puede ser transferido a diferentes modelos de enfermedad, las células T murinas con diferentes TCR o células generales de interés con los receptores unidos a la membrana o mar expresiónkers subyacente membrana continua shuttling 17.

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Protocolo

Precauciones de seguridad: Al manipular la radiactividad, almacenar 64 Cu detrás de ladrillos de plomo 2 pulgada de grosor y utilizar respectivo blindaje para todos los buques que llevan actividad. Utilizar las herramientas adecuadas para manejar indirectamente fuentes sin blindaje para evitar el contacto directo de las manos y reducir al mínimo la exposición a material radiactivo. Siempre use insignias de monitoreo dosimetría de radiación y equipo de protección personal y comprobar uno mismo y la zona de trabajo para la contaminación de abordar inmediatamente. Desechar el equipo de protección personal potencialmente contaminado antes de salir de la zona donde se utiliza material radiactivo. Almacenar toda los residuos radiactivos detrás de blindaje de plomo hasta que el radiactiva 64 Cu se han debilitado (aproximadamente 10 vidas medias = 127 h) antes de su eliminación adecuada.

1. 64 Cu Producción

NOTA: El radioisótopo 64 Cu se produce a través de la 64 Ni (p, n) 64 Cu reacción nuclear utilizando un Pettciclotrón carrera de acuerdo con un protocolo modificado de McCarthy et al. 18.

  1. Por 64 la producción de Cu, irradiar 64 Ni, que se galvaniza en un plato de platino / iridio (90/10), con 30 μA durante 6 h con un haz de protones de 12,4 MeV.
  2. Calentar el objetivo de platino / iridio a 100 ° C en una cámara de polieteretercetona dedicado (PEEK) y se incuban en 2 ml de HCl concentrado durante 20 min para disolver 64 Cu / 64 Ni.
  3. Añadir otro 1 ml de HCl concentrado y se incuba durante 10 min.
  4. Evaporar HCl utilizando una corriente de argón y se enfría la cámara a temperatura ambiente.
  5. Enjuague la cámara con 3 ml de 4% M HCl 0,2 y 96% de metanol (v / v) y la transferencia de esta solución a una columna de intercambio de iones que fue pre-acondicionado con 4% de HCl 0,2 M en metanol durante al menos 15 min. El flujo a través se puede utilizar para reciclar 64 Ni.
  6. Lavar el 64 Cu retenido en la columna con 4% 0,2 M HCl in metanol.
  7. Eluir 64 Cu con 70% M HCl 1,3 / 30% isopropanol (v / v) en un vial de recogida, se evapora la solución en una corriente de argón y dejar que el vial enfriar a temperatura ambiente.
  8. Disolver 64 Cu en 140-210 l de HCl 0,1 M.

2. Anticuerpo conjugación con DOTA y posterior 64 Cu-radiomarcaje

NOTA: El quelante DOTA estará vinculado a grupos amino funcionales del mAb por N-hidroxisuccinimida (NHS) química éster y el conjugado se pueden radiomarcar subsiguientemente con 64 Cu 19.

  1. Ajustar la concentración de la KJ1-26-mAb a 8 mg / ml y diafiltrado 1 ml de mAb solución contra 0,1 M Na 2 HPO 4 pH 7,5 se trató con 1,2 g / L de una resina de intercambio de iones quelante usando un corte de peso molecular ( MWCO 30 kDa) unidad de filtro centrífugo. Aplicar 3 etapas de lavado subsiguientes con 14 ml del tampón. Después de la etapa de lavado final,concentrar la solución de nuevo a 1 ml. Cuantificar la concentración de anticuerpo mediante mediciones de DO 280 nm.
  2. Preparar una solución de DOTA-NHS en ultrapura o agua de calidad para PCR a una concentración de 10 mg / ml inmediatamente antes del uso. Deje el vial ajustar a la temperatura ambiente antes de abrir para evitar la condensación de agua, y cuidadosamente eliminar DOTA-NHS usando una espátula de plástico. Añadir 216! L de esta solución de DOTA-NHS a 8 mg de la solución diafiltrada KJ1-26-mAb, mezclar a fondo, y se incuba durante 24 horas a 4 ° C en un mezclador de tambor.
  3. Diafiltrado la DOTA-KJ1-26-mAb frente a acetato de amonio 0,25 M, pH 7,0, se trató con 1,2 g / L de una resina de intercambio de iones quelante, usando un corte de peso molecular (MWCO 30 kDa) unidad de filtro centrífugo. Aplicar 7 etapas de lavado. Se concentra el mAb a un volumen final de 1 ml y de nuevo medir la concentración de proteína mediante medidas de 280 nm de DO.
  4. Antes de radiomarcaje, intercambiar el tampón de la DOTA-KJ1-26-mAb a PBS a través de tamaño-exccromatografía lusion usando columnas de filtración en gel. Esto también elimina posibles impurezas de molécula pequeña.
  5. Preparar 100 MBq solución 64 CuCl 2 en HCl 10 mM y ajustar el pH a 6-7 con 10x PBS. Añadir 200 g de DOTA-KJ1-26 mAb. Incubar durante 60 min a 37 ° C.
  6. Para el control de calidad, lleve a cabo cromatografía en capa fina con citrato de sodio 0,1 M (pH 5) como fase móvil y analizar por autorradiografía. Al menos el 90% de la actividad debe ser unido al anticuerpo y por lo tanto ser detectada en el punto de partida. actividad no unido se quelado por la fase móvil a base de citrato y rayas para el frente del disolvente. Para una referencia, se aconseja el uso de CuCl 64 2.

3. pollo ovoalbúmina-específico TH1 (cova-TH1) aislamiento de células y de expansión

NOTA: El cultivo de células TH1 se describe de acuerdo con los estudios publicados previamente 16, 17.

  1. Aislar los bazos y los ganglios linfáticos extraperitoneal (LNS) de ratones DO11.10.
    1. Sacrificar el ratón de acuerdo a las regulaciones federales. Desinfectar el animal con 70% de etanol y fijar con cinta adhesiva para la eliminación del bazo y LN. Hacer una incisión media y separar la piel del peritoneo por lateralmente tirando de él a cada sitio.
    2. Localizar la cervical, axial, braquial y los LN inguinales. Retire ellos con unas pinzas romas y colocarlos en 1% de suero de ternera fetal (FCS) / tampón PBS.
    3. Abrir el peritoneo y localizar el bazo. Separar el bazo del páncreas y tejido conectivo y colocarlo en tampón FCS / PBS 1%. Para mayor orientación, véase las referencias 20,21.
  2. Pique bazo y LN a través de un filtro de 40 micras en una de 50 ml de tornillo tubo con tapón utilizando el émbolo de una jeringa. Enjuague el filtro con 10 ml de 1% de FCS / PBS-buffer.
  3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. SubsequenTLY, lleve a cabo la lisis de eritrocitos mediante la adición de amonio-cloruro-potasio (ACK) de tampón de lisis (1,5 ml por animal donante) durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 8,5 ml de 1% de FCS / PBS-tampón (por animal donante).
  4. Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Se lavan las células en 10 ml de FCS al 1% / PBS-tampón, centrifugar a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante.
  5. Para la separación celular magnética, resuspender las células en 1% de FCS / PBS-tampón y añadir CD4 + microperlas. Consulte las instrucciones del fabricante para el volumen de compensación y la cantidad de células CD4 + microperlas de usar.
  6. Incubar durante 20 min a 4 ° C. A continuación, añadir 1% de FCS / PBS-tampón hasta 50 ml, centrifugar las células a 400 xg durante 5 min, y eliminar el sobrenadante.
  7. Continuar con el aislamiento de células T CD4 + utilizando columnas de separación magnética comerciales y un soporte magnético correspondiente de acuerdo con el protocolo del fabricante. Ajustar las células T CD4 + eluidas a un concentration de 10 6 células / ml en medio de Eagle modificado de Dulbecco con 1% de ácidos 10% de FCS, inactivado por calor 2,5% de penicilina / estreptomicina, tampón HEPES 1%, MEM aminoácidos, piruvato de sodio 1%, y 0,2% de 2-mercaptoetanol y tienda ellos a 4 ° C.
  8. Recoger la descarga de columna en un tubo de 50 ml tapón de rosca para preparar células presentadoras de antígeno (APCs). Centrifugar la descarga de la columna a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante.
  9. Añadir 10 g / ml anti-CD4 (clon: GK1.5), 10 g / ml anti-CD8 (clon: 5367,2) y 10 g de ratón / ml anti-rata-mAb (MAR18.5) y 1,5 ml de complemento de conejo. Incubar durante 45 min a 37 ° C.
  10. Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y añadir 3 ml de medio. Irradiar las APC en una fuente de rayos γ o rayos x con 30 Gy en total. Después, ajustar las APC a una concentración de 5 x 10 6 células / ml.
  11. Añadir 100 células l de T CD4 + y 100 l de APCs en un pla de 96 pocilloste junto con 10 g / mL cOVA 323-339-péptido, 10 g / ml anti-IL-4-mAb, 0,3 mu M CPG1668-oligonucleótidos y 5 U / ml de IL-2.
  12. Añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día. Después de 3 - 4 días, la transferencia de las células de las placas de 96 pocillos a placas de 24 pocillos. Combinar 3-5 pozos de la placa de 96 pocillos en un pocillo en la placa de 24 pocillos. Añadir 100 U / ml de IL-2 que contenía medio en una proporción de 1: 1.
  13. Después de otros 23 días, la transferencia de las células de la placa de 48 pocillos a 175 cm 2 frascos de cultivo de células (placa 1 x 48 pocillos por matraz). Rellenar con en un 1 medio: 1. Añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día.
  14. Dividir las células de acuerdo con la densidad celular y añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día. De esta manera, cultivar las células durante otros 10 días.

El radiomarcaje de la célula 4. cova-TH1

NOTA: El 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb se aplicará a las células cova-TH1 cultivadas para permitir el etiquetado radiactivo intracelular.

  1. Para cova-TH1 ceradiomarcaje ll, dibujar 37 MBq de la radiomarcado 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb en una jeringa sin volumen muerto usando un calibrador de dosis. Añadir 1 ml de solución salina para recibir una solución al 37 MBq / ml.
  2. Suspender las células cova-Th1 en medio a 2 x 10 6 células / ml y añadir 0,5 ml de la suspensión celular a cada pocillo en una placa de 48 pocillos.
  3. Añadir 20 l de la recién preparadas 37 MBq / ml 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb a cada pocillo de la placa de 48 pocillos. La relación final para el etiquetado es de 0,7 MBq por 10 6 células en un volumen de 520! L. Incubar a 37 ° C y 7,5% de CO2 durante 30 min.
  4. Después de la incubación, resuspender cuidadosamente las células en cada pocillo y transferir la suspensión de células de la placa de 48 pocillos en un 50 ml de tornillo tubo con tapón. Para minimizar la pérdida de células, enjuague cada pocillo con medio precalentado.
  5. Centrifugar la suspensión celular cova-TH1 a 400 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante, y resuspender las células en 10 ml de PBS precalentado. Eliminar una unaliquot de la suspensión celular para el recuento celular. Repetir el paso de lavado.
  6. Recuento de células cova-TH1 viables en una dilución apropiada con tinción con azul de tripano.
  7. Ajustar la concentración de células a 5 x 10 7 células / ml para la inyección intraperitoneal (ip) de 10 7 células en 200 l de PBS.
  8. Repetir los pasos 4.3 a 4.5 para radiomarcar las células cova-TH1 con cantidades crecientes de la actividad, por ejemplo, 1,4 MBq o 2.1 MBq por 10 6 células.
    1. Para radiomarcar las células con 1,4 MBq por 10 6 células, usar 40! L de los 37 MBq / ml 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y 60 l para radiomarcar con 2,1 MBq por 10 6 células. Realice los pasos 4.3 a 4.7 con 0,7 MBq, 1,4 MBq y 2,1 MBq 64 Cu-PTSM pero aumentar el tiempo de etiquetado a 3 h para investigaciones comparativas 17.
    2. Continúe en el paso 5 para determinar la cantidad óptima de actividad.

5. Evaluación in vitro del efecto del radiomarcador en células cova-TH1

NOTA: La caracterización de las influencias del radiomarcador en las células TH1 se realiza mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano para determinar la viabilidad, IFN-gamma ELISA para la evaluación de la funcionalidad y V tinción PE-Anexina para la inducción de la apoptosis 16, 17. Determinación de la absorción intracelular y el flujo de salida de radioactividad también se describe a continuación. Como comparación, las células marcado con Cu-PTSM 64 cova-TH1 también se pueden utilizar.

  1. Efecto sobre la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano
    1. Ajustar por lo menos 18 x 10 6 células cova-TH1 radiomarcados con 0,7 MBq / 10 6 células, 1,4 MBq / 10 6 células y 2,1 MBq / 10 6 células, respectivamente, a una concentración de 2 x 10 6 células / ml y realizar los pasos 5.1. 2-5.1.7 para cada dosis actividad. El uso no radiactivamenteve KJ1-26-mAb marcado células cova-TH1 y células cova-TH1 no marcados como los controles.
    2. Pipetear 1 ml de la solución de células en 9 pocillos de una placa de 24 pocillos.
    3. Recoger el contenido de 3 pocillos en 3 separadas 15 ml de tornillo tubos con tapa, 3 h después de radiomarcaje inicial.
    4. Lavar los pocillos ahora vacías con medio de pre-calentado para reducir al mínimo la pérdida de células y añadir el medio a los respectivos 15 ml tornillo tubos con tapón de la etapa 5.1.3.
    5. Centrifugar los tubos de 15 ml a 400 xg durante 5 min y resuspender el sedimento celular resultante en 1 ml de medio de pre-calentado.
    6. Recuento de células viables y muertas en azul de tripano por separado para cada tubo de 15 ml y calcular el porcentaje de células viables.
    7. Repetir los pasos 5.1.3-5.1.6 24 y 48 h post 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcaje.
  2. Efectos sobre la funcionalidad determinaron por ELISA IFN-gamma
    NOTA: Para evaluar el efecto de la 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiomarcador en productio IFN-γn como un marcador de la funcionalidad, lleve a cabo un ELISA de IFN-γ de un proveedor comercial y se refieren a la referencia 17 para más detalles.
    1. Dispersar 10 5 células viables en 100 l de medio en una placa de 96 pocillos, 3 h después de 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomarcaje de las células cova-TH1 con 0,7 MBq, 1,4 MBq o 2,1 MBq. Utilice no radiactivos o 64 células no marcadas, etiquetadas-KJ1-26-mAb-etiquetados-PTSM Cu cova-TH1 como los controles.
    2. Estimular la producción de IFN-γ en 10 5 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 células cova-Th1 en 100 l de medio con 10 g / ml de péptido COVA, 5 U / ml de IL-2 y 5x10 5 APCs en 100 l de medio durante 24 h a 37 ° C y 7,5% de CO2. Otros controles pueden ser las otras condiciones sin la adición del péptido COVA.
    3. Analizar el sobrenadante por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Repita el paso 5.2.2. a 5.2.3. a las 24 y 48 h después del procedimiento de etiquetado.
  3. La inducción de la apoptosis determinada por V tinción PE-Anexina para citometría de flujo
    NOTA: Para evaluar la inducción de apoptosis por el radiomarcador 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utilizar un kit comercialmente disponible para citometría de flujo y se preparan muestras de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de la tinción con anexina V para fosfatidil serina exposición en la membrana celular .
    1. A las 3, 24 y 48 h post 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcado de las células cova-TH1, triplicados mancha con al menos 10 6 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 células cova-TH1 con el kit de Anexina V de acuerdo con las instrucciones del fabricante y analizar dentro de la hora siguiente. Usa, 64 células cova-TH1 no radiactivos marcados con KJ1-26-mAb-PTSM marcadas con Cu y no marcados como controles. Por favor refiérase a la referencia 17 para más detalles.
  4. Captación y el flujo de salida
    NOTA: La absorción de la 64 Cu-DOTAKJ1-26-mAb en las células se mide en un calibrador de dosis y el flujo de salida de la radiactividad se mide en un ensayo de γ-conteo de 0, 5, 24, y 48 h después de radiomarcaje.
    1. Preparar diez tubos γ-contando cada durante 64 células cova-TH1-etiquetados Cu DOTA KJ1-26 mAb-, el sobrenadante respectivo y el paso de lavado.
    2. Transferencia 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcado con células cova-TH1 en 1 ml de medio en cada uno de los diez tubos γ-conteo directamente después de marcar radiactivamente. Para cada uno de los puntos 5, 24 y 48 h después de radiomarcaje de tiempo, mantener al menos 10 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 7 64 células cova-Th1 en medio en placas de cultivo celular de 24 pocillos en un incubador a 37 ° C y 7,5% de CO2.
    3. Centrifugar los tubos de γ-conteo a 400 xg durante 5 min y transferir el sobrenadante a diez nuevos tubos de γ-recuento.
    4. Lavar las células una vez en 1 ml de medio para eliminar la fracción no unida de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb unad recoger el sobrenadante en diez nuevos tubos γ-recuento.
    5. Añadir 1 ml nuevo medio a las células cova-TH1 y determinar el valor de captación inicial en un calibrador de dosis. Los tubos también se pueden almacenar en una incubadora a 37 ° C y 7,5% de CO2.
    6. Repetir los pasos 5.4.2 a 5.4.5 después de 5, 24 y 48 h y medir todos los tubos en un γ-contador según el protocolo del fabricante. Para corregir por la desintegración radiactiva y para el análisis cuantitativo, utilizar un estándar con una dosis definida de la radiactividad.

Inducida por OVA 6. aguda de las vías respiratorias DTHR

NOTA: La dinámica de migración y patrones de homing de células radiomarcado cova-TH1 adoptivamente transferidas y en el sitio de la inflamación se visualizó y se cuantificó en un modelo animal para inducida por COVA vía aérea-DTHR 16, 17.

  1. Inyectar ratones de 8 semanas de edad BALB / c ip con una mezcla de 150 l aluminum gel / 50 l cova-solución (10 g en 50 l de PBS) para inmunizar los ratones.
  2. Dos semanas después de la inmunización, anestesiar a los ratones con 100 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina por inyección ip. Coloque los ratones experimentales sobre sus espaldas y lentamente pipetear 100 g COVA disuelto en 50 l de PBS en las fosas nasales de los animales. Los animales serán inhalar la solución gota a gota.
  3. Repita después de 24 h. Para las inducciones DTHR de las vías respiratorias más fuertes, repetir de nuevo después de 48 h.
  4. Para analizar la migración específica de las células cova-TH1 transferidos, inducir la vía aérea-DTHR con el pavo-o faisán-OVA como control. Por lo tanto, repita los pasos 6.1 a 6.3 mediante el uso de la respectiva OVA-proteína.

7. El uso de imágenes in vivo de PET / CT

NOTA: En imágenes in vivo de 64-etiquetados Cu DOTA KJ1-26-mAb-células cova-Th1 en cova-DTHR ratones enfermos y compañeros de camada de control demuestra la homing específico y el midinámica gración de las células cova-TH1. Por lo tanto, adquirir exploraciones PET estáticas y anatómica CT escanea secuencialmente 3, 24 y 48 h de la transferencia celular adoptiva poste.

  1. Directamente después de radiomarcaje, ajustar las 64 células cova-TH1-etiquetados Cu DOTA KJ1-26 mAb a 5 x 10 7 células / ml para inyección ip de 10 7 células en 200 l.
  2. Usando una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 30, dibujar 200 l de la suspensión celular cova-TH1 marcado con Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 y se inyectan las células IP en los animales cova-DTHR-enfermas entre el 4 y 5 de pezón. Para determinar la cantidad total inyectada de la radiactividad, medir la jeringa en un calibrador de dosis antes y después de la inyección.
  3. Anestesiar los ratones, 10 min antes del tiempo de absorción se desea, con 1,5% de isoflurano en oxígeno al 100% (velocidad de flujo: 0,7 L / min) en una caja de la anestesia con temperatura controlada.
  4. Mientras tanto, para facilitar la co-registrode imágenes PET y CT durante el análisis de imágenes, fijar los capilares de vidrio que contenían 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o solución libre 64 CuCl 2 debajo de la cama del ratón.
    1. Por lo tanto, preparar una solución de 0,37 MBq / ml y llenar capilares de vidrio con un volumen de 10 l con esta solución. Dado que las señales de radiactividad derivados de células son inherentemente débil, no utilice altas cantidades de actividad para asegurarse de que los marcadores no están interfiriendo con las señales derivadas de las células en ratones.
  5. Después de alcanzar la tolerancia quirúrgica, como se indica por la pérdida del reflejo de retirada pedal de la extremidad posterior, transferir el ratón para un pequeño animal cama compatible-CT PET-y equipado con un sistema de tubos adecuado para mantener la anestesia.
  6. Inmovilizar el ratón en la pequeña cama animal usando hisopos de algodón y cinta quirúrgica. Aplicar ungüento para los ojos para evitar la desecación de los ojos.
  7. La transferencia de la cama de ratón para el escáner PET, centrar el campo de visión con una focus en los pulmones y adquirir una exploración PET estática 20 minutos con una ventana de energía de 350-650 keV.
  8. La transferencia de la cama de ratón para el escáner CT. A través del explorador de vista, centrar el campo de visión de los pulmones. Adquirir una imagen planar CT a través de 360 ​​proyecciones durante una rotación de 360 ​​° en el modo de "paso y disparar" con un tiempo de exposición de 350 ms y binning factor de 4.

Análisis 8. Imagen

  1. Reconstruir PET de datos en modo de lista mediante la aplicación iterativa algoritmo estadístico ordenado a la maximización de la expectativa subconjunto (OSEM) 2D y tomografías computarizadas en una imagen 3D con un tamaño de píxel de 75 micras.
  2. Para la imagen co-registro en un software de análisis de imágenes apropiado (por ejemplo Inveon Investigación lugar de trabajo o Pmod), utilice la herramienta automática co-registro. Si esto no funciona, utilice los capilares de vidrio debajo de la cama ratón como guía para co-registrar las imágenes PET y CT reconstruidas espacialmente en la dirección axial, coronal y sagital.
  3. Corregir las imágenes PETpara la desintegración radiactiva usando la ley de la desintegración radiactiva y el tiempo medio del radionúclido 64 Cu a 12,7 h. Para la imagen de normalización, elegir una imagen (A) como una referencia y ajustar la intensidad de la visualización de imágenes en el software de análisis de imagen correspondiente.
    1. Utilizando los valores acaba de establecer la imagen de referencia (A) para, la actividad inyectada (A) y la actividad inyectada para las otras imágenes (X), normalizar las otras imágenes utilizando la siguiente ecuación: (actividad inyectada (X) / actividad inyectada ( A)) Los valores de x de intensidad (A).
  4. Dibujar volúmenes 3D de interés (VOI) en la señal de PET normalizada de la LNS pulmonares y peritímica.
  5. Determinar la dosis inyectada porcentaje por cm 3 (% ID / cm 3) usando la siguiente ecuación: (media de la actividad de la actividad VOI / total en el ratón) x 100. Para mayor orientación relativa a análisis de imágenes, ver referencias 22, 23.

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Resultados

La Figura 1 resume el etiquetado de las células cova-TH1 con el 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y el diseño experimental para la in vitro y en estudios in vivo cubiertos en este protocolo.

figure-results-1
Figura 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb proceso de etiquetado y Diseño Experimental. (A)

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Discusión

Este protocolo presenta un método fiable y fácil de marcar radiactivamente de forma estable células para el seguimiento in vivo mediante PET. Utilizando este método, las células cova-TH1, aislado y ampliado in vitro de ratones donantes, podría ser radiomarcados con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y su homing fue rastreado a la LNS pulmonares y peritímica como lugares de presentación COVA en una COVA inducida DTHR vías respiratorias aguda.

La modificación del mAb con el que...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la doctora Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant, así como Natalie Altmeyer por el apoyo durante los experimentos y análisis de datos. Este trabajo fue apoyado por el Werner Siemens-Fundación, la DFG a través de la SFB685 (B6 proyecto) y la fortuna (2309-0-0).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Alemania1.0031864Cu producción
Metanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Alemania1.0600764Cu producción
Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Alemania1.010464Cu producción
Pt/Ir (90/10) placaÖ gussaencargo> 64Cu
PEEKWKLFabricación por encargo64Cu producción
64NiChemotrade64Cu
Producción Polygram SIL G/UV 254 Macherey-Nagel80502164Cu
Intercambio iónico columnaBioRadAG1-X864Cu de producción
Sistema de destino de estado sólido para PETtraceWKLcostum made64Cu producción
64Cu módulo de trabajoWKLcostum fabricado64Cu
calibrador de dosisCapintecCRC-25R
PETtrace ciclotrónGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocíclicosB-280DOTA-conjugación
Anticuerpo anti-cOVA-TCR (KJ1-26)Aislado de cultivo de células de hibridomaconjugación DOTA2
HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-conjugación
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-conjugación
Amicon Ultra-15 unidad de filtroMerck MilliporeUFC910008DOTA-conjugación
Rotipuran Agua ultrapura RotipuranCarl RothHN68.3DOTA-conjugación
Acetato de amonioSigma-Aldrich32301DOTA-conjugación
PBSUniversidad de TuebingenConjugación DOTA
Micro Bio-spin P-6columna Bio-Rad Laboratories7326221conjugación DOTA
Citrato de sodioSigma-Aldrich71497DOTA-conjugación
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DMEM-conjugación DOTA,
Merck Millipore102568para el medio de células T 
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bingrediente para medio de células T  
Piruvato de sodioMerck MilliporeL0473ingrediente para medio de células T 
MEM-aminoácidosMerck MilliporeK0293ingrediente para medio de células T  
HEPES Merck MilliporeL 1613ingrediente para medio de células T  
  Penicilina / estreptomicinaMerck MilliporeA2212ingrediente para medio de células T  
0,05 mM 2-β-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148ingrediente para medio de células T 
DO11.10 ratonescría interna Cultivocelular TH1
DPBSGibco 14190144Cultivo celular TH1
Filtro de células 40 y micro; m Corning352340Cultivo celular TH1
Tampón de lisado ACKLonza10-548ECultivo celular TH1
CD4 MicroBeads, ratónMiltenyi Biotech130-097-145Cultivo celular TH1
Separador QuadroMACSMiltenyi Biotech130-090-976cultivo celular TH1
Miltenyi Biotech130-042-401Cultivo
Anticuerpo anti-CD4 (Gk1.5)Aislado de cultivo de células de hibridoma Cultivo decélulas TH1
anticuerpo anti-CD8 (5367.2)Aislado de cultivo de células de hibridoma Cultivo decélulas TH1
Anticuerpo anti-rata (MAR18.5)Aislado de cultivo de células de hibridoma Cultivo decélulas TH1
Complemento de conejo MAtebu-BioCL3221Cultivo celular TH1
Anti-IL-4 anticuerpo (11B11)Aislado de cultivo de células de hibridomaTH1 cultivo celular
cOVA 323-339-péptido EMC-micro-coleccionesPedido personalizadoCultivo celular TH1
CPG1668-oligonucleótidosEurofins MWG OperonPedido personalizadoCultivo celular TH1
IL-2Novartis65483-116-07Cultivo celular TH1
placas de 96 pocillosGreiner 655180Placas de cultivo celular TH1
de 24 pocillosGreiner 662160TH1
matraz de cultivo celularGreiner 660175Placas de cultivo celular TH1
de 48 pocillosGreiner 677 180etiquetado de células
Gammacell 1000Best Theratronicsvia consulta 
Gulmay RT225Gulmayvia consulta 
Azul tripánicoMerck MilliporeL6323in vitro evaluación
Ratón IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro evaluación
Annexin V Apoptosis Kit BD Biosciences559763in vitro
evaluación Tubo 5 mLSarstedt55.476in vitro
evaluación Tubos de fondo redondo BD Biosciences352008in vitro evaluación
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro evaluación
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro
evaluación MicroscopioLeicavia consulta  in vitro Evaluación
BD LSRII BD Biosciencesvia consulta in vitroEvaluación
Ratones BALB/cCharles River028in vivo tráfico celular
Gel de aluminioServa Electroforesis12261.01in vivo tráfico celular
XilacinaBayer HealthCareOrdenado vía Hospital universitarioin vivo tráfico de células
KetaminaRatiopharmPedido via Hospital Universitarioin vivo tráfico celular
IsofluranoCP-PharmaPedido vía Hospital Universitarioin vivo tráfico de células
Aguja de 30 GBD Biosciences304000in vivo tráfico de células
JeringaBD Biosciences11612491in vivo tráfico de células
Capilares 10 y micro; LVWR612-2439
Inveon Escáner PETSiemens Healthineersya no está disponiblein vivo tráfico de células, empresas alternativas: Bruker, Mediso 
Escáner Inveon SPECT/CTSiemens Healthineersya no está disponiblein vivo tráfico celular
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineersanálisis de imágenes, software alternativo: Pmod
Producción < por Cámara de ><, ingrediente Columna LS de celular TH1 PE

Referencias

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