lesiones hepáticas están acompañados por la expansión de células progenitoras que representa una población heterogénea de células. clasificación Novel de este compartimento celular permite la distinción de varios subconjuntos. El método descrito aquí ilustra el flujo de análisis de citometría de alto aislamiento y pureza de varios subconjuntos que se pueden utilizar para más ensayos.
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Artículo de método
El aislamiento y enriquecimiento de hígado progenitoras subconjuntos identificados por una combinación de marcadores de superficie Novel
En este artículo
Resumen
Resumen
Durante lesiones crónicas del hígado, las células progenitoras se expanden en un proceso denominado reacción ductular, que también implica la aparición de infiltrado celular inflamatorio y la activación de las células epiteliales. La población de células progenitoras durante tales reacciones inflamatorias principalmente se ha investigado el uso de marcadores de superficie individuales, ya sea por análisis histológico o por técnicas basadas en citometría de flujo. Sin embargo, nuevos marcadores de superficie identificaron varios subconjuntos funcionalmente distintos dentro de la progenitora de hígado compartimento celular / vástago. El método presentado aquí describe el aislamiento y flujo detallado análisis de citometría de subconjuntos progenitoras utilizando combinaciones de marcadores de superficie novedoso. Por otra parte, se demuestra cómo los diferentes subconjuntos de células progenitoras pueden aislarse con los métodos basados en la clasificación de alta pureza utilizando automatizado magnético y FACS. Es importante destacar que, novedosos y enzimática simplificada disociación del hígado permite el aislamiento de estas poblaciones de células raras con una alta viabilidadque es superior en comparación con otros métodos existentes. Esto es especialmente relevante para el estudio de más células progenitoras in vitro o para el aislamiento de ARN de alta calidad para analizar el perfil de expresión génica.
Introducción
La regeneración hepática se asocia sobre todo con la capacidad de auto-renovación de los hepatocitos. Sin embargo, las lesiones crónicas del hígado se producen con la activación de células progenitoras y de expansión, que se han asociado con su capacidad de diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Esto es especialmente relevante porque, durante las lesiones crónicas, la proliferación de hepatocitos no es eficaz. A pesar de múltiples estudios de rastreo genético dirigidas a células progenitoras, su papel en la regeneración d....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo con la aprobación de los comités de ética y cuidado de los animales de la Universidad de Homburg Medical Center.
1. Preparación de Materiales y búferes
- Recién preparar todos los tampones necesarios para la digestión del hígado utilizando componentes estériles y una campana laminar para evitar la contaminación bacteriana.
- Preparar el tampón de colección (CB) mediante la mezcla de 49,5 ml de medio RPMI y 0,5 ml de suero bovino fetal (FBS; baja endotoxina, inactivado por calor) para lograr una solución al 1% (v / v). Almacenar la solución en hielo hasta su uso po....
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Resultados
El procedimiento que aquí se presenta para la digestión del hígado usando una nueva mezcla de los resultados de las enzimas en una suspensión de una sola célula que contiene parénquima y células hepáticas no parenquimatosas (Figuras 1 y 2a). Después de la lisis ACK-de las células rojas de la sangre, el flujo directo análisis de citometría de la suspensión de célula única es posible (Figuras 1 y 2). La estrategia gating i.......
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Discusión
Inflamación del hígado y lesiones de diferentes orígenes desencadenan procesos regenerativos en el hígado que se acompañan de la expansión de células progenitoras y la activación 2, 3. Estas células progenitoras del hígado poseen características de las células madre y probablemente juegan un papel importante en el mecanismo patológico de varias enfermedades del hígado.
La heterogeneidad de las células progenitoras hepáticas tiempo se.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Premio Fundación Kovalevskaja Sofja Alexander von Humboldt para VLK.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| rojo fenol DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| colagenasa P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispasa | Life Technologies | ||
| ACK Tampón de lisado | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Azida de sodio | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare una solución madre al 1% |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Solución de enjuague | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | agregue 0.5% (v/v) de BSA y almacene en hielo |
| Libre de rojo fenol DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| conteo Conteo de perlas Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Reactivo de bloqueo | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Kit de Eliminación de Células Muertas | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Anti-Biotina MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 BioLegend Purificado | 139302 | Dilución: 1:100 | |
| CD16/32 Dilución purificada | de BioLegend | 101302 | : 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilución: 1:200, marca células hematopéyicas |
| CD31 Biotina | BioLegend | 102504 | Dilución: 1:200, marca células endoteliales |
| ASGPR1 | Bio-Techne | purificado AF2755-SP | Dilución: 1:100, marca hepatocitos |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilución: 1:1.400, marcas células progenitoras |
| Podoplanin | Biotin BioLegend 127404 | Dilución: 1:1.400 | |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | uso 3 µ L, marca las células progenitoras |
| CD133 Biotina BioLegend | 141206 | Dilución: 1:100 | |
| CD34 Biotina | eBioScience | 13-0341-81 | Dilución: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilución: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilución: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilución: 1:100 |
| Sca-1 Biotina | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | uso 10 µ L |
| Ratón IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rata IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rata IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rata IgG2a, κ Biotina | BioLegend | 400504 | |
| Rata IgG2a, κ Violeta Brillante 421 | BioLegend | 400535 | |
| Hámster Sirio IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Hámster Sirio IgG Biotina | BioLegend | 402004 | |
| Cabra Normal Control de IgG Bio-Techne Purificado | AB-108-C | ||
| Burro anti-Cabra IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilución: 1:800 |
| Estreptavidina Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilución: 1:400 |
| 100 y micro; m Malla filtrante | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Columna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Separador QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separador | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polipropileno Tubo de fondo redondo | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | El tampón de lisis RLT está incluido |
Referencias
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J ....
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Reimpresiones y permisos
