La producción de garrapatas sanos criados en el laboratorio es esencial para los estudios sobre la biología de la señal, y de la señal de patógenos interacciones. Aquí se demuestra un protocolo sencillo para la alimentación de la garrapata inmadura que es rentable y menos estresante para ratones.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
En este artículo
Resumen
Resumen
Ixodes scapularis , el vector de la enfermedad de Lyme, es uno de los más importantes vectores de enfermedades en el este y el medio oeste de los Estados Unidos. Esta especie es una garrapata de tres huéspedes que requiere una comida de sangre de un huésped vertebrado para cada etapa de desarrollo, y las hembras adultas requieren una comida de sangre para su reproducción. Las garrapatas larvales se unen a su huésped durante 3 - 5 días para la alimentación y dejar al huésped cuando están completamente hinchadas. Esta dependencia de varios huéspedes diferentes y el largo tiempo de fijación para el engorgamiento complica la elevación de las garrapatas en el laboratorio. Sin embargo, para entender la biología de la garrapata y las interacciones de la garrapata-patógeno, la producción de garrapatas sanas, criadas en laboratorio es esencial. Aquí, demostramos un sencillo, costo-efectiva protocolo para inmaduros tick alimentación en ratones. Se modificaron los protocolos existentes para disminuir el estrés en los ratones y el aumento del éxito de la alimentación de garrapatas y la supervivencia mediante el uso de jaulas desechables sin fondo de malla para evitar el contacto de garrapatas wiAgua contaminada con orina y heces de ratones.
Introducción
Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados de los vertebrados y se distribuyen en todo el mundo. En los Estados Unidos, al menos 11 especies de garrapatas son vectores de patógenos de importancia para la salud pública 1. Ixodes scapularis es responsable de la transmisión de varios patógenos tales como los agentes causantes de la enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi) fiebre recurrente (B. miyamotoi), anaplasmosis granulocítica humana (Anaplasma phagocytophilum), y babesiosis (Babesia spp.). A pesar de la importancia de I. scapularis como vector de la enfermedad, la recogida de estos arácnidos en abundancia en la naturaleza para los estudios en el laboratorio no siempre es factible. Por lo tanto, la producción de garrapatas sanos criados en el laboratorio es esencial para los estudios sobre la biología de la señal, y de la señal de patógenos interacciones.
El ciclo vital de todas las garrapatas duras (Ixodidae) de la familia, incluyendo I. scapularis, consiste en el huevo y tres activetapas e: larva, ninfa y adulto. Cada etapa activa se alimenta de un huésped vertebrado. Las complejas interacciones que tienen lugar entre las garrapatas y sus anfitriones lo largo de varios días de fijación y la alimentación son casi imposibles de replicar usando alimentadores artificiales, y es improbable que proporcionar suficientes números de Fed garrapatas para la cría masiva de 2, 3, 4. Por lo tanto, los ratones y conejos vivos son los más usados como anfitriones para la crianza de inmaduros (larvas y ninfas), y etapas maduras (adultos) de las garrapatas, respectivamente. El requisito de múltiples hosts para la alimentación de sangre durante cada etapa de desarrollo complica la cría de garrapata, y es el tiempo y el coste intensivo de 5, 6, 7. La mayoría de los protocolos de garrapatas cría requieren mantenimiento de los ratones en una jaula de alambre suelo de rejilla suspendido 7, 8 o en una ca cilíndricaGe de tales dimensiones que el animal no puede moverse libremente y prepararse 6 , 9 , 10 .
Estas jaulas cilíndricas se transfieren posteriormente a una jaula de caja de zapatos con una rejilla de alambre. Las garrapatas engorged, separadas se recogen entonces del agua debajo. Sin embargo, este método resulta en la exposición de las garrapatas alimentadas a agua contaminada con orina y heces que pueden aumentar el crecimiento de hongos y la mortalidad de garrapatas 9 . Además, aumenta la posibilidad de escape de garrapata de la depresión de agua, así como causar estrés a los ratones. Para eludir estos problemas, aquí se demuestra la alimentación de garrapatas de larvas en ratones dentro de jaulas desechables de tipo caja de zapatos de plástico. Este método permite el comportamiento normal de los ratones, aumenta la recuperación de garrapatas engorged, y disminuye la mortalidad de garrapatas debido a la contaminación.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El protocolo (Número-00682) se describe a continuación es aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Nevada, Reno y sigue las directrices de la Universidad de Nevada, animal comité de ética de investigación de Reno. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se utilizó un cono de la nariz para mantener los niveles de isoflurano continuas durante 20 min. Un ungüento veterinario se utilizó para evitar el secado de los ojos bajo anestesia. pellizco del dedo del pie se utilizó para determinar el nivel de anestesia y la frecuencia respiratoria se midió durante todo el procedimiento. Los ratones se mantuvieron en jaulas individuales y supervisados hasta que se recuperó la conciencia. Los ratones se usaron sólo una vez para marcar la alimentación y se sacrificaron recuperación posterior garrapata. La eutanasia se llevó a cabo por el Laboratorio de personal del personal de medicamentos para animales. CO 2 y dislocación cervical se utilizaron para la eutanasia de los animales.
NOTA: Trabajar sobre las garrapatas requiere el uso de la ecuación de protección personal completaUipment. Para contar las garrapatas inmaduras, use batas de laboratorio blancas, guantes largos de nitrilo para cubrir la abertura de la manga de la bata de laboratorio tapada con gomas y zapatos cerrados. Para infestar ratones con garrapatas, utilice una red de pelo, trajes desechables, guantes de manga larga sobre las mangas y cubiertas de los pies. Use batas blancas o de colores claros para detectar garrapatas rebeldes. Revise periódicamente los guantes y las mangas de las garrapatas.
1. Sala de Preparación para la Vivienda de Animales
- Designe una sala separada para alojar ratones infestados con garrapatas. Coloque una alfombra pegajosa o cinta adhesiva de dos caras en el exterior y en el interior de la puerta para evitar el escape accidental de garrapatas.
2. Cuenta de las garrapatas para la infestación de ratón
- Coloque cinta adhesiva de doble cara alrededor de los bordes superiores de un recipiente de plástico de 7 "x 5" x 14 "y rellene con agua hasta aproximadamente 2 cm.
- Coloque otra pequeña caja o placa de Petri en el centro del recipiente y rellene con agua hasta 1 cm,# 34; foso" alrededor de este envase
- Almacenar el vial que contiene larvas o ninfas dentro de la placa de Petri.
- Utilice un pincel fino para eliminar las larvas o ninfas del vial y contar con el microscopio. Contar 50 larvas o ninfas 25 en viales de centelleo separados. Cubrir los viales inmediatamente con malla de nylon o pantalla de tela organdí y cerrar con bandas de goma.
3. Los ratones que infestan con garrapatas inmaduras
- Utilizar un banco de trabajo de color blanco o claro y se adhieren cinta de doble cara en todo el perímetro de la zona de trabajo.
- Anestesiar al ratón con isoflurano. Comprobar el nivel de anestesia mediante la pizca dedo del pie. Una vez anestesiados, transferir el ratón para una resistencia de calentamiento cubierto con toallas de papel y adjuntar a un cono de la nariz para el suministro continuo de isoflurano.
- Aplicar petróleo ungüento para los ojos a base de jalea para evitar la sequedad. Tenga en cuenta el patrón de respiración del ratón para ajustar los niveles de isoflurano (80 -. 230 respiraciones por min es normal, Reducir el nivel de isoflurano si brtasa eathing es de menos de 80 respiraciones por min para evitar la muerte del animal).
- Tomar un vial de 50 larvas o ninfas 25 y el lugar garrapatas bajo la piel en la cabeza entre las orejas con un cepillo de pintura (Figura 1). Mantenga ratón bajo anestesia durante 20 min después de la colocación para dar tiempo suficiente para que las garrapatas adjuntar.
- Mueve el ratón para un plástico caja de zapatos en forma de jaula de ratón estándar desechable con tapas estáticas y ropa de cama blanco. Proporcionar juguetes, agua y alimento ad libitum de acuerdo con el cuidado normal de ratón.
- Almacenar la jaula del ratón dentro de una jaula de rata o jerbo grande forrado con cinta de doble cara adhesiva alrededor de los bordes superiores. Llene la jaula externa con 3 cm de agua (Figura 2).
4. Recogida de las garrapatas de ratones
- garrapatas inmaduras se separan entre los días 3 y 6 de la alimentación. Compruebe las jaulas y un foso de agua de garrapatas saciadas todos los días después del día 3.
- Recoger las garrapatas desprendidas de la jaula entre los días 4 y 6. Uso de un dolorT pincel o fórceps suave para recoger las garrapatas congestionadas y almacenar en viales de centelleo limpios cubiertos con tela de malla de nylon asegurada con bandas de goma.
- Anestesiar y comprobar el ratón en el día 7 para cualquier resto de garrapatas adjunta.
- Compruebe la ropa de cama, el comedero y la botella de agua para las garrapatas congestionadas el día 7. Eutanee los ratones siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Autoclave las jaulas desechables, la ropa de cama, la botella de agua, y el comedero de la comida para evitar cualquier garrapatas sin escape.
5. Almacenamiento de garrapatas Fed
- Mantener las garrapatas con congestión a 90% de humedad, 20 ° C y un ciclo de 12:12 luz: oscuridad en una incubadora de humedad y temperatura controlada hasta que ocurre la muda. Esto puede tomar aproximadamente 12 a 18 semanas para ocurrir.
- Mientras que la alta humedad promueve la supervivencia de la garrapata, también hace que las garrapatas sean propensas al crecimiento excesivo de hongos. Compruebe las garrapatas alimentadas bajo el microscopio al menos una vez a la semana para el moho. Si se detecta, lave a los supervivientes en etanol al 70% durante 5min., enjuague en agua, la transferencia a un papel de filtro para secar, y transferir a las nuevas, viales limpios.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Hemos modificado los protocolos de cría de garrapatas existentes 6, 10 para mejorar la eficiencia de la alimentación y la reducción del estrés en el host del ratón. Los resultados demuestran que las jaulas de ratón estándar estilo caja de zapatos son muy adecuados para la cría de garrapata. La ropa de cama blanca proporciona un buen contraste para facilitar la recogida de las garrapatas alimentadas. La mayoría de las garrapatas s...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Es importante tener varios niveles de medidas de seguridad cuando la crianza de garrapatas para evitar el escape accidental. El uso de cinta adhesiva y un foso de agua son fundamentales para garantizar la seguridad. Es importante mantener el ratón anestesiado en una almohadilla de calefacción para mantener constante la temperatura del cuerpo. También se encontró que afeitarse el ratón no proporciona ningún beneficio adicional para la fijación de la garrap...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen la ayuda del personal de Medicina de Animales de Laboratorio de la Universidad de Nevada, Reno. MM recibió fondos de Nevada INBRE.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pomada veterinaria Puralube | Amazon | Disponible en cualquier tienda de mascotas o tienda en línea | |
| Jaula de ratón desechable | Innovador, San Diego, CA | MV 2 | Juego de fondo y tapa |
| Ropa de cama Alpha dri blanca | Suministros de laboratorio, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri&comercio; |
Referencias
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
