Artículo de método

Evaluar el efecto de sustancias químicas ambientales en la miel de abeja Desarrollo de la colonia individual a nivel

DOI:

10.3791/55296

⸱

1 de abril de 2017

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

En este artículo

Resumen

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El presente artículo presenta un método para alimentar pesticida alimentos contaminados tanto a una abeja de la miel individual y una colonia de colmena. El procedimiento se evalúa el efecto de pesticidas en las abejas individuales por la alimentación in vivo de la dieta básica de larvas y también en la condición natural de la colonia de colmena.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La presencia de pesticidas en el entorno apícola es uno de los problemas más graves que afecta la vida de una abeja melífera. Los pesticidas se pueden llevar de vuelta a la colmena después de que las abejas se hayan alimentado de flores que han sido rociadas con pesticidas. Los alimentos contaminados con plaguicidas pueden intercambiarse entre los trabajadores, que luego alimentan a las larvas y, por lo tanto, pueden afectar potencialmente el desarrollo de las abejas melíferas. Por lo tanto, los pesticidas residuales en el medio ambiente pueden convertirse en un factor dañino crónico para las poblaciones de abejas melíferas y conducir gradualmente al colapso de las colonias. En el protocolo presentado, se describen y aplican los métodos de alimentación de las abejas melíferas a una abeja melífera individual o a una colonia. Aquí, el regulador del crecimiento de insectos (IGR) piriproxifeno (PPN), que se usa ampliamente para controlar insectos plaga y es dañino para el desarrollo de larvas y pupas de abejas melíferas, se usa como pesticida. El procedimiento de presentación se puede aplicar a otros productos químicos potencialmente dañinos o patógenos de abejas melíferas para estudios posteriores.

Introducción

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La presencia de pesticidas en el medio ambiente es uno de los problemas más graves que afecta a la vida de una abeja de la miel 1, 2, 3. Varios estudios han demostrado la presencia común de residuos de plaguicidas en las colonias de abejas de miel y productos de abeja. En Taiwán, el medio de aplicación de pesticidas era 11-12 kg / ha cada año (de 2005 a 2013). La cantidad de plaguicidas utilizados en Taiwán es superior a la de los países de la UE, y los países de América Latina 4, 5. En otras palabras, el medio ambiente apícola sufre estrés pesticidas grave, especialmente en Taiwán y posiblemente en otros países.

La abeja de la miel Apis mellifera es uno de los principales polinizadores en los sistemas agrícolas 6 y que también produce productos valiosos tales como la miel. Sin embargo, las abejas de miel son exposicionesed a diversos pesticidas y estos pesticidas puede ser llevado de vuelta a colmenas después de forrajeo en las flores que han sido rociados con pesticidas cuando la recolección de néctar y el polen 7, 8. También pueden estar expuestos a los pesticidas por los propios apicultores con el objetivo de controlar los problemas de plagas dentro de las colmenas 9, 10, 11. Debido a que las larvas de abejas se alimentan por las abejas nodrizas para su desarrollo, las larvas de zánganos, e incluso la reina puede estar expuesto a estos néctares y polen 12 contaminadas con pesticidas. La toxicidad de diversos plaguicidas para las abejas de miel debe abordarse 13.

Se han hecho muchos esfuerzos para evaluar los problemas de residuos de plaguicidas ambientales. Yang et al. puesto a prueba la influencia del insecticida imidacloprid neurotóxico en el desarrollo de las larvas de abeja de la miel en elcolmena y informó que una dosis sub-letal de imidacloprid resultó en el comportamiento asociativo olfativo de las abejas adultas 14. También, Urlacher et al. examinado los efectos subletales de un pesticida organofosforado clorpirifos, el rendimiento de aprendizaje de un trabajador abeja de la miel en condiciones de laboratorio 15. En nuestro estudio anterior, se evaluó el impacto de un regulador del crecimiento de insectos (IGR), piriproxifeno (PPN), sobre larvas de las abejas de miel 16.

En este trabajo, presentamos los métodos para evaluar los impactos químicos en el desarrollo de las abejas de miel. Miel métodos de alimentación de abejas se describieron y aplicarse a las abejas de la miel individuales o a una colonia. En un primer momento, hemos probado diferentes concentraciones de la dieta básica de larvas contaminado con pesticidas (DAC) sobre las larvas en las colonias para evaluar el impacto de los pesticidas en las abejas individuales en vivo. a continuación, se procedió a simular el Condit naturalesiones del pesticida mediante el uso de jarabe contaminado con pesticidas dentro de colmenas. En este método, PPN, que se utiliza ampliamente contra plagas de insectos 17 y es perjudicial para el desarrollo de las larvas de abeja de la miel y pupas 16, 18, 19, será un indicador para representar el efecto negativo del pesticida en el campo.

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Protocolo

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1. Preparativos

  1. Hacer 1 litro de jarabe de azúcar al 50%. Disolver 1 kg de sacarosa en 1 L ddH 2 O.
  2. Preparar la solución de piriproxifeno (PPN) en BLD. Hacer 1,1 L de 10000 ppm solución PPN de stock y diluir 100 ml de solución de PPN en 1 L esterilizado ddH 2 O. Almacenar a 4 ° C.
  3. Diluir la solución madre PPN a concentraciones finales de 0,1, 1, 10 y 100 mg / kg (ppm) en el BLD para el siguiente experimento.
  4. Hacer PPN-jarabe (para el nivel de colonia). Diluir el Stock PPN a concentraciones finales de 10 y 100 ppm en jarabe de azúcar 50% para el siguiente experimento.
  5. La miel de abeja crianza.
    Nota: En este caso, la ubicación del apiario experimental es la Universidad Nacional Ilan (NIU), Yi-Lan Ciudad, Taiwán; (Coordenadas GPS: N24.747278, E121.746200).
    1. Compruebe la miel de abejas (Apis mellifera L.) colonias semanal para la cantidad de alimentos y piensos con 1 litro de jarabe de azúcar al 50% si es necesario (el área de almacenamiento de la miel está vacía). Definir una sanacolonia 9 cuadros de panales de abejas en cada colonia con una reina pone los huevos normalmente.
  6. Preparar 100 ml de dieta larval básico (BLD). Disolver 6% D-glucosa, 6% de fructosa y 1% de extracto de levadura en agua desionizada destilada esterilizada (ddH 2 O) y suplementar con jalea real 50%. Almacenar a 4 ° C, pero no durante más de 3 días.
    Nota: Pre-caliente a 35 ° C antes del experimento y el uso dentro de los 3 días.

2. En Vivo método de alimentación

Nota: In vivo método de alimentación ha sido modificado a partir de Hanley et al. 20

  1. La miel de abejas selección larvas y etiquetado.
    1. Insertar un excluidor de reinas para dividir 9 fotogramas de una colonia sana en 4 y 5 marcos de cuadros al tiempo que limita la reina a la sección 4 del marco. Dejar al menos un marco vacío en la sección 4 del marco de la puesta de huevos.
    2. Después de la reina pone los huevos por 1 días, Comprobar los marcos para la aparición de los huevos y mantener los huevos en el interior de las colmenas durante 72 h (el 4º día) hasta el 1 día de edad eclosión de las larvas. Tome uno de los marcos que contienen larvas trabajador de 1 día de edad (sombreada dentro de las 24 h) salir de la colmena de prueba a mano y quitar los trabajadores de abejas desde el marco con un cepillo de abeja.
    3. Cubrir el marco con un portaobjetos transparente (Tamaño = Longitud x Ancho x grosor = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) y clavar la corredera transparente en el borde de marcos con chinchetas (Figura 1A).
    4. Para cada tratamiento, seleccionar al azar 50 uno larvas-días de edad (el 4º día) y marcar cada celda de cría mediante el uso de rotuladores permanentes en la diapositiva transparente (Figuras 1A y 1B).
      Nota: escribir la información de cada tratamiento en el marco y de diapositivas transparentes, así mediante el uso de rotuladores permanentes para evitar la confusión entre diferentes tratamientos. Retire las diapositivas marcadas y guardar para la in vivo </ Em> la alimentación y la observación.
  2. En la alimentación vivo.
    1. Añadir diferentes concentraciones de PPN-BLD (0,1, 1, 10 y 100 ppm) a cada celda de cría etiquetado por pipeteo en el día 1, 2 y 3 con 10! L, 10 l y 20 l, respectivamente, de acuerdo a la cantidad de admisión de la edad larvas. Añadir la misma cantidad de DAC (sin PPN) a un grupo de control. De este modo, la dosis total de PPN-BLD en cada celda de cría marcado se acumula a 4, 40, 400 y 4.000 pg.
      NOTA: Reconocer las celdas de cría etiquetados por las diapositivas transparentes marcados y retire las diapositivas transparentes marcados después de la alimentación. Utilice fresca DAC para la alimentación para evitar la limpieza de las celdas de cría de las abejas obreras.
    2. Devolver los marcos tratados con PPN a las colonias originales para nuevas observaciones.
      NOTA: Cada tratamiento tiene cuatro repeticiones biológicos en cuatro colonias.
  3. La observación de las larvas tratadas en el día 7.
    1. Para observar ºlarvas e PPN-tratada, devolver las diapositivas transparentes etiquetados a los marcos para registrar la mortalidad y tasas máximas en las celdas de cría etiquetados.
  4. Observación de las tasas de eclosión de pupas y tratados en el día 13.
    1. Eliminar la cera de abeja de celdas de cría tapados.
    2. Poner las pinzas de punta blanda en la celda de cría y sujetar el pupas muy ligeramente luego tomar pupas a cabo suavemente.
    3. Transferir el pupas en placas de cultivo tisular de 24 pocillos con una doble capa de los tejidos de laboratorio debajo de cada pocillo. Grabar el daño y la mortalidad durante la transferencia de pupa.
    4. Mantener las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en un incubador a 34 ° C y 70% de humedad relativa hasta que emerja la (ca. 8 días).
    5. Observar y registrar las pupas y abejas surgido.
  5. Estadística
    1. Calcular los datos registrados y presente como una media ± SD
    2. Analizar los datos mediante análisis de varianza (ANOVA) por SAS y el uso de la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) para analizar las diferencias entre dos medios de diferentes tratamientos. Definir estadísticamente significativa como valor P <0,05. Letras diferentes en la misma columna de la tabla mostraron un efecto significativo en el análisis estadístico.

3. Toxicidad de PPN en la colonia de nivel en la colmena

  1. Establecimiento de los grupos de abejas.
    1. Insertar un excluidor de reinas verticalmente para dividir 9 fotogramas de una colonia sana en 4 tramas (parte A) y 5 cuadros (Parte B), mientras que limitan la reina a la sección 4 del marco. Dejar al menos un marco vacío en la sección 4-marco para la puesta de huevos.
      Nota: Dicho de otra reina excluidores de la en la parte superior de la pieza reina para evitar que la reina se mueva entre las partes.
    2. Después de la reina pone los huevos durante 1 día, comprobar los marcos para la aparición de huevos. Tome los marcos adecuados que contienen los huevos fuera de la parte A con la mano y retire los trabajadores de abejasdesde el marco con un cepillo de abeja.
    3. Cubrir el marco con la diapositiva transparente y clavar el portaobjetos transparente para el borde del marco con chinchetas.
    4. Seleccionar aleatoriamente 100 celdas de cría que contienen huevos y marcar cada celda de cría mediante el uso de marcador permanente en la diapositiva transparente. Asignar estos 100 celdas de cría como el Grupo 1. escribir la información de cada tratamiento en el marco y de deslizamiento transparente usando marcador permanente para evitar la confusión entre los diferentes tratamientos.
    5. Devolver el fotograma con la etiqueta a la parte A durante 3 días y luego transferir la reina a la parte B para poner sus huevos.
    6. Después de 1 día, comprobar las tramas de la parte B, elegir un marco apropiado y etiqueta 100 celdas de cría que contengan huevos como se describe en el paso 3.1.4. Asignar estos 100 celdas de cría como Grupo 2.
    7. Devolver el fotograma con la etiqueta a la parte B durante 3 días y luego transferir la reina a la parte A para poner sus huevos.
    8. Repetir el intercambio reina entre la Parte A y la Parte B 6 veces más y asignar grupos numéricamente,respectivamente (Figura 2). No debe haber total de 9 grupos.
  2. T miel reat colonia de abejas con jarabe de azúcar PPN en el día 13 (Figura 2).
    1. Añadir 1 L 50% de jarabe de azúcar PPN que contiene 10 o 100 ppm en una caja de alimentación de abeja de plástico (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) y poner la caja en la parte superior de los marcos de las colonias experimentales.
      Nota: El grupo 1 no recibe la PPN a los 13 días ya se han sellado las celdas de cría.
    2. Alimentar el grupo de control con 1 L de 50% de azúcar jarabe (sin PPN) como se describe en el paso 2.2.
  3. Contar las larvas de 1 día de edad, y el registro como la tasa de eclosión de huevos de 100 celdas de cría etiquetados para cada grupo en el día 5 (Figura 2). Miel de abejas huevos suelen tardar 3 días en eclosionar en 0 días larvas; por lo tanto, comprobar y etiquetar 100 huevos que contienen celdas de cría en el día 1 y contar el número de larvas de 1 día de edad para cada grupo en el día 5 para obtener el porcentaje de tasa de eclosión.
  4. doONTAJE las celdas de cría tapó y se registro como la tasa límite larval de 100 celdas de cría etiquetados para cada grupo en el día 11 (Figura 2). 6 a 7 celdas de cría de larvas de un día tendrán un tope con cera de abeja por los trabajadores de abejas melíferas para convertirse en pupas larvas.
  5. Observe maduración pupas y registrar la tasa de eclosión de 100 celdas de cría etiquetados para cada grupo en el día 17 (Figura 2).
    1. Eliminar la cera de abeja de celdas de cría tapados y tomar pupas con unas pinzas de punta blanda suavemente. Transferir el pupas en unas placas de cultivo tisular de 24 pocillos con una doble capa de los tejidos de laboratorio debajo de cada pocillo.
    2. Mantener las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en un incubador a 34 ° C y 70% de humedad relativa hasta que emerja.
    3. Observar y registrar las pupas y surgió abejas de la miel para cada grupo hasta el Grupo 9 (49 días experimentales).
      Nota: Cada tratamiento tiene cuatro repeticiones biológicos.
  6. Estadística
    1. Calcula los datos registrados y presente como la mediaSD ±.
    2. Analizar las diferencias significativas entre pares de tratamientos (por ejemplo, 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm y 0 ppm / 100 ppm) en cada grupo mediante el uso de la prueba t de dos colas de Student. Definir como estadísticamente significativo si valor P <0,05.

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Resultados

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Para la prueba de campo de abeja de la miel, una reina se limitó a la sección 4-marco para la puesta de huevos. Este paso podría aumentar la densidad de cría en un marco y facilitar observaciones subsiguientes. Cada tratamiento fue etiquetado, y el desarrollo de las abejas de la miel se observa claramente a través de una diapositiva transparente. En la alimentación in vivo de PPN-BLD para las larvas de abeja de la miel en la colmena se realizó para evaluar con precisión...

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Discusión

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El método de puesta de huevos de la reina-limitado y el método de intercambio de reina son pasos críticos para la creación de grupos de abejas para las pruebas de campo dentro de este protocolo. El método de puesta de huevos doble limitado permite la sincronización del ciclo de vida de las abejas de miel. En consecuencia, los investigadores pueden seleccionar las larvas de 1 día de edad de la misma edad para el tratamiento con diferentes dosis de pesticidas. Para el método de intercambio de reina, la reina se intercambi...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue apoyada por Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 de la Oficina de Salud de Animales y Plantas de Inspección y Cuarentena, el Consejo de Agricultura, Yuan Ejecutivo y Grant 103 a 2313-B-197-002-MY3 del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Caja de abejas melíferasSAN-YI Honey FactoryW1266Abejas melíferas criando
Reina excluidor (entre marcos)SAN-YI Honey FactoryI1575Limitación de reina 
Excluidor de reina (en la parte superior)SAN-YI Honey FactoryI1566Limitación de reina en la parte superior 
Cepillo de abejasSAN-YI Honey Factory, TaiwánW1414limpie las abejas en el marco suavemente
Comedero de abejasSAN-YI Honey Factory, TaiwánP0219alimente con jarabe de azúcar a la colonia
Diapositiva transparenteWan-Shih-Chei, Taiwán (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)1139Marque el área larvaria en los marcos (Material: Tereftalato de polietileno, PET) (Tamaño = Largo * Ancho * grueso = 29,7 mm * 21 mm * 0,1 mm)
Placa de cultivo de tissu de 24 pozosGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., LtdTCP011024Cría de pupas de extracción
Autoclave Tomin equipo médico., LTD.TM-321 Fabricación deagua destilada desionizada esterilizada (ddH2O)
P20 pipetmanGilsonF123600Agregue PPN en la incubadora de alimento para larvas de
abejas Yihder Co., Ltd.LE-550RDCría de pupas de extracción
KimwipesCOW LUNG INSTRUMENT CO., LTD KCS34155Cría de pupas de extracción
Jalea realUniversidad Nacional de Ilan (NIU)NIUHacer dieta básica para larvas (BLD)
D-(+)-GlucosaSigmaG8270Hacer dieta básica para larvas (BLD)
D-(-)-FructosaSigmaF0127Hacer dieta básica para larvas ( BLD)
Extracto de levaduraCONDA, pronadisa1702Hacer dieta básica para larvas (BLD)
Sacarosa Taiwan coporación de azúcarE01071010Hacer jarabe de azúcar para alimentos para
abejas Piriproxifeno (11%)LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD.Nº de registro: 1937Regulador de crecimiento de insectos (IGR) utilizado en el experimento

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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