Este artículo presenta una serie de protocolos para el desarrollo de células modificadas y las superficies funcionalizadas que permiten sintéticamente por ingeniería genética de E. coli para controlar y manipular las superficies de materiales programables.
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Artículo de método
El uso de la biología sintética para Ingeniero células vivas que interactúan con materiales programables
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En este artículo
Resumen
Resumen
Hemos desarrollado una interfaz abiótico-bióticos que permite a las células por ingeniería genética para el control de las propiedades materiales de una superficie funcionalizada. Este sistema se hace mediante la creación de dos módulos: una cepa sintéticamente ingeniería de células de E. coli y una interfaz de material funcionalizado. Dentro de este manuscrito detallamos un protocolo para la ingeniería genética de los comportamientos seleccionados dentro de una cepa de E. coli usando las estrategias de clonación molecular. Una vez desarrollado, esta cepa produce niveles elevados de biotina cuando se expone a un inductor químico. Adicionalmente, detalle protocolos para la creación de dos superficies funcionalizadas diferentes, cada uno de los cuales es capaz de responder a la biotina sintetizada por células. Tomados en conjunto, se presenta una metodología para la creación de un sistema enlazado, abiótico-bióticos que permite que las células para controlar la composición del material y montaje en sustratos inertes ingeniería.
Introducción
Aquí, se presenta los procedimientos para desarrollar un sustrato programable capaz de responder a una señal química a partir de una línea celular diseñada. 1 Hacemos esto mediante la creación de una interfaz de biotina-estreptavidina que responde a la biotina producida por las células sintéticamente ingeniería Escherichia coli (E. coli). Anteriormente, las superficies programables han sido diseñados para una amplia gama de aplicaciones, desde la detección de la toxina 2 y en el punto de atención de diagnóstico 3 con la defensa y la seguridad. 4 Mientras superfici....
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Protocolo
1. Medios y Cultura Preparación
- Preparar el caldo de medios lysogeny (LB) mezclando 25 g de polvo stock LB con 1 litro de agua desionizada (DI) y el tratamiento en autoclave de la solución a 121 ° C durante 20 minutos para esterilizar.
- Para preparar placas de LB, añadir 15 g de agar (1,5%) a los medios LB antes de la esterilización
- Preparar soluciones madre de 1,000x carbenicilina (Cb) en agua DI (50 mg / ml).
- Si la preparación de medio LB que incluye un antibiótico para la selección de transformantes resistentes, espere hasta que la temperatura del medio LB esterilizada está por debajo de 60 ° C y, a continuac....
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Resultados
Los resultados representativos se presentan en las cinco figuras adjuntas. En primer lugar, se presenta el proceso de clonación gráficamente (Figura 1) para que el lector pueda seguir visualmente los pasos críticos para la creación de la cepa de E. coli sintéticamente ingeniería. Con el fin de caracterizar la dinámica poblacional de las células, proporcionamos una curva de crecimiento (Figura 2) generado por la medición de la densidad óptica a 6.......
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Discusión
Hemos presentado una nueva estrategia para interconectar células modificadas que viven con una superficie de material funcionalizado. Esto se logró mediante el desarrollo de una línea celular capaz de sintetizar niveles elevados de biotina cuando se induce con IPTG. Los niveles elevados de biotina pueden entonces ser utilizados para modificar la superficie funcionalizada. Los protocolos detallados de cómo la ingeniería de la línea de células de E. coli y cómo crear dos superficies funcionalizadas diferentes.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo de la adjudicación FA9550-13-1-0108 de la Fuerza Aérea Oficina de Investigación Científica de los EE.UU.. Los autores reconocen, además, el apoyo de la adjudicación N00014-15-1-2502 de la Oficina de Investigación Naval de los EE.UU., la financiación del Instituto de Tecnología crítico y Ciencias Aplicadas en el Instituto Politécnico de Virginia y la Universidad del Estado, y de la Fundación Nacional de Ciencia de Graduados de Investigación Programa de Becas, adjudicación número 1.607.310.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo LB, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, sales minimimales, 5x | Ácidos Casamino Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Fisher Scientific | BP1424-100 | ||
| Sulfato de magnesio, anhidro | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Cloruro de calcio, dihidrato | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrosa (D-glucosa), anhidro | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984L | |
| Oligonucleótido Imprimaciones | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N síntesis, purificación DSL |
| Q5 Polimerasa de alta fidelidad | New England Biolabs | M0491S | |
| Tampón de reacción Q5 | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Mezcla de soluciones | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarosa | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Etidio Bromuro, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Kits de extracción de gel | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | England Biolabs | M0202S | |
| T4 T4 T4 Tampón de reacción de ligasa | England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidilmetil) Ciclohexano-1-Carboxilato (SMCC) | Thermo Fisher | Scientific S1534 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Propionato de succinimidilo 3-(2-piridilditio) (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotina | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Peroxidasa de rábano picante (HRP) | Solución | 31490 | |
| solución 10x | Fisher Scientific | ||
| estreptavidina (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ácido etilendiaminotetaacético (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Peróxido | de hidrógeno Fisher Scientific T164-500 | |
| Fisher Scientific | H325-4 | ||
| 3, 3', 5, 5'-tetrametilbencidadina (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Concentradores centrífugos Vivaspin 500 | Viva Products | VS0192 | |
| Acetato de sodio, anhidro | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Placas de poliestireno de 96 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
Referencias
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.<....
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Reimpresiones y permisos
