Este documento describe la identificación de proteínas de unión de hielo a partir de plantas tolerantes a la congelación a través de la evaluación de la actividad de inhibición de hielo-recristalización y posterior aislamiento de IBP nativas utilizando purificación hielo-afinidad.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Identificación de proteínas vegetales de hielo de unión a través de la evaluación de la inhibición de hielo-recristalización y Aislamiento Uso de purificación de hielo-afinidad
En este artículo
Resumen
Resumen
proteínas de unión de hielo-(IBP) pertenecen a una familia de proteínas inducidas por estrés que se sintetizan por ciertos organismos expuestos a temperaturas bajo cero. En las plantas, daños por congelación se produce cuando crecen los cristales de hielo extracelular, dando como resultado la ruptura de las membranas de plasma y posible muerte celular. Adsorción de IBP a cristales de hielo restringe aún más el crecimiento mediante un proceso conocido como inhibición de hielo-recristalización (IRI), reduciendo así el daño celular. IBP también demuestran la capacidad de deprimir el punto de una solución por debajo del punto de fusión de equilibrio, una propiedad conocida como histéresis térmica actividad (TH) de congelación. Estas propiedades de protección han elevado interés en la identificación de nuevos IBP debido a su uso potencial en aplicaciones industriales, médicas y agrícolas. Este artículo describe la identificación de la planta de IBP a través de 1) la inducción y la extracción de IBP en el tejido vegetal, 2) la proyección de extractos para la actividad IRI, y 3) el aislamiento y la purificación de IBP. Después de la inducción de IBP por la exposición a baja temperatura, extractos se ensayaron para la actividad IRI utilizando un 'ensayo de splat', que permite la observación del crecimiento de cristales de hielo usando un microscopio de luz estándar. Este ensayo requiere una baja concentración de proteína y genera resultados que se obtienen de forma rápida y fácil de interpretar, proporcionando una pantalla inicial para la actividad de unión de hielo. IBP luego puede ser aislado de proteínas contaminantes mediante la utilización de la propiedad de IBP para adsorber al hielo, a través de una técnica llamada 'hielo-purificación de afinidad'. Usando lisados de células recogidas de extractos de plantas, un hemisferio hielo puede cultivar lentamente en una sonda de latón. Esto incorpora IBP en la estructura cristalina del hielo policristalino. Que no requiere un conocimiento bioquímico o estructural a priori de la IBP, este método permite la recuperación de proteína activa. fracciones de proteína de hielo purificados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, incluyendo la identificación de pepsecuencias de marea por espectrometría de masas y el análisis bioquímico de proteínas nativas.
Introducción
Proteínas de unión de hielo-(IBP) son una familia diversa de proteínas protectoras que se han descubierto en una serie de organismos, incluyendo plantas 1, insectos, peces 2 3 y microbios 4. La característica clave de estas proteínas es su capacidad única para adsorber específicamente y eficazmente a los cristales de hielo, la modificación de su crecimiento. IBP tienen varias propiedades documentados, con los dos más bien caracterizado ser histéresis térmica (TH) y la inhibición de hielo-recristalización (IRI). actividad TH se observa más fácilmente en IBP producidos en an....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Splat Configuración Aparato
- Llenar un baño de agua circulante de temperatura programable con etilenglicol (50% v / v en agua).
NOTA: verde etilenglicol del automóvil se puede utilizar. - Para montar la cámara externa, utilizar un tubo de plástico aislante para fijar el baño de agua a un recipiente de vidrio de doble pared. Aislar el recipiente de vidrio con espuma de poliestireno y cubrir con una tapa de placa de petri de plástico. Corte un agujero 3-4 pulgadas en la parte inferior de la cámara de poliestireno de manera que la fuente de luz puede ser visto a través de la cámara de vidrio.
- Montar la cámara externa en un microscop....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para facilitar la puesta en marcha, la Figura 1 y La Figura 2 se incluyen como representaciones visuales de los equipos utilizados para el análisis de IRI y purificación de hielo-afinidad, respectivamente. Resultados del análisis de IRI utilizando extractos recogidos de malezas mostaza con y sin IBP se representan en la Figura 3. Estos resultados muestran que los extractos obtenid.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Para el análisis exitoso y purificación de IBP, es importante para comprender la naturaleza sensible a la temperatura de algunas de estas proteínas. Cierta planta IBP vuelva inestable a temperaturas superiores a 0 ° C, resultando en despliegue, la precipitación y la inactividad. Con el fin de obtener IBP activos, a menudo es crítico que las plantas se procesan en una habitación fría (~ 4 ° C) y las muestras se mantuvieron en hielo durante la experimentación. Otro factor a considerar cuando se utiliza de células enteras .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una beca NSERC (Canadá) a VKW.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microcentrífugas de 1,5 mL Fisher | 05-408-129 | ||
| Gato de laboratorio ajustable | Fisher | S63080 | |
| Centrífuga de sobremesa | Desaga MC2 | ||
| Sonda de latón | a medida | ||
| Cámara digital Canon Power Shot SX110 de Canon; puerto | |||
| Estopilla | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Tubos de concentración (0,5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Tubos de concentración (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Tubos cónicos (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Bloque de refrigeración | VWR | 13259 | Utilice un bloque |
| calefactor metálicoDeshumidificador | Whirlpool | 50 pintas Deshumidificador Energy Star; cómpralo a un proveedor local | |
| Perlas de descongelación | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 tamaño de malla; 100% indicativo |
| Microscopio de disección | Olympus Tokyo | ||
| Cuenco de vidrio de doble pared | Genérico | Compra de un proveedor local de cristalería de laboratorio | |
| Hielo seco | Genérico | Utilice un proveedor local; peligroso | |
| Tabletas inhibidoras de EDTA-proteasa | Sigma Aldrich 11836170001 | Roche cOmplete mini | |
| Etilenglicol | Genérico Verde El | etilenglicol automotriz se puede comprar en cualquier ferretería local (i.e. Home Depot) | |
| Hexano | Sigma Aldrich | 296090 | Anhidro, 95%; peligroso |
| Aceite de inmersión | Sigma Aldrich | 56822 | |
| Centrífuga JA10/20 | Beckman | ||
| Placa de Petri de plástico grande | Genérico | ||
| Nitrógeno líquido | Genérico Uso | local; peligroso | |
| Placa de agitación magnética | Hanna Instruments | HI190M | |
| Portaobjetos de cubierta de microscopio | Fisher | 12-542A | |
| Tubo de plástico | Genérico | Compre tubo de PVC en la ferretería local | |
| Película polarizada | Edmund Optics | 43-781 | |
| Espuma de poliestireno | Genérico | Se puede construir con cajas de envío de poliestireno | |
| Mortero Poreclain | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µ m tamaño de partícula |
| Soporte de retorta | Fisher | 12-000 | |
| Barra agitadora pequeña | Fisher | 14-513-51 | |
| Baño de agua con temperatura programable | VWR | 13271-118 | |
| Grasa de vacío | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Tubo de vinilo | Genérico |
Referencias
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256(2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
