Artículo de método

Identificación de proteínas vegetales de hielo de unión a través de la evaluación de la inhibición de hielo-recristalización y Aislamiento Uso de purificación de hielo-afinidad

DOI:

10.3791/55302

⸱

5 de mayo de 2017

 ,  , 
1Department of Biology, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3School of Environmental Sciences, Queen's University

En este artículo

Resumen

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Este documento describe la identificación de proteínas de unión de hielo a partir de plantas tolerantes a la congelación a través de la evaluación de la actividad de inhibición de hielo-recristalización y posterior aislamiento de IBP nativas utilizando purificación hielo-afinidad.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

proteínas de unión de hielo-(IBP) pertenecen a una familia de proteínas inducidas por estrés que se sintetizan por ciertos organismos expuestos a temperaturas bajo cero. En las plantas, daños por congelación se produce cuando crecen los cristales de hielo extracelular, dando como resultado la ruptura de las membranas de plasma y posible muerte celular. Adsorción de IBP a cristales de hielo restringe aún más el crecimiento mediante un proceso conocido como inhibición de hielo-recristalización (IRI), reduciendo así el daño celular. IBP también demuestran la capacidad de deprimir el punto de una solución por debajo del punto de fusión de equilibrio, una propiedad conocida como histéresis térmica actividad (TH) de congelación. Estas propiedades de protección han elevado interés en la identificación de nuevos IBP debido a su uso potencial en aplicaciones industriales, médicas y agrícolas. Este artículo describe la identificación de la planta de IBP a través de 1) la inducción y la extracción de IBP en el tejido vegetal, 2) la proyección de extractos para la actividad IRI, y 3) el aislamiento y la purificación de IBP. Después de la inducción de IBP por la exposición a baja temperatura, extractos se ensayaron para la actividad IRI utilizando un 'ensayo de splat', que permite la observación del crecimiento de cristales de hielo usando un microscopio de luz estándar. Este ensayo requiere una baja concentración de proteína y genera resultados que se obtienen de forma rápida y fácil de interpretar, proporcionando una pantalla inicial para la actividad de unión de hielo. IBP luego puede ser aislado de proteínas contaminantes mediante la utilización de la propiedad de IBP para adsorber al hielo, a través de una técnica llamada 'hielo-purificación de afinidad'. Usando lisados ​​de células recogidas de extractos de plantas, un hemisferio hielo puede cultivar lentamente en una sonda de latón. Esto incorpora IBP en la estructura cristalina del hielo policristalino. Que no requiere un conocimiento bioquímico o estructural a priori de la IBP, este método permite la recuperación de proteína activa. fracciones de proteína de hielo purificados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, incluyendo la identificación de pepsecuencias de marea por espectrometría de masas y el análisis bioquímico de proteínas nativas.

Introducción

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Proteínas de unión de hielo-(IBP) son una familia diversa de proteínas protectoras que se han descubierto en una serie de organismos, incluyendo plantas 1, insectos, peces 2 3 y microbios 4. La característica clave de estas proteínas es su capacidad única para adsorber específicamente y eficazmente a los cristales de hielo, la modificación de su crecimiento. IBP tienen varias propiedades documentados, con los dos más bien caracterizado ser histéresis térmica (TH) y la inhibición de hielo-recristalización (IRI). actividad TH se observa más fácilmente en IBP producidos en animales de congelación-intolerante. los resultados de esta actividad en disminución del punto de fluidos circulatorios o intersticiales organismos congelación para evitar la congelación. En contraste, en los organismos de congelación-tolerante, lo que inevitablemente congelar a temperaturas bajo cero, IBP parecen tener baja actividad de TH. A pesar de la baja actividad de TH, una alta actividad IRI para restringir grito hielocrecimiento Stal se observa a menudo con estas proteínas. Para el organismo tolerante a la congelación, esta actividad IRI presumiblemente ayuda a proteger las células contra el crecimiento descontrolado de hielo en compartimentos extracelulares.

El modelo de "botón de colchón" se puede utilizar para describir el mecanismo por el cual IBP a prevenir el crecimiento de cristales de hielo 5. Bajo este modelo, IBP adsorber específicamente a la superficie de cristales de hielo a intervalos, de manera que las moléculas de agua sólo pueden incorporar con la creciente enrejado de cristales de hielo en el espacio entre unido IBP. Esto crea una curvatura que hace que la incorporación de moléculas de agua adicionales desfavorable, un evento que puede ser descrito por el efecto de Gibbs-Thomson 6. Las aguas de clatrato anclado hipótesis proporciona un mecanismo para la unión específica de IBP a la superficie del cristal de hielo lo que la presencia de restos cargados, colocado específicamente en el sitio de unión de hielo proteína, los resultados en la reorganización de moléculas de agua para que coincidan con uno o más planos de la red cristalina de hielo 7.

actividad TH puede ser cuantificado mediante la medición de la diferencia entre la fusión y las temperaturas de congelación de un solo cristal de hielo en presencia de un IBP. Mientras que la actividad TH es un método ampliamente aceptado de evaluación de la actividad de IBP, la brecha TH bajo producido por la planta de IBP (típicamente sólo una fracción de grado) normalmente requiere una concentración de proteína alta, equipo especializado y experiencia del operador. Aunque no IBP puede restringir el crecimiento de cristales de hielo, es una propiedad compartida por todos los IBP y probar de este modo para la actividad IRI es una pantalla inicial eficaz para la presencia de IBP, especialmente para aquellos con baja actividad de TH. La metodología utilizada para probar esta actividad se conoce como un 'ensayo de splat', mediante el cual una muestra de proteína se congelaron rápidamente para producir una monocapa de pequeños cristales de hielo, que se observan durante un período de tiempo para determinar siel crecimiento de cristales de hielo está restringido. A diferencia de otros métodos utilizados para escrutar una muestra de tejido fuente para la presencia de IBP, esta técnica es aplicable a bajas concentraciones de proteínas en el intervalo de 10-100 ng, utiliza equipos fácilmente-fabricada, y genera datos que se interpreta de forma rápida y fácil. Sin embargo, es importante subrayar que este ensayo proporciona una pantalla inicial para IBP que debe ser seguido por la determinación de TH y la conformación de cristales de hielo.

El aislamiento de proteínas nativas es un reto, a menudo requieren información sobre las propiedades estructurales y bioquímicas de una proteína de interés. La afinidad de IBP para el hielo permite el aislamiento de estas proteínas usando hielo como un sustrato para fines de purificación. Puesto que la mayoría de las moléculas son empujados por delante del límite de hielo-agua durante el crecimiento de cristales de hielo, el crecimiento lento de un hielo-hemisferio en presencia de una muestra de IBP resultados en una muestra altamente purificada, desprovisto de gran quantitIES de proteínas contaminantes y solutos. Este método ha sido utilizado para identificar IBP de los insectos 8, 9, 10, las bacterias 11, peces 12 y las plantas 13, 14. Además, las fracciones enriquecidas en IBP obtenidos a través de este método también se pueden utilizar para el análisis bioquímico de aguas abajo. Este documento describe la identificación de IBP en las plantas a través de la inducción y la extracción de IBP, análisis de la actividad IRI para confirmar la presencia de proteínas, y el aislamiento de proteínas utilizando la purificación por afinidad de hielo.

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Protocolo

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1. Splat Configuración Aparato

  1. Llenar un baño de agua circulante de temperatura programable con etilenglicol (50% v / v en agua).
    NOTA: verde etilenglicol del automóvil se puede utilizar.
  2. Para montar la cámara externa, utilizar un tubo de plástico aislante para fijar el baño de agua a un recipiente de vidrio de doble pared. Aislar el recipiente de vidrio con espuma de poliestireno y cubrir con una tapa de placa de petri de plástico. Corte un agujero 3-4 pulgadas en la parte inferior de la cámara de poliestireno de manera que la fuente de luz puede ser visto a través de la cámara de vidrio.
  3. Montar la cámara externa en un microscopio de disección, equipado con un puerto de la cámara y una lente objetivo 4X polarizado con una lente ocular de 10x. Colocar una pieza adicional de la película polarizada en el fondo de la cámara externa.
  4. Abrazadera de un tubo de 1-1,5 m (~ 5 cm de diámetro) sobre un soporte vertical y el lugar dentro de un contenedor de poliestireno grande, junto con un bloque de refrigeración posicionado debajo del tubo en la base del soporte de retorta.

2. Preparación de la proteína nativa Extractos de Análisis IRI

  1. Para inducir la expresión de IBP en hierbas tolerantes a la congelación o otras especies de plantas tolerantes a la congelación, las plantas se aclimatan en frío para un máximo de 1 semana a 4 ° C, en condiciones de poca luz (6 h de luz / 18 h de oscuridad). Esto no se aplica a las muestras recogidas en el campo que ya han sido expuestos a condiciones de baja temperatura y períodos de aclimatación.
  2. Obtener aproximadamente 0,1 g de tejido de la hoja por el corte en la base del tallo y luego se coloca en un tubo de 1,5 ml. Inmediatamente parpadear congelar la muestra en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso.
  3. Para lisar las células, moler muestra de tejido en un polvo fino usando un mortero y mano de mortero en nitrógeno líquido. Asegúrese de que el nitrógeno líquido no se evapora durante el proceso de homogeneización.
  4. Inmediatamente colocar muestras molidas en hielo y permitir que el nitrógeno líquido se evapore completamente. Añadir 1 ml de una proteína nativa extractien tampón que contiene 10 mM Tris-HCl, NaCl 25 mM (pH 7,5), con dos comprimidos de inhibidor de proteasa libre de EDTA añadido inmediatamente antes del uso. Pipeta para mezclar; No hacer vórtice.
    NOTA: pueden necesitar ser utilizado aditivos adicionales si el lisado contiene metabolitos secundarios (ver Discusión).
  5. Agitar suavemente las muestras durante la noche (18-24 h) a 4 ° C. Llevar a cabo los pasos restantes a 4 ° C.
  6. Eliminar los desechos celulares por centrifugación de las muestras a ~ 16.000 xg durante 5 min. Conservar la fracción soluble y se centrifuga durante 5 min adicionales si los restos celulares persiste. muestras clarificadas se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso.

3. Ensayo de Splat pre-configuración del experimento

  1. Verter 100 ml de hexano en la cámara externa configurar con la película polarizada y añadir 5-6 perlas de desecación para evitar que la humedad se acumule en las diapositivas. Añadir una pequeña cantidad de grasa de vacío a la placa que cubre el baño y girar para garantizar un sellado hermético y evitar la evaporación del hexano.
  2. Se enfría el baño de hexano entre -4 ° C y -6 ° C usando el baño de agua programable aproximadamente 2-3 h antes de iniciar el experimento. Asegúrese de comprobar la temperatura del hexano con un termómetro antes de comenzar el experimento.
  3. Coloque el bloque de enfriamiento en una caja de poliestireno directamente debajo del tubo de plástico y cubrir completamente con hielo seco, 40 min antes de iniciar el experimento.
  4. Antes de comenzar el ensayo, asegúrese de que el tubo esté a nivel. Para determinar en qué parte del bloque de enfriamiento de la muestra se deje caer, primero prueba el procedimiento con agua e indicar donde la muestra cae con un marcador (como se describe a continuación).
  5. Retire el hielo seco a partir de la parte superior del bloque frío y colocar una cubierta de portaobjetos de microscopio de vidrio en la marca de gota que ha sido determinada con agua.
  6. Inmediatamente antes de comenzar el ensayo, encender la fuente de luz y raspar cualquier hielo que se ha formado en la parte inferior de la cámara de vidrio. Evitar mantener la fuente de luz a no ser que los cristales de hieloestán siendo visualizado para evitar el calentamiento de la hexano.

4. Llevar a cabo el ensayo de cubreobjetos

  1. Sumergir la punta desechable fijada a una pipeta automática (1-20! L) en aceite de inmersión, usando una toalla de papel eliminar cualquier exceso de aceite. Este paso permitirá que la muestra caiga en lugar de adherirse a la parte exterior de la pipeta.
    NOTA: La eliminación de exceso de aceite de la pipeta es crítico para asegurar que las gotitas de aceite no se forman en los cristales de hielo, lo que hace difícil visualización.
  2. Pipetear 10 l de muestra y el lugar de la pipeta directamente sobre la tubería de plástico antes de la liberación de la muestra. Un sonido distinto 'splat' debe ser escuchada cuando la muestra golpea la diapositiva cubierta de vidrio, creando una monocapa de cristales de hielo.
  3. eliminar de forma rápida y cuidadosamente el portaobjetos de microscopio del bloque frío utilizando pinzas y lugar en el baño de hexano en la parte superior de la película de polarización.
  4. Mirando bajo el microscopio, poner el portaobjetos de microscopio en el campo de visión y el anunciosólo la lente objetivo de modo que la polarización cruzada permite la visualización de cristales de hielo de alto contraste. Ajustar ampliación de 40x.
  5. Monte la cámara en el microscopio y ajustar la configuración a "macro" para permitir una visualización clara de los cristales de hielo y la captura de la imagen.
    NOTA: Esperar hasta 1 h para permitir que los cristales de hielo crezcan puede dar una imagen más clara.
  6. Repita los pasos 4.1 a 4.5 para todas las muestras. Típicamente, colocar hasta 6 diapositivas con una muestra diferente en la cámara de hexano.
  7. Apagar la fuente de luz y colocar una placa de plástico sobre la bañera hexano, asegurando un sello hermético. Permitir que los cristales de hielo a hibridan durante la noche (12-24 h, manteniendo un período de recocido coherente dentro de un ensayo particular). Después de la incubación, capturar imágenes de las películas de hielo como se describe anteriormente.
    NOTA: Algunas muestras pueden recristalizar con mayor rapidez que otros. Si no hay recristalización es evidente después de 12 h, permitir que los cristales se hibridan durante un máximo de 24 h para asegurar que no recrystalliocurrirá zación.

Análisis de Datos 5. Ensayo de Splat

  1. Sube las fotos a un ordenador y comparar directamente el tamaño de los cristales de hielo antes y después del recocido. Las muestras con actividad de recristalización de hielo no va a crecer, mientras que las muestras sin ninguna actividad IRI se recristalizar la formación de cristales de hielo notablemente más grande. interferencia de la luz hará que grandes cristales de hielo aparecen de forma ligeramente diferentes tonalidades y por lo tanto son fáciles de ver.

6. hielo afinidad de configuración Purificación

  1. Llenar un baño de agua circulante de temperatura programable con etilenglicol. Verde etilenglicol del automóvil se puede utilizar.
  2. Se conecta el baño a una sonda hueca, latón utilizando un manguito aislante de plástico 15.
  3. Construir un recipiente de poliestireno en la que un vaso de 150 ml puede caber cómodamente. Crear una tapa para el contenedor con un agujero en el centro para el dedo frío de latón.

7.Preparación de las muestras para la purificación de hielo-afinidad

  1. tejido de la planta acclimate en frío como se describe en la sección 2.1.
  2. Recoger ~ 100-150 g de la biomasa del suelo (etapa 2.3) en 20 ml tubos e inmediatamente parpadear congelar. Las muestras se pueden mantener a -80 ° C antes de su uso.
  3. Preparar la muestra como se describe en las secciones 2.3-2.5. Utilice una relación 1: 1 (mg de tejido: ml de tampón de extracción de proteína nativa) para la resuspensión de tejido de la hoja. Utilice tabletas adicionales inhibidores de proteasa para evitar la degradación de IBP por proteasas endógenas.
    NOTA: Si la muestra de tejido es demasiado concentrado, ajustar la relación de 1: 2 o 1: 3 (mg de tejido: ml de tampón de extracción de proteína nativa).
  4. Para eliminar los restos celulares, tamiz de lisado a través de 2 capas de gasa, 3 veces. Sedimentar los residuos por centrifugación a 30.000 xg durante 40 min a 4 ° C.
  5. Aumentar el volumen de muestra a 120 ml utilizando tampón de extracción de proteína nativa. Utilice el lisado inmediatamente para la purificación de hielo-afinidad paraevitar cualquier pérdida de actividad de unión a hielo.

8. La realización de purificación de hielo-afinidad

  1. Antes de la purificación, establecer el baño de agua programable para enfriar de -0,5 ° C a -3 ° C a una velocidad de -0,04 ° C / h.
    NOTA: La velocidad de enfriamiento se puede ajustar dependiendo del volumen inicial de la muestra.
  2. Se enfría la dedo hielo a -0,5 ° C y, posteriormente, sumergir en un tubo de 50 ml que contiene agua destilada fría. Añadir unos trozos de hielo para facilitar la nucleación del hielo y permitir una fina capa de hielo para formar en el dedo. Este proceso generalmente dura entre 20 y 30 min.
    NOTA: Los grumos en el dedo recubierto de hielo deben ser alisadas con una mano enguantada antes de colocar en la muestra. Si una capa de hielo no se forma a -0,5 ° C, bajar la temperatura a -0,75 ° C.
  3. Coloque la muestra en un vaso de precipitados de vidrio de 150 que contiene una pequeña barra de agitación magnética en un recipiente de poliestireno en la parte superior del agitador magnético. Asegúrese de que el dedo de hielo escentrada y bajado al menos a mitad de camino en la muestra de líquido. Sellar el contenedor.
  4. Permitir que el programa se ejecute durante aproximadamente dos días, comprobando cada 24 h. Una vez que se congela el 50% de la muestra, detener el programa. La incorporación de IBP en el hemisferio hielo resultará en "hielo-grabado".
    NOTA: los experimentos de purificación se puede hacer uso de volúmenes de muestra más grandes con la longitud de tiempo en el que el programa se ejecuta ajustarán en consecuencia.
  5. Con el fin de eliminar el hemisferio hielo, calentar la sonda a 4 ° C, enjuague el hemisferio con agua destilada para eliminar la proteína no unida, y luego descongelar a 4 ° C.
    NOTA: La mayoría de IBP no son estables en agua y un tampón apropiado (es decir, 50 mM Tris-HCl, pH 8 o 50 mM de bicarbonato de amonio, pH 8) tendrá que ser añadido periódicamente durante el proceso de descongelación (aproximadamente 1 ml / 2 h) . hemisferios de hielo pueden ser envueltos en papel de aluminio y se almacenaron a -20 ° C antes de la descongelación.
  6. Si el hielo del hemisferio todavía contienens pigmento, o para incrementar la purificación de la muestra, repita los pasos 8.1-8.5 2-3 veces.
    NOTA: Aunque la concentración de IBP puede ser menor después de múltiples rondas de purificación, la pureza es más valioso que dió si se analizarán las muestras purificadas usando MS. Si el material se dispone de suficiente, se recomienda tres rondas de purificación de hielo-afinidad.

9. Identificación de IBP

  1. Desde IBP están contenidas en un gran volumen siguiente de la descongelación del hielo-hemisferio, concentrar las muestras. Concentrar las muestras que contienen ~ 100 g de tejido a ~ 1-3 ml usando tubos de concentración centrífuga con un peso molecular 3000 Da de corte para evitar la pérdida de proteínas pequeñas.
  2. Antes de enviar muestras para MS, determinar la concentración de proteína usando un ensayo de cuantificación de proteínas tal como un BCA o ensayo de Bradford. Estimar la pureza de las muestras mediante electroforesis en gel tales como SDS-PAGE. Prueba de las proteínas purificadas para la actividad IRI antes de seNding para MS para asegurar que la proteína activa se ha conservado a través de las etapas de purificación y concentración.
  3. Utilice muestras concentradas directamente para análisis de espectrometría de masa 10.

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Resultados

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Para facilitar la puesta en marcha, la Figura 1 y La Figura 2 se incluyen como representaciones visuales de los equipos utilizados para el análisis de IRI y purificación de hielo-afinidad, respectivamente. Resultados del análisis de IRI utilizando extractos recogidos de malezas mostaza con y sin IBP se representan en la Figura 3. Estos resultados muestran que los extractos obtenid...

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Discusión

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Para el análisis exitoso y purificación de IBP, es importante para comprender la naturaleza sensible a la temperatura de algunas de estas proteínas. Cierta planta IBP vuelva inestable a temperaturas superiores a 0 ° C, resultando en despliegue, la precipitación y la inactividad. Con el fin de obtener IBP activos, a menudo es crítico que las plantas se procesan en una habitación fría (~ 4 ° C) y las muestras se mantuvieron en hielo durante la experimentación. Otro factor a considerar cuando se utiliza de células enteras ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por una beca NSERC (Canadá) a VKW.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microcentrífugas de 1,5 mL Fisher05-408-129
Gato de laboratorio ajustableFisherS63080
Centrífuga de sobremesaDesaga MC2
Sonda de latóna medida
Cámara digital Canon Power Shot SX110 de Canon; puerto
EstopillaPurewipe/Fisher Scientific06-665-25A
Tubos de concentración (0,5 mL)EMD MilliporeUFC501008
Tubos de concentración (15 mL)EMD MilliporeUFC900308
Tubos cónicos (50 mL)Thermo FisherAM12502
Bloque de refrigeraciónVWR13259Utilice un bloque
calefactor metálicoDeshumidificadorWhirlpool50 pintas Deshumidificador Energy Star; cómpralo a un proveedor local
Perlas de descongelaciónt.h.e. Dessicant/VWREM-DX0017-26-8 tamaño de malla; 100% indicativo
Microscopio de disecciónOlympus Tokyo
Cuenco de vidrio de doble paredGenéricoCompra de un proveedor local de cristalería de laboratorio
Hielo secoGenéricoUtilice un proveedor local; peligroso 
Tabletas inhibidoras de EDTA-proteasaSigma Aldrich 11836170001Roche cOmplete mini
EtilenglicolGenérico Verde Eletilenglicol automotriz se puede comprar en cualquier ferretería local (i.e. Home Depot)
HexanoSigma Aldrich296090Anhidro, 95%; peligroso
Aceite de inmersiónSigma Aldrich56822
Centrífuga JA10/20Beckman
Placa de Petri de plástico grandeGenérico
Nitrógeno líquidoGenérico Usolocal; peligroso 
Placa de agitación magnéticaHanna InstrumentsHI190M
Portaobjetos de cubierta de microscopioFisher12-542A
Tubo de plásticoGenéricoCompre tubo de PVC en la ferretería local
Película polarizadaEdmund Optics43-781
Espuma de poliestirenoGenéricoSe puede construir con cajas de envío de poliestireno
Mortero PoreclainFisherFB961
PVPPSigma Aldrich77627110 µ m tamaño de partícula
Soporte de retortaFisher12-000
Barra agitadora pequeñaFisher14-513-51
Baño de agua con temperatura programableVWR13271-118
Grasa de vacíoDow Corning/Sigma AldrichZ273554
Tubo de viniloGenérico
Cámara/puerto de cámara hecho de microscopio hecho a medida

Referencias

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