Métodos de estudio de la función de proteínas de transporte epitelial y expresión en nativo Intestino y Caco-2 células cultivadas en 3D

Summary

Se describen métodos sencillos para estudiar la regulación de la función intestinal transportador de serotonina (SERT) y la expresión utilizando una célula in vitro modelo de cultivo de las células Caco-2 crecido en 3D y un modelo ex vivo de los intestinos de ratones. Estos métodos son aplicables al estudio de otros transportadores epiteliales.

Abstract

El epitelio intestinal tiene importantes funciones de transporte y de barrera que juegan un papel clave en las funciones fisiológicas normales del cuerpo al tiempo que proporciona una barrera para las partículas extrañas. el transporte epitelial alterada (iones, nutrientes o medicamentos) se ha asociado con muchas enfermedades y puede tener consecuencias que van más allá de las funciones fisiológicas normales de los transportistas, como por influir en la integridad epitelial y el microbioma intestinal. La comprensión de la función y regulación de las proteínas de transporte es fundamental para el desarrollo de mejores intervenciones terapéuticas. El mayor desafío en el estudio del transporte epitelial está desarrollando un sistema modelo adecuado que recapitula las características importantes de las células epiteliales intestinales nativas. Varios modelos de cultivo celular in vitro, como las células HT-29-Cl.19A Caco-2, T-84, y se utilizan típicamente en la investigación del transporte epitelial. Estas líneas celulares representan un enfoque reduccionista de la modelización del correopithelium y se han utilizado en muchos estudios mecanísticos, incluyendo su examen de las interacciones epitelio-microbiana. Sin embargo, las monocapas de células no reflejan con exactitud las interacciones célula-célula y el microentorno in vivo. Las células cultivadas en 3D han demostrado ser prometedores modelos para estudios de permeabilidad del fármaco. Mostramos que células Caco-2 en 3D se pueden utilizar para estudiar los transportadores epiteliales. También es importante que los estudios en células Caco-2 se complementan con otros modelos para descartar efectos específicos de células y para tener en cuenta la complejidad del intestino nativo. Varios métodos han sido utilizados previamente para evaluar la funcionalidad de los transportadores, tales como saco evertido y la absorción en las células epiteliales aisladas o en vesículas de membrana aisladas plasma. Teniendo en cuenta los desafíos en el campo con respecto a los modelos y la medición de la función de transporte, se demuestra aquí un protocolo para crecer células Caco-2 en 3D y describir el uso de una cámara de Ussing como unaenfoque eficaz para medir el transporte de serotonina, como en el epitelio intestinal polarizadas intactas.

Introduction

El epitelio intestinal está equipado con varias proteínas de transporte (canales, ATPasas, co-transportadores e intercambiadores) que realizan numerosas funciones que van desde la absorción de nutrientes, electrolitos y fármacos para la secreción de fluido y los iones en el lumen. Las proteínas de transporte generan gradientes electroquímicos que permiten el movimiento de los iones o moléculas de un modo vectorial. Esto se consigue mediante las distribuciones asimétricas de los sistemas de transporte en las membranas apical y basolateral de las células epiteliales polarizadas. Además, las uniones estrechas, que atan las células epiteliales adyacentes, juegan un papel....

Protocol

1. Estudio de Transporte intestinal en un sistema de cultivo en 3D de células Caco-2: Crecimiento 3D Caco-2 Cultivo de células en una mezcla de proteínas gelatinoso

1. factor de crecimiento de deshielo redujo mezcla de proteína gelatinosa en hielo durante 8 h (o O / N) a 4 ° C. Una vez descongelado, hacer 1 ml o 500 alícuotas de uso o almacenar a -20 ° C para su uso posterior.
2. En el día de la cultura, preenfriar las placas de cultivo (por ARN y proteínas de extracción) o portaobjetos con cámaras (por inmunotinción) en hielo. Añadir 30 l de mezcla de proteína gelatinosa a cada pocillo de un porta de vidrio cámaras ocho pocillos (o 120 l por pocillo d....

Results

La inmunotinción en 3D Caco-2 quistes se muestra en la Figura 1. Una imagen representativa de un plano XY que muestra lumen bien delimitadas en el quiste 3D teñidas con faloidina actina se representa en la Figura 1A. El lado que da al lumen denota el lado apical. Las células epiteliales cultivadas en un entorno 3D resultado en un fenotipo epitelial robusto. Diferentes Caco-2 quistes en día 12, cuando la actina y SERT fueron co-manchado, se muestran en

Discussion

Monocapas de Caco-2 de células completamente diferenciadas se han utilizado ampliamente como polarizado monocapas epiteliales para estudiar el transporte intestinal ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Sin embargo, para imitar la organización fisiológica de las células epiteliales intestinales, ha habido un considerable interés en el des.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	ATCC	ATCC® HTB&tímido; 37 y comercio;	células
10x PBS	Carl Zeiss		Microsope para imágenes confocal
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Cultivo de células para microscopía
5-HT	Gibco	70013-032	No es una sustancia peligrosa
95% O2- 5% CO2 cilindro	KPL	71-00-27	No es una sustancia peligrosa
Agar (para placas de agar)	Fischer	BP151-100	Toxicidad aguda, Ora
Agar (para electrodo)	Sigma	G7126-1KG	No es una sustancia peligrosa
Alexa Fluor Phalloidin	Sigma	C3867-1VL	No es una sustancia peligrosa
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	P6148-500G	Nocivo si se ingiere o se inhala
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	No es una sustancia peligrosa
Caco-2 Células Sigma		A8806-5G	No es una sustancia peligrosa
Tampón de lisis celular	Fischer	BP337-100	No es una sustancia peligrosa Sustancia peligrosa
Portaobjetos Chabered	Sigma	S5886-1KG	No es una sustancia peligrosa
Solución de colágeno tipo 1	Sigma	S8045-500G
Electrodos	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco de Life Technologies	25200-056
Suero fetal bovino (FBS)	Corning	356234	utilizado como matriz extracelular
Fluoxetina	Qiagen	74104
Gentamicina	ATCC	30-2003	Medios de cultivo celular
Señalización celular de glicina	, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indometacina	Gibco de Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco de Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco de Life Technologies	15630-080
Ácido L-ascórbico	Gibco de Life Technologies	10082147
Contador de centelleo líquido	Gibco por Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Instrumentos Fisiológicos, San Diego, CA	EM-CSYS-8
	Instrumentos fisiológicos de manitol, San Diego, CA	P2304
Matrigel	, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Instrumentos fisiológicos, San Diego, CA	DM MC6
Pinza multicanal de voltaje/corriente Instrumentos	fisiológicos, San Diego, CA	P2300
de NaCl	, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Suero de cabra normal (NGS, 10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldehído (PFA)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Reactivo de ensayo de proteínas	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Cóctel de inhibidores de proteinasa	MEDOX, Chicago, IL	estilo G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Módulo de entrada de electrodo de un solo canal	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Deslizadores para cámaras de snapwell	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Fosfato de sodio (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β 1	Perkin-Elmer,Waltham, MA	NFT1167250UC
Triton X-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Tripsina EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Cámara de uso (solo cámara)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Sistemas de cámara de uso	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296