Este protocolo describe una metodología detallada para detectar la localización de2 H2O en Solea senegalensis espermatozoides con un fluorocromo sensible DCFH-DA para ROS, una mancha de mitocondrias vivo para las mitocondrias y DAPI para núcleos visualización, respectivamente. El protocolo está diseñado para ser realizado dentro de 2 h con espermatozoides frescos o descongelados.
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Artículo de método
Evaluación de ubicación intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de Solea Senegalensis
En este artículo
Resumen
Resumen
El estrés oxidativo es uno de los factores importantes en la disminución de la calidad del esperma. El desarrollo de protocolos eficientes para la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) en espermatozoides es de gran importancia en cualquier especie, pero estos métodos son raramente usados y aún menos en teleósteos. La criopreservación es una técnica útil en acuicultura para diversos propósitos, incluyendo banca de gene y garantizada la disponibilidad de espermatozoides durante todo el año. Procedimientos de congelación/descongelación puede causar producción de ROS y dañar las células de esperma. Teniendo en cuenta los posibles dañan podría causar un exceso de producción de ROS en espermatozoides dependiendo de su localización, aquí una metodología detallada para detectar H2O2 y evaluar su localización intracelular mediante microscopía confocal se proporciona. Para ello, se utiliza una combinación de 3 fluorocromos (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA), una mancha en mitocondrias y 4′, diclorhidrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) para evaluar la co-localización de H2O2 con núcleos de espermatozoides o mitocondrias en Solea senegalesis muestras de esperma.
Introducción
La producción de especies reactivas de oxígeno se ha relacionado con la calidad del esperma recientemente1. Aunque la producción de ROS en la mitocondria puede ser considerada un proceso fisiológico normal, estrés oxidativo por exceso de producción de ROS es una causa clara de daño en los espermatozoides en los diferentes niveles. En los seres humanos, el estrés oxidativo se asocia a infertilidad, alteración de la motilidad y la capacidad de someterse a capacitación2; en los mamíferos, el cambio de la integridad del ADN en las muestras de esperma congelado se ha relacionado también a la síntesis de H2O2
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Protocolo
Nota: Incubación de fluorocromo y análisis confocal tendrá al menos 2-3 h para un control y una muestra tratada. Procesamiento de datos no está incluido en este cálculo de tiempo. Materiales pueden encontrarse en la Tabla de materiales. Este protocolo se puede aplicar a los espermatozoides frescos o criopreservados. Solea senegalensis es una especie de pez que desova en aguas frías, trabajo siempre bajo condiciones de frío (4-7 ° C). Vea la figura 1 para una visión general del protocolo.
1. preparativos antes del experimento
- Prepare solución de grado analítico DMSO con un 1 m....
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Resultados
La microscopia confocal es un método ideal para evaluación de ROS intracelular en teleósteos de la esperma. La combinación de tres fluorocromos (DAPI, una mancha de mitocondrias y DCFH-DA) presentada en este estudio (figura 1) proporcionan mucha información útil que puede ser aplicado en la investigación básica y puede tener aplicaciones en la mejora de procedimientos utilizados en plantas de acuicultura industrial, tales como protocolos de criopreservación. .......
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Discusión
Es bien sabido que las mitocondrias son orgánulos claves para la motilidad del esperma y la función. Estos orgánulos están implicados simultáneamente directamente en la producción de ROS. Curiosamente, controlados los niveles de ROS son necesarios para el esperma adecuado función1. Relaciones positivas entre la fertilidad y el estrés oxidativo se ha demostrado en mamíferos11 pero niveles excesivos afectan esperma calidad12. Un factor crucial que podr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Este trabajo fue apoyado por el proyecto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce fue financiado por la Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) y el Fondo Social Europeo. Los autores reconocen Dr. Ana Riaza y Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero y José Ramón Guiérrez. También agradecemos a Paula Fernández Colado por videografía.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-Diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Microscopía confocal | Zeiss | LSM800 | |
| Cubreobjetos | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Grado Analítico | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Metanol, Grado Analítico | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerRojo Profundo | Microcentrífuga Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| (refrigerada) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| correderas | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
Referencias
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.
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Reimpresiones y permisos
