Modelización del comportamiento del cáncer de ovario en un esferoide multicelular Microdevice 3D dinámico peritoneal

Resumen

Para estudiar la progresión del tumor de ovario en un modelo fisiológicamente relevante, esferoides multicelulares se cultivaron en un microdispositivo bajo un flujo de fluido simulado. Este modelo 3D dinámico emula el medio ambiente intraperitoneal con los componentes celulares y mecánicas donde se produce la metástasis del cáncer de ovario.

Resumen

El cáncer de ovario se caracteriza por una amplia metástasis peritoneal, con esferas de tumores que se encuentran comúnmente en las ascitis maligna. Esto se asocia con pobres resultados clínicos y actualmente carece de tratamiento eficaz. Tanto los tres dimensiones (3D) medio ambiente y las fuerzas mecánicas dinámicas son factores muy importantes en esta cascada metastásica. Sin embargo, los cultivos celulares tradicionales no pueden recapitular este microambiente tumoral natural. Por lo tanto, en modelos in vivo -como que puede emular el entorno intraperitoneal son de importancia obvia. En este estudio, una nueva plataforma de microfluidos del peritoneo se creó para imitar la situación de los esferoides de cáncer de ovario en la cavidad peritoneal durante la metástasis. esferoides cáncer de ovario generados bajo una condición de no adherentes se cultivaron en canales microfluídicos recubiertas con células mesoteliales peritoneales sometidos a esfuerzo de cizalla fisiológicamente relevante. En resumen, esta dinámica 3D de micro-cáncer de ovario mesoteliorofluidic plataforma puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología básica del cáncer y servir como plataforma para la detección de drogas y el desarrollo potencial.

Introducción

El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal y se caracteriza por la diseminación peritoneal generalizada y la formación de ascitis maligna ^1. Esta extensa metástasis peritoneal representa un reto clínico y se asocia con pobres resultados clínicos. A diferencia de la mayoría de los carcinomas sólidos que metastatizan a través de la sangre, cáncer de ovario difunde principalmente dentro de la cavidad peritoneal. Las células tumorales existen como agregados multicelulares / esferoides durante el proceso de metástasis ^2. El hecho de que el cultivo en suspensión puede enriquecer las células madre de cáncer de ovario / iniciadoras del tumor sugiere además que estos esferoides pueden estar asociados tanto con la agresividad del tumor y mejorar la quimiorresistencia ^{3, 4.} Existen diferencias en la respuesta a los fármacos entre las culturas en 2D y 3D, que presumiblemente tienen diferentes mecanismos moleculares ^5.

_content "> La interacción esencial con el mesotelio construye el microambiente principal de la progresión del tumor de ovario. Estas células mesoteliales se encuentran en una matriz extracelular (ECM), donde la fibronectina es un constituyente ubicua. Un enlace entre el aumento de la expresión de la fibronectina derivado de células mesoteliales y la progresión del tumor se ha demostrado. la fibronectina es abundantemente presente en la ascitis maligna ^{6, 7.} células de cáncer de ovario también son capaces de inducir la secreción de la fibronectina a partir de células mesoteliales a fin de promover principios de la metástasis del cáncer de ovario ^8.

Nuevas pruebas demuestran que los estímulos mecánicos, como el estrés de cizallamiento, pueden modular la morfología celular, la expresión génica, y, por lo tanto, los fenotipos de las células tumorales ^{9, 10, 11.} Como ascitis maligna desarrollar y acumular durante tumor progresión, las células tumorales de ovario están expuestos al flujo de fluido y el esfuerzo cortante resultante. Un número de grupos, incluido el nuestro, han mostrado el efecto de la tensión de cizallamiento en la progresión del cáncer de ovario, incluyendo las modificaciones del citoesqueleto, transiciones epitelio-mesenquimal, y stemness cáncer ^{12, 13, 14, 15.} Por lo tanto, un microambiente fisiológicamente relevante es importante para la investigación de la metástasis peritoneal tumor. Sin embargo, los sistemas de cultivo in vitro hidrodinámicas actuales tienen limitaciones en la imitación y el control de una constante,, el estrés bajo fisiológicamente relevante de cizallamiento ^{16, 17, 18, 19.} Convencional in vitro acerca de enfoque ya sea en el entorno celular o mecánica todavía están limitados enimitando la complejidad del microambiente intraperitoneal con relevancia fisiológica adecuada.

Aquí, con el fin de diseñar un nuevo modelo del peritoneo para superar las limitaciones de las estrategias convencionales y para avanzar en el estudio del compartimiento intraperitoneal en la metástasis del cáncer, una plataforma basada en microfluidos 3D con el flujo de fluido controlado fue diseñado. En este modelo, esferoides de cáncer de ovario fueron co-cultivadas con células peritoneales humanas primarias mesoteliales en chips microfluídicos bajo flujo de fluido continuo (Figura 1A). Las células mesoteliales se sembraron en fibronectina. No adherentes esferoides de cáncer de ovario se sembraron en canales de microfluidos con medio de flujo continuo perfundido por una bomba de jeringa. Tanto el entorno 3D y las fuerzas mecánicas dinámicas son factores muy importantes de la cascada metastásica. Esta plataforma puede ser utilizado para investigar el microambiente intraperitoneal en términos de cel complejolular y co-cultivo de las interacciones, así como con respecto a las señales mecánicas dinámicas.

Protocolo

1. Diseño y fabricación de dispositivos de microfluidos

1. Diseño principal de microfluidos
   1. Diseño y dibujar el patrón de canales de microfluidos con cualquier software de diseño asistido por ordenador (CAD).
      NOTA: Normalmente, el dibujo CAD puede ser enviado a una empresa fotomáscara para producir la fotomáscara. El diseño de microfluidos se compone de tres canales paralelos idénticos, cada uno con las siguientes dimensiones: 4 mm x 25 mm x 250 mm (anchura x longitud x altura) y el grupo 2 mm. Ambos extremos del canal se han diseñado con 127 ° ángulos para facilitar la entrada en el líquido y la salida (Figura 1B). El canal utilizado en este protocolo se informó en una publicación anterior ^13.
   2. Lavar la oblea de silicio con ultrasonicación (500 W / 42 kHz) en acetona, isopropanol, y agua desionizada durante 15 minutos cada uno. Se seca la oblea con gas nitrógeno a presión. Se calienta la oblea de silicio sobre una placa caliente a 250 ° C durante 15 min a completamente secaeso.
   3. Spin-capa una capa de SU-8 2075 fotoprotector (125 micras de espesor) sobre la oblea de silicio con una velocidad de giro de 1.800 rpm. Hornear la oblea fotorresistente recubierto directamente en una placa caliente a 65 ° C y luego a 95 ° C, para eliminar el exceso de disolvente, por 5 y 25 min, respectivamente (de acuerdo con el manual del producto SU-8).
   4. Repita el paso 3 y spin-capa otra capa de SU-8 2075 fotoprotector para obtener un espesor final de 250 micras. Hornear la oblea fotorresistente recubierto directamente en una placa caliente a 65 ° C durante 7 minutos y después a 95 ° C durante 30 min. enfriar lentamente la oblea a temperatura ambiente. No enfríe con aire a presión.
   5. Alinear y colocar la foto máscara directamente en la parte superior de la oblea. Exponerlo a la luz UV durante 20 s para reticular el patrón.
   6. Hornear la oblea con fotorresistencia a 65 ° C y 95 ° C sobre una placa caliente para 5 y 12 min, respectivamente, para eliminar el disolvente para la polimerización (de acuerdo con el manual del producto SU-8). Posteriormente, se enfría la oblea paratemperatura ambiente.
   7. Retire el fotoprotector no reticulado mediante la inmersión de la oblea en el SU-8 desarrollador durante 25 minutos. Enjuague la oblea con isopropanol y se seca con aire a presión.
      NOTA: Si se observó una solución lechosa cuando el aclarado con isopropanol, lo que indica un desarrollo incompleto, sumergir la oblea de nuevo en SU-8 desarrollador para un tiempo de desarrollo más largo.
   8. Colocar la oblea en una placa caliente a 180 ° C durante 10 minutos para curar el patrón de grietas potenciales. Apagar la placa caliente y poco a poco se enfríe la oblea a temperatura ambiente dejándolo en el plato caliente.
   9. Añadir unas gotas de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano en una tapa del frasco. Poner el tapón del vial en el desecador de vacío. Coloque la oblea al lado de la tapa del vial a silanizar la oblea de 10 min.
2. PDMS fabricación de chips
   1. Envolver la oblea con papel de aluminio para crear un soporte.
   2. Mezclar el polidimetilsiloxano (PDMS) de base y agente de curado en una relación de 10: 1 en masacon una mezcladora centrífuga bajo la función de mezcla y desgasificar. Verter la mezcla de PDMS lentamente sobre la oblea a una altura de alrededor de 5 mm. Desgasificar el PDMS bajo vacío durante 40 minutos. Curar el PDMS en un horno a 65 ° C durante 2 h.
   3. Retire con cuidado la losa de PDMS de la maestra y recortar el PDMS a lo largo de los canales hasta que es del tamaño de un portaobjetos de vidrio. Perforar el PDMS con un punzón de biopsia de 1 mm para crear las entradas y salidas del dispositivo.
   4. Limpiar la superficie de PDMS con aire a presión y cinta adhesiva para quitar el polvo y los escombros PDMS.
   5. Coloque la losa de PDMS, con el lado del canal hacia arriba, en un limpiador de plasma. Colocar un portaobjetos de vidrio limpio en el limpiador de plasma junto a la losa de PDMS.
   6. El tratamiento de los PDMS y portaobjetos de vidrio menores de plasma de aire a nivel de RF de alta durante 1 minuto. Enlazar el PDMS en el portaobjetos de vidrio para crear un enlace covalente irreversible.
   7. Coloque el chip de PDMS en una placa caliente a 150 ° C durante 1 h para mejorar la fuerza de unión y para devolver el hydrophobicity del PDMS antes de su uso.

2. Siembra del chip de microfluidos con células mesoteliales peritoneales primarios (HPMC)

1. recubrimiento de fibronectina de canales de microfluidos
   1. Esterilizar el canal microfluídico con 30 l de 75% de etanol. Eliminar el etanol y enjuague dos veces con 30 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) esterilizada utilizando una punta de pipeta. A fondo aspirar PBS en los canales.
      NOTA: Para minimizar la contaminación, el cultivo celular de microfluidos debe ser cuidadosamente a cabo en condiciones totalmente asépticas mediante el uso de una campana de flujo laminar.
   2. Preparar una solución de 10 mg / ml de fibronectina en M199 libre de suero: MCDB105 (1: 1) medio. Pipetear la solución de arriba a abajo, con especial cuidado para evitar la formación de burbujas. No hacer vórtice.
   3. Lentamente llenar cada canal con 30 l de solución de fibronectina. Sellar los canales con cinta adhesiva e incubar el chip de la noche a 4 ° C.
3. HPMCs Cultura en 10% de medio de cultivo fetal de suero bovino (FBS) (M199: MCDB105 suplementado con 10% de FBS y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina) bajo 5% de _CO2 a 37 ° C hasta 80% de confluencia.
4. Enjuagar las HPMCs con 3 ml de PBS y trypsinize con 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA solución 0,01% (TE) durante 30 s. Neutralizar con 4 ml de medio de cultivo FBS 10% y centrifugar las células a 1000 xg durante 5 min.
5. Resuspender las HPMCs en 2 ml de medio de cultivo FBS 10%. Contar el número de células con un hemocitómetro y ajustar la concentración de células a 3,5 × 10 ⁶ / ml.
6. Calentar el chip microfluídico recubiertos de fibronectina en una incubadora a 37 ° durante 5 min antes de su uso. Completamente aspirar la solución de fibronectina.
7. pipeta lentamente 30 l de suspensión de HPMC en cada canal. Sellar los canales con cinta y colocar los dispositivos en el incubador de _CO2 durante la noche.

1. la formación de esferoides de cáncer de ovario
   1. Mantener la línea humana de células epiteliales de cáncer de ovario SKOV-3 en 5% FBS medio de cultivo (M199: MCDB105 con 5% de FBS y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina) bajo 5% de _CO2 a 37 ° C antes de los experimentos.
   2. Disolver 0,5% de agarosa en agua esterilizada por ebullición. Dispensar 50 l de solución de agarosa en cada pocillo de placas de 96 pocillos. Deje las placas en la campana durante 20 minutos para permitir que la agarosa solidifique; agarosa solidificado el revestimiento de los pozos pueden prevenir la adhesión celular e indica que las placas están listas para su uso.
   3. Enjuagar las células Skov-3 con 3 ml de PBS. Trypsinize con 2 ml de solución TE durante 3 min. Neutralizar con 4 ml de medio de cultivo FBS 5% y centrifugar las células a 1000 xg durante 5 min.
   4. Contar el número de células SKOV-3 con un hemocitómetro y resuspender las células en medio de cultivo FBS 5% a una densidad de 5.000 células / ml. Transfer 200 l de suspensión celular en cada uno de agarosa recubiertas bien y de cultivo bajo 5% de _CO2 a 37 ° C durante 48 h.
2. esferoide carga del cáncer
   1. Transferencia de esferoides de cáncer a un tubo de centrífuga de 50 ml pre-humedecido con 1 ml de medio libre de suero y de girar en 750 xg durante 5 min.
      NOTA: Pre-humedecido puntas de pipeta y tubos de centrifugación puede impedir la adhesión de esferoides no deseada en los tubos de centrífuga.
   2. Preparar 2,5 mg / ml de solución de diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA) en suero libre M199: medio MCDB105. esferoides de cáncer de resuspender en 1 ml de solución de CMFDA e incubar a 37 ° C durante 30 min. Centrifugar a 750 xg durante 5 min.
   3. Enjuagar los esferoides de cáncer con 2 ml de medio y se centrifuga libre de suero a 750 xg durante 5 min. Repita este paso dos veces para eliminar el colorante fluorescente restante del medio.
      NOTA: La señal fluorescente puede ser retenido en esferoides durante más de 96 h.
   4. Resuspender el cánceresferoides en el suero libre de medio M199: MCDB105 y cuentan el número de esferoides con un hemocitómetro. Ajustar la concentración a 2.000 esferoides / ml con medio libre de suero.
   5. Antes de esferoide de carga, inyecte lentamente 100 l de suero libre M199: medio MCDB105 para lavar las células no adheridas mesoteliales dentro de los canales.
      NOTA: Una inyección rápida, aspiración, o la formación de burbujas dará lugar a la separación de la monocapa mesotelial.
   6. Cargar 30 l de suspensión de esferoide marcado con fluorescencia en cada canal. Coloque el chip de microfluidos en el incubador de _CO2.
3. montaje de plataforma perfusión y co-cultivo
   1. Conecte una jeringa cargada con M199 fresca, libre de suero: MCDB105 medio de un tubo de 1 m de longitud.
   2. Coloque la jeringa en la bomba de jeringa y asegurar el émbolo y el cuerpo de la jeringa. Instalar la bomba de jeringa en una posición horizontal a la misma altura que el chip microfluídico dentro de la incubadora.
      norteOTA: El número y tamaño de las jeringas depende del número de canales utilizados y la duración del experimento.
   3. infundir rápidamente todo el tubo con medio pulsando y manteniendo pulsado el botón de avance rápido hasta que el medio se desborda el tubo.
   4. Ejecutar la inyección en el caudal deseado. Estimar la tensión de cizallamiento utilizando la siguiente ecuación:
      
      donde τ representa la tensión de cizallamiento dentro de la cámara, ǫ = caudal, μ = viscosidad (0,01 g ^cm-1); altura de la cámara h = flujo y ancho de la cámara w = flujo.
   5. Conectar el tubo a la entrada del canal. Colocar el tubo de entrada de exceso en la incubadora para garantizar que el medio se calienta antes de inyectar en los canales. Para facilitar la conexión entre el tubo y el canal, conectores adecuados pueden ser elegidos. NOTA: Tenga cuidado de no introducir ninguna burbuja a la Syringe, los tubos y conexiones.
   6. Conectar la salida del canal a un tubo cónico de 50 ml para recoger el medio de salida con un tubo de salida corto.
      NOTA: El sistema de co-cultivo dinámico completo se muestra en la Figura 1D.

4. Observación de HPMC y Cáncer esferoides Después de la perfusión

1. Tenga en cuenta las HPMC y esferoides de cáncer con un campo brillante o microscopio de fluorescencia y tomar fotos después de 1 h de la perfusión.

Resultados

El uso de este protocolo, una plataforma de microfluidos se creó para modelar esferoides de cáncer de ovario con células mesoteliales en condiciones hidrodinámicas. células mesoteliales peritoneales humanas primarias se cultivaron en el microdispositivo durante 16 h y se observaron bajo un microscopio de campo brillante. Como se muestra en la Figura 2A, el fondo del canal se cubrió con éxito con una monocapa de HPMC. Es importante tener en cuenta que la formación de burb...

Discusión

Este ensayo ofrece un modelo flexible y fisiológicamente relevante que se puede incorporar con diversos ensayos bioquímicos y basados ​​en células, incluyendo, pero no limitado a, los ensayos de adhesión, ensayos de remoción mesoteliales, y la detección de drogas. Se puede aplicar a la evaluación del efecto del microambiente intraperitoneal en la progresión del cáncer. Sin embargo, podría ser necesario optimizar varias condiciones experimentales, dependiendo de los objetivos del proyecto (por ejemplo, el número...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Oblea de silicona	Oblea universitaria	#1196	100 mm
SU-8 2075 fotorresistente	Revelador Microchem
SU-8	Microchem	108-65-6
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silano	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	Polidimetilsiloxano (PDMS) + kit de agente de curado
Punzón de biopsia	Miltex	33-31AA	mm de diámetro
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-002
Tubo de polietileno	SCI	BB31695-PE/5	0,86 mm (diámetro interior)
Jeringa	Terumo
Bomba de jeringa	Bomba de precisión más larga	LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Añadir 2,2 g/L de bicarbonato de sodio
MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Suero fetal bovino (FBS)	Hyclone	SH30068.02
Penicilina/estreptomicina	Invitrogen	15070-063
Solución de tripsina EDTA	Gibco	25300-054	0,05% Tripsina - 0,01% EDTA, rojo
fenol Fibronectina BD humano	354008
Agarosa	Invitrogen	15510-027
5-clorometilfluoresceína diacetato	technologies	C7025	Verde CMFDA
Incubadora 2	SANYO	MCO-18AIC
Centrífuga	Hitachi	CT15RE
Microscopio fluorescente	Nikon		Modelo: 80i o ECLIPSE Ti; software: SPOT
SKOV-3& nbsp;			Donación del Dr. N Auersperg (Universidad de Columbia Británica)