Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

Summary

Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).

Abstract

Hay muchos métodos bien desarrollados para la purificación y el estudio de proteínas individuales y péptidos. Sin embargo, la mayoría de las funciones celulares se llevan a cabo por las redes de interacción complejos de proteínas, que son a menudo difíciles de investigar debido a que su unión es no covalente y fácilmente perturbado por técnicas de purificación. Este trabajo describe un método de estabilización y separación de los complejos de proteínas nativas a partir de tejido no modificado usando electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tejido se carga en un gel de poliacrilamida azul-nativo no desnaturalizante, a continuación, se aplica una corriente eléctrica hasta que la proteína migra una corta distancia en el gel. La tira de gel que contiene la proteína migrado después se escinde y se incubó con los ditiobis de amina reactiva reticulantes reactivos (succinimidil propionato), que estabiliza covalentemente complejos de proteínas. La tira de gel que contiene complejos reticulados se moldea a continuación en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, y tél complejos se separan por completo. El método se basa en técnicas y materiales familiares para la mayoría de los biólogos moleculares, lo que significa que es barato y fácil de aprender. A pesar de que está limitado en su capacidad para separar adecuadamente los complejos extremadamente grandes, y no ha sido universalmente exitosa, el método fue capaz de capturar una amplia variedad de complejos bien estudiados, y es probable aplicable a muchos sistemas de interés.

Introduction

La función celular normal depende de interacciones proteína-proteína ^{1, 2.} Como resultado, las enfermedades humanas son a menudo marcadas por las perturbaciones en el montaje y comportamiento de varios complejos de proteínas ^3. La capacidad de caracterizar tales interacciones es por lo tanto crítico. medios actuales de detección de estas interacciones requieren la purificación de proteínas diana, a menudo seguidas por desplegable de sus socios que interactúan. Convencionales de purificación se lleva a cabo por centrifugación diferencial, precipitación y / o cromatografía

Protocol

1. Preparación del tejido

1. Preparar 10 ml de 4x tampón de muestra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
   NOTA: Esta solución madre se puede hacer de antemano y se almacena a 4 ° C.
2. Diluir 250! L de tampón de muestra 4x en 750! L dH ₂ O que contiene 1x cóctel inhibidor de proteasa comercial. Vortex y se enfría en hielo.
3. Homogeneizar 20 mg de tejido diana en el 1 ml de 1x de hielo frío tampón de muestra BN-PAGE con 30 golpes de un homogeneizador Dounce limpio.
   NOTA: Para este experimento de demostración, el tej....

Results

En este experimento de demostración, multímero-PAGE se realizó en toda lisado de cerebro de rata. Las proteínas resultantes separados se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF), y después se sondaron con anticuerpos contra las proteínas que se sabe que forman complejos. La figura 1 muestra una validación del protocolo por dos medios. En primer lugar, se demuestra que las proteínas reticuladas son escindibles mediante la adición de un agente reduc.......

Discussion

interacciones proteína-proteína son importantes para cada tarea de los seres vivos llevan a cabo. Debido a esto, son objeto de un intenso escrutinio y la investigación. Multímero-página es un nuevo método para capturar, separar, y el análisis de una amplia gama de complejos de proteínas. Hemos demostrado anteriormente su aplicabilidad al estudio de oligimerization de la proteína α-sinucleína asociada a la enfermedad ^11. Sin embargo, es extensible a muchos complejos de proteínas, como se demuestra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
químicos
&épsilon;-Ácido aminocaproico	Sigma	A2504
Acrilamida	Acros Organics	164855000	tóxico.
Acrilamida/bisacrilamida 37,5:1 (solución madre al 40%T)	BioRad	161-0148	Tóxico.
Persulfato de amonio	Sigma	A3678
Anti conejo IgG-HRP de cabra	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Kit de ensayo de ácido bicinconínico	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Albúmina sérica bovina	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Kit de sustrato de quimioluminiscencia	ThermoFisher	24078
Coomassie azul G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Tóxico.
Dimetilsulfóxido	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidilpropionato)	Thermo Scientific	22585
Leche descremada	en polvo LabScientific	M0841
Glicerol	Sigma	G9012
Glicina	Fisher Scientific	BP381-5
Cóctel	de inhibidores de proteasa HaltThermofisher	78430
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144SI-212	Para valoración. Cáustico.
Metanol	Fisher Scientific	A412-4	Para la activación de la membrana de PVDF. Nocivo.
Anti &alfa;-sinucleína IgG monoclonal de conejo	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina	Sigma	T9281
N,N'-metilenebisacrilamida	Acros Organics	16479	Tóxico.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polisorbato 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Membranas de transferencia de fluoruro de polivinilideno	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Cloruro de potasio	Fisher Scientific	P217-3
Fosfato de potasio monobásico	Sigma	P9791
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Thermo Scientific	88265
SDS solución (10% p/v)	BioRad	161-0416
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	BP358-212
Dodecil sulfato de sodio	Sigma	L37771
Fosfato de sodio monobásico	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (tampón de 0,5 M, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (tampón de 1,5 M, pH 8,8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 lector de microplacas	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Centrífuga Microfuge 22R	Beckman Coulter
2 mL homogeneizador
onzas Mezclador de vórtice	Fisher Scientific
Homogeneizador de tejidos ultrasónico	Fisher Scientific	FB120220