El uso de condicionamiento de clásico de Eyeblink rastro para evaluar disfunción hipocampal en un modelo de rata de trastornos del espectro alcohólico Fetal

Resumen

Condicionamiento de clásico de rastro eyeblink (ECC) se utilizó para evaluar aprendizaje dependiente de hipocampo en ratas adultas que fueron administrados a una alta concentración (11,9% v/v) de alcohol durante el desarrollo temprano del cerebro neonatal. En general, los procedimientos ECC son sonidas herramientas de diagnóstico para detectar disfunción cerebral a través de muchos contextos psicológicos y biomédicos.

Resumen

Administraron a las ratas neonatales una relativamente alta concentración de alcohol etílico (11,9% v/v) durante días postnatales 4-9, cuando el cerebro fetal experimenta rápidos cambios organizacionales y es similar a acelerados cambios en el cerebro que ocurren durante el tercer trimestre en los seres humanos. Este modelo de trastornos del espectro alcohólico fetal (FASD) produce daño cerebral grave, mímico la cantidad y el patrón de consumo de concentrado que se produce en algunas embarazadas alcohólicas. Describimos el uso del rastro eyeblink condicionamiento clásico (ECC), una variante de orden superior de aprendizaje, para evaluar la disfunción hipocampo a largo plazo que se ve normalmente en la descendencia de adultos expuestos al alcohol. A los 90 días de edad, roedores fueron quirúrgicamente preparados con grabación y electrodos estimulantes, que medida electromiográfica (EMG) parpadean la actividad del músculo del párpado izquierdo y entregan leve choque posterior para el ojo izquierdo, respectivamente. Después de un período de recuperación de 5 días, experimentaron 6 sesiones de traza ECC para determinar diferencias de aprendizaje entre los exponen al alcohol y las ratas de control. Rastro de ECC es uno de muchos procedimientos posibles de ECC que pueden ser fácilmente modificados usando el mismo equipo y software, que pueden evaluarse diferentes sistemas neurales. Procedimientos ECC en general, pueden utilizarse como herramientas de diagnóstico para la detección de patología neural en sistemas cerebrales diferentes y distintas condiciones que insultan al cerebro.

Introducción

Es bastante difícil imaginar que en la actualidad, con mejores servicios de salud y acceso a ellos, el abuso de alcohol siga siendo un problema de salud global importante. Desafortunadamente, se ha demostrado que una madre embarazada que consume una gran cantidad de alcohol puede tener un hijo con daño cerebral severo y trastornos neurodesarrolladores que duran toda la vida, como es evidente en las personas afectadas por el síndrome alcohólico fetal (SAF)^1,2,3. En mujeres con algún historial confirmado de consumo materno de alcohol, el feto en desarrollo también es susceptible a pequeñas cantidades de alcohol o a diferentes patrones de consumo que producen variaciones en las concentraciones sanguíneas de alcohol. En este último caso, aunque los niños no presenten alteraciones morfológicas o neuroconductuales tan severas como las del SAF, aún pueden exhibir discapacidades cognitivas y trastornos emocionales de por vida que van desde leves hasta graves^3,4. En conjunto, el SAF y las formas menos severas de alteraciones prenatales inducidas por el alcohol constituyen un conjunto de trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF). No sorprende que los TEAF sean completamente prevenibles, pero sorprendentemente, las estimaciones indican que en poblaciones donde el abuso de alcohol es bastante común, siguen siendo la causa no genética principal de discapacidad neural y cognitiva, afectando aproximadamente al 2% y 5% de los niños estadounidenses jóvenes y de países europeos como Francia y Suecia. En cuanto a la incidencia del SAF únicamente dentro de EE. UU., la prevalencia es de 2 a 7 por cada 1.000 nacidos vivos⁵, lo que implica que la incidencia general de los TEAF es mucho mayor que la del SAF.

Estudios de neuroimagen realizados en niños con TRAS han mostrado que presentan anomalías cerebrales, como un cuerpo calloso más delgado⁶, un vermis cerebeloso anterior más pequeño⁷ y un hipocampo más reducido⁸. Estas anomalías cerebrales subyacen a algunas de las alteraciones neurocognitivas a largo plazo observadas en niños con TRAS. Aún no se han determinado con claridad los vínculos exactos que relacionan las variaciones en los cambios cerebrales inducidos por el alcohol materno con las variaciones en el perfil (es decir, tipo, grado) de alteraciones neurocognitivas específicas. Sin embargo, como punto de partida, el hipocampo es un excelente candidato para determinar su susceptibilidad a los efectos del alcohol prenatal. De hecho, los niños con TRAS presentan déficits en comportamientos mediados por el hipocampo, como el aprendizaje de ubicaciones^9,10 y el recuerdo diferido de objetos¹¹.

Los modelos en roedores de los TRAS han demostrado ser invaluables para elucidar los mecanismos que conducen a las alteraciones neurocognitivas observadas en niños con TRAS. Un modelo bien establecido de exposición tipo atracón que hemos adoptado consiste en administrar alcohol a ratas durante los días postnatales 4-9.^12,13, un período en el que el cerebro experimenta una rápida formación de sinapsis y contactos dendríticos, comparable a la semana fetal humana 24 y que se extiende hacia la 3^rd trimestre^14,15,16,17. Este modelo en particular induce una pérdida significativa de neuronas del hipocampo^18,19 y neuronas en muchas otras regiones cerebrales, como el cerebelo^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}, acompañado de severas alteraciones en las funciones cognitivas que abarcan diferentes dominios^21,24,25. La alteración cognitiva provocada por la exposición temprana al alcohol en ratas puede evaluarse de diferentes maneras, particularmente con condicionamiento clásico del parpadeo (ECC). El ECC es un paradigma que se ha utilizado durante más de un siglo para investigar científicamente la base fundamental del aprendizaje.^26,27 y, como tal, proporciona un método útil para comprender mejor las consecuencias neurocognitivas adversas derivadas de la exposición al alcohol durante el período fetal. Es un paradigma muy flexible que permite a los investigadores utilizar una variedad de procedimientos de CCE, cualquiera de los cuales puede examinarse en múltiples especies de mamíferos a lo largo de la escala filogenética (desde ratones hasta humanos) y en diferentes etapas del desarrollo cerebral.^28,29,30,31Además, los circuitos neuronales fundamentales que median el aprendizaje asociativo en este paradigma están respaldados por informes experimentales y neuropsicológicos en estas mismas especies^{26,32,33,34,35,36,37}.

Una forma de CCE, la CCE de traza, se demuestra en este artículo (Figura 1). Para proporcionar contexto, se compara con la forma más tradicional: la CCE de retraso. El paradigma de CCE se modeló a partir del condicionamiento clásico con perros, realizado por primera vez por el fisiólogo ganador del Premio Nobel, Iván Pávlov. Pávlov descubrió que ciertos estímulos, como tonos, no provocan naturalmente la salivación, pero cuando preceden y se superponen con la presentación de alimento, la respuesta salival puede fortalecerse mediante presentaciones repetidas de ambos estímulos, siempre que se mantenga esta contingencia tono-alimento. Este es un ejemplo de CCE de retraso, basado en la idea de que la fuerza asociativa está mediada por la contigüidad temporal inmediata entre ambos estímulos, lo que optimiza las condiciones de aprendizaje para un animal. También probó otras variaciones de la contingencia tono-alimento, como apagar el tono y dejar un período de «traza» antes de entregar el alimento. Cuando ambos estímulos estaban suficientemente discontinuos, resultaba mucho más difícil que los perros emitieran respuestas salivales antes de la entrega del alimento. La discontinuidad entre el apagado del tono y la entrega del alimento constituye así un ejemplo de CCE de traza. Dado que los roedores no salivan naturalmente ante la presencia de alimento, se utilizan en su lugar estímulos más relevantes para la especie, como una descarga leve; además, no emiten naturalmente respuestas defensivas de parpadeo ante los tonos. En este contexto, los procedimientos de CCE en roedores implican presentar un tono a un nivel determinado de decibelios y emparejarlo de alguna manera con una descarga leve, ya sea en el músculo del párpado (orbicularis oculi) o en el músculo temporalis, para provocar una respuesta de parpadeo. El tono se considera un estímulo condicionado (EC), mientras que la descarga se considera un estímulo incondicionado (EI). En la CCE de retraso, primero se presenta el EC; este estímulo permanece activo durante una duración determinada. Posteriormente, se presenta el EI. Ambos estímulos se superponen durante un tiempo específico y luego finalizan simultáneamente; la respuesta de parpadeo resultante provocada por el EI se considera una respuesta incondicionada (RI). En este procedimiento, los roedores aprenden a emitir respuestas de parpadeo algún tiempo después de la presentación del EC, pero justo antes del EI, con el fin de anticipar este estímulo aversivo. La respuesta de parpadeo aprendida se denomina respuesta condicionada (RC). En la CCE de traza, el EC y el EI están separados por un período de tiempo sin estímulos, conocido como intervalo de traza; no se superponen en el tiempo como en la CCE de retraso. Durante este intervalo, el animal debe resolver los requisitos asociativos entre los estímulos. De forma similar a la CCE de retraso, el aprendizaje ocurre cuando el animal emite consistentemente una respuesta de parpadeo después de que el EC se apaga, pero inmediatamente antes de la presentación del EI. Tras cierta cantidad de entrenamiento de adquisición (EC emparejado con EI), se desarrollan curvas de aprendizaje (es decir, basadas en diferentes mediciones de RC). Estudios con lesiones y neuroimagen muestran que el aprendizaje exitoso en la CCE de retraso depende de una circuitría neuroanatómica intacta entre el cerebelo y el bulbo raquídeo^38,39,40, mientras que la CCE de traza es un procedimiento de orden superior que requiere una participación neural adicional del hipocampo^41,42,43,44 y otras estructuras corticales^45,46. Debido a los requisitos temporales necesarios para adquirir con éxito las RC de traza, esta tarea también es más difícil de aprender (incluso para sujetos normales).

Figura 1: Condicionamiento clásico del parpadeo mediante trazado. Se muestra una forma de onda real representativa de una rata adulta en el grupo control sin intubación (UC). Primero se presenta el estímulo condicionado (EC) tono (85 dB, 2,8 kHz) durante 380 ms. A continuación, sigue un intervalo de traza de 500 ms en el que no se presenta ningún estímulo. Posteriormente, se administra el estímulo no condicionado (EIC) de choque (1,6 mA) durante 100 ms. El aprendizaje exitoso en esta tarea ocurre cuando aumenta, a lo largo de muchas sesiones de entrenamiento, la frecuencia (%) o la amplitud (en voltios) de los parpadeos durante la ventana temporal de respuesta condicionada (RC) (período total de RC). En particular, los roedores con un hipocampo intacto suelen emitir más RCs bien temporizadas (RCs adaptativas) justo antes del inicio del EIC de choque (dentro de una ventana de 200 ms). También se miden las respuestas de sobresalto (SR) durante los primeros 80 ms tras el inicio del EC tono y las respuestas no condicionadas (RNC). Las SR no asociativas suelen ser bajas o inexistentes en roedores bien entrenados, mientras que se espera que las RNC presenten alta frecuencia y amplitud. Esta tarea requiere que el roedor aprenda a establecer la asociación entre el final del EC y el inicio del EIC (durante el intervalo de traza), lo que la hace inherentemente más difícil de adquirir en comparación con la ECC de retraso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí demostramos las consecuencias funcionales adversas de la exposición al alcohol en neonatos administrada de manera similar a un atracón, evaluadas mediante un procedimiento de condicionamiento clásico con intervalo (ECC) que presenta un tono de 85 dB (2,8 kHz) como estímulo condicionado (EC) durante 380 ms, seguido por una descarga eléctrica de 1,6 mA como estímulo no condicionado (EIN) que permanece activa durante 100 ms, y estos estímulos están separados por un período de intervalo de 500 ms. Hemos informado previamente sobre la utilidad de este ensayo conductual en estudios anteriores que examinan la intervención con colina y la suplementación con hierro para mitigar los efectos de la exposición al alcohol en neonatos^18,47. De hecho, el ECC con intervalo puede utilizarse como una herramienta diagnóstica para evaluar la patología del hipocampo inducida por el alcohol en neonatos. La ventaja que presenta frente al ECC de retardo es que es más sensible para detectar alteraciones en la función del hipocampo, la cual está comprometida en humanos con trastornos del espectro alcohólico fetal (FASD).

La demostración del CCE se extiende mucho más allá del campo del alcohol fetal. Muchas variantes del CCE (por ejemplo, retraso, traza, compuesto, inversión) pueden utilizarse para elucidar las diferencias ontogenéticas en el aprendizaje a lo largo del desarrollo, la base neurobiológica del aprendizaje asociativo en mamíferos normales, así como las vulnerabilidades de diferentes sistemas cerebrales frente a múltiples desafíos, incluidos (aunque no exclusivamente) teratógenos, toxinas ambientales, lesiones cerebrales traumáticas, enfermedades neurodegenerativas y trastornos psiquiátricos.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las políticas establecidas por el IACUC de la Universidad East Carolina. Las ratas Long-Evans se obtuvieron de hembras apareadas con machos reproductores. Las crías de los tres grupos de tratamiento (véase 1.1) se generaron dentro de una camada procedente de la misma madre. Se produjeron cinco camadas y cada una fue reducida a 8 crías el día postnatal (DP) 3. Las dos crías restantes de cada camada se asignaron a experimentos separados. Tanto descendientes macho como hembra (uno por grupo de exposición) se incluyeron en el estudio. Un total de N = 27 descendientes adultos fueron examinados en este estudio; 3 ratas fueron excluidas debido a cables conductores rotos de 3T (véase 3.1.1) que resultaron irreparables el día 1 del entrenamiento ECC.

1. Preparación de grupos, materiales y soluciones

1. El día de vida 3 (PD 3), retire las crías de la rata madre y colóquelas sobre una almohadilla térmica regulada con agua para mantenerlas calientes. Utilice un procedimiento de selección aleatoria para asignar las crías de rata a uno de tres grupos: (1) intubadas con alcohol (AI); (2) control con intubación simulada (SI); o (3) control sin intubación (UC). Realice procedimientos aprobados para la identificación, como tatuaje con tinta [no tóxica] en sus patas usando una aguja de 30G x 1/2 pulgada, siguiendo un esquema numérico. Devuelva las crías a la rata madre una vez finalizado el tatuaje.
2. Prepare un tubo (o tubos) de intubación intragástrica utilizando polietileno (PE) tamaño 50 y 10. La longitud total de este tubo depende del usuario y puede ajustarse según sea necesario.
   1. Use tijeras de microcirugía para cortar un trozo de 7,6 cm de tubo PE-50 y un trozo de 15,2 cm de tubo PE-10.
   2. Conecte cuidadosamente el tubo PE-50 a una aguja hipodérmica estéril de 22 G x 2,5 cm.
   3. Introduzca un extremo del tubo PE-10 en el extremo abierto del tubo PE-50. Puede ser necesario realizar un corte diagonal en el extremo del tubo PE-10 para facilitar su inserción en el tubo PE-50.
   4. Corte un pequeño trozo de tubo PE-50 (aproximadamente 2-3 mm) e introdúzcalo en el extremo abierto del tubo PE-10. Esto servirá como tope visual.
   5. Guarde el tubo completo de intubación intragástrica en alcohol isopropílico al 70% fresco para mantenerlo estéril.
3. Realice procedimientos asépticos para preparar una solución de leche en botellas de 50 mL. La solución de leche se basa en una fórmula dietética establecida inicialmente por West et al. (1984)⁴⁸. Almacene las botellas a -18 °C hasta su uso. Derrita dos botellas de leche con agua tibia antes de usarlas.
   1. Extraiga 7,16 mL de alcohol etílico al 95% (USP) utilizando una jeringa estéril y añádalo a una botella de leche de 50 mL. Esto produce una solución de alcohol al 11,9% v/v que se administra a las crías de rata durante las dos primeras alimentaciones del día (véase 2.1.1); la dosis diaria total de alcohol es de 5,25 g/kg/día. Está diseñada para administrar el alcohol en un volumen (0,0278 mL/g por alimentación) en solución de leche enriquecida.
      NOTA: Esta cantidad puede ajustarse según el tamaño de la camada y el uso previsto durante 3-4 días. La cantidad de alcohol añadida también debe ajustarse para obtener una solución al 11,9% v/v.
   2. Agite bien esta botella y etiquétela adecuadamente (es decir., Alcohol Etílico al 11,9% v/v en Leche).
   3. Etiquete la segunda botella de leche (sin alcohol añadido) adecuadamente (por ejemplo., Solo Leche) y úsela para alimentaciones suplementarias según se indica en 2.1.1.
   4. Almacene ambas botellas de leche en el refrigerador.

2. Exposición neonatal al alcohol (días postnatales 4-9)

1. Suministrar a las crías AI y SI un total de 4 intubaciones diarias a partir del día posnatal 4. Separar cada intubación por 2 h. Dado que las crías AI son intubadas con una solución real, cada una de sus intubaciones se considera una alimentación.
   1. Intubar a las crías AI con la solución de Alcohol Etílico al 11,9% v/v en Leche durante las dos primeras alimentaciones del día, y luego intubarlas con la solución Solo Leche durante las dos últimas alimentaciones del día para complementar su crecimiento.
   2. Intubar a las crías SI 4 veces sin ninguna solución cada dos horas, asegurando la misma duración de exposición al tubo PE-10 que soportan las crías AI. El grupo UC no recibe ninguna intubación.
2. Separar a las crías de la madre y colocarlas sobre una almohadilla térmica regulada con agua caliente para mantenerlas calientes. Pesar cada cría y registrar su peso corporal (en g). Consultar una tabla de alimentación preelaborada para determinar el volumen de intubación para cada cría AI y anotarlo en una hoja de registro.
   1. Colocar la solución de Alcohol Etílico al 11,9% v/v en Leche en un baño de agua tibia y agitarla bien.
   2. Procedimiento de intubación intragástrica:
      1. Lavar bien el tubo de intubación intragástrica que se almacenó en alcohol isopropílico al 70% con agua tibia.
      2. Extraer la cantidad correcta de solución utilizando una jeringa estéril de 1 mL.
      3. Sumergir la punta del tubo de intubación (extremo PE-10) en aceite de maíz fresco (esto facilita la inserción).
      4. Medir la longitud del tubo PE-10 desde la boca de la cría hasta su estómago. Ajustar el tope PE-50 para guiar el punto de detención.
      5. Insertar cuidadosamente el tubo PE-10 en la boca de la cría, haciéndolo avanzar por el esófago, pasando ligeramente a través del esfínter gastroesofágico y hasta el estómago. Examinar a la cría, estabilizarla y presionar el émbolo de la jeringa para administrar la solución. Hacerlo a un ritmo lento.
         NOTA: Para evitar insertar accidentalmente el tubo en la tráquea, primero dirigir el tubo de manera que se curve y haga contacto con el paladar blando antes de avanzar. Utilizar el paladar como guía, ya que el tubo se desviará naturalmente de esta zona y será dirigido hacia el esófago. De lo contrario, cualquier desviación sustancial de la punta hacia la región ventral podría hacer que ingresara a la tráquea. Es mejor retirar el tubo y no continuar con la intubación si no se está seguro de su posición de entrada; volver a insertar el tubo correctamente en el siguiente intento.
      6. Retirar cuidadosamente el tubo PE-10 y examinar a la cría en busca de reflujo de solución, sangre o lesión física. Devolver a la cría con sus hermanos si se encuentra bien. El procedimiento completo de intubación toma aproximadamente menos de 1 min por cada cría y alrededor de 4 min en total para las 4 crías tratadas con intubación en cada camada (2 AI, 2 SI).
      7. Procedimiento de intubación intragástrica para crías SI: Seguir el mismo procedimiento de inserción del tubo PE-10 que para las crías AI, pero sin ninguna solución y durante la misma duración (1 min).
      8. Devolver inmediatamente todas las crías a la madre tras completar el procedimiento con la última cría de la camada. Devolver a la madre al vivario hasta la siguiente sesión de alimentación (en 2 h).
      9. Lavar el tubo de intubación intragástrica con agua estéril tibia y volver a colocarlo en alcohol isopropílico al 70% para su almacenamiento. Lavar bien el tubo con agua antes de cada sesión de alimentación.
      10. Repetir los pasos del 2.2 (excepto pesar a las crías) al 2.2.2.9 para la segunda sesión de alimentación. En las dos últimas alimentaciones, intubar a las crías AI con la solución Solo Leche, utilizando los mismos volúmenes de intubación determinados en el paso 2.2.
3. Pesar a las ratas a intervalos regulares, como en el día posnatal 15 (cuando abren los ojos), día posnatal 21 (destete), día posnatal 30, día posnatal 60 y día posnatal 90 (cirugía), para obtener curvas de crecimiento representativas.

3. Fabricación y modificación de electrodos

1. Construya un "headstage" electromiográfico (EMG) para cada rata (Figura 2). El headstage permite la grabación de respuestas de parpadeo mediante el sistema de parpadeo (Figura 4).
   1. Construya un headstage que conste de dos alambres de acero inoxidable revestidos con politetrafluoroetileno (PTFE) tamaño 3T (5 cm cada uno), un alambre de acero inoxidable revestido con PTFE tamaño 10T (5 cm), tres pines de contacto macho y un aislante de zócalo micro tipo tira recortado a 3 orificios (véase 3.1.4).
   2. Retire el revestimiento de PTFE del alambre 10T agarrando el centro con una pinza de precisión dentada y retirando el revestimiento en ambas direcciones con la pinza de precisión lisa. Asegúrese de que se hayan eliminado todas las trazas de revestimiento de este alambre.
      1. Engarce un extremo del alambre 10T a un pin de contacto con una pinza dental con plataforma dentada; este servirá como alambre de tierra. Sujete cuidadosamente un alambre 3T con la pinza de precisión lisa a 1-1,5 mm de un extremo. Retire el revestimiento de PTFE de 1-1,5 mm dejando intacto el resto del revestimiento. Engarce un pin de contacto al extremo expuesto del alambre 3T.
      2. Realice los mismos procedimientos con el segundo alambre 3T. Ambos alambres servirán como los electrodos positivo y negativo de las grabaciones de EMG.
   3. Realice pruebas de tracción en todos los alambres para asegurarse de que estén bien fijados a los pines. Tenga cuidado de no doblar ni dañar los alambres.
   4. Corte un segmento de una tira aislante de zócalo hasta 3,5 orificios (corte el centro del cuarto orificio) con la cuchilla de un pelacables. Reduzca este segmento a solo 3 orificios completos y lije ambos lados si es necesario. Esto ayuda a asegurar que estén disponibles 3 orificios completos. Inserte las unidades de pin-alambre en los tres orificios de la tira micro hasta que los extremos engarzados queden alineados con el borde inferior del segmento aislante. El conjunto 10T debe colocarse en uno de los orificios externos de la tira micro, no en el centro.
2. Modifique los electrodos estimuladores bipolares (Figura 2).
   1. Proporcione un electrodo estimulador bipolar a cada rata. Este electrodo aplica una pequeña cantidad de corriente eléctrica mediante un aislador de estímulo (véase sistema de parpadeo) como el estímulo aversivo (US) durante la ECC. Los electrodos se adquieren de un fabricante en forma trenzada y están protegidos.
   2. Destrence los dos conductores metálicos 2-3 veces para formar una forma de V (separados 5 mm) y luego use la pinza de precisión lisa para enderezar cada "punta" lo más posible. Raspe 1 mm del blindaje en la punta de cada punta (en toda la circunferencia) con una cuchilla de afeitar. Inspeccione cada punta en busca de irregularidades y dobleces, y corrija si es necesario sin raspar más blindaje.
3. Elimine el aceite de fabricación y residuos extraños de los headstages EMG y de los electrodos bipolares lavándolos con alcohol etílico al 95 %. Déjelos secar y luego autoclávelos.

Figura 2: Electrodos para la grabación electromiográfica (EMG) y electrodo bipolar. El cabezal EMG terminado (derecha, naranja) se construye con tres pines de contacto macho, dos cables revestidos con PTFE del tamaño 3T, un cable revestido con PTFE del tamaño 10T y una tira micro modificada. Cada uno de los tres cables mide aproximadamente 5 cm y se prensan a los pines de contacto. El electrodo bipolar terminado (derecha, blanco) se desenrosca, se vuelve a enderezar y se moldea en forma de V (separación de 5 mm). Se elimina el blindaje de las puntas de las dos ramas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Procedimiento de cirugía de párpados (día 90 posnatal)

1. Preparación de materiales (ver Materiales para información detallada sobre suministros), animales, áreas quirúrgicas y no quirúrgicas:
   1. Esterilice en autoclave los instrumentos y suministros quirúrgicos; el número entre paréntesis ( ) indica aproximadamente la cantidad necesaria por rata adulta o medición: instrumentos quirúrgicos (1 juego por cada 4 ratas, según aprobación del ECU IACUC), compresas de gasa (3-4), hisopos con punta de algodón (5-6), envoltura 20 x 20 (4 por/sesión quirúrgica), crisol de porcelana (1), espátula microquirúrgica de acero inoxidable (1), solución salina al 0,9 % (1 frasco lavador), placa de Petri (1) y tornillos de acero inoxidable 0-80 (3/rata).
   2. Suministros estériles adicionales necesarios: hoja quirúrgica tamaño 10 (1 por cada 4 ratas), campo quirúrgico (1 por rata), ungüento oftálmico veterinario, povidona-yodo (1 frasco lavador), aguja hipodérmica 26G x 3/8" (2), taladro manual niquelado con broca #55, destornillador plano niquelado para joyería (hoja de 1,8-2 mm).
   3. Prepare un área estéril de contención para todos los instrumentos y suministros quirúrgicos utilizando un desinfectante aprobado de grado médico/científico. Coloque los materiales en este espacio cuando el área esté lista.
   4. Prepare un espacio quirúrgico estéril utilizando un desinfectante aprobado de grado médico/científico. Este espacio incluye una almohadilla térmica regulada con agua caliente, un aparato estereotáxico equipado con máscara de anestesia para rata, un esterilizador de perlas de vidrio y un vaporizador de gas isoflurano (para anestesia). El vaporizador tiene tubos que conectan a la máscara de anestesia y a una cámara de inducción ubicada en un espacio separado para procedimientos no estériles de preparación de animales; cada tubo está controlado por su propia válvula.
   5. Lávese las manos y brazos cuidadosamente con jabón antimicrobiano. Sin tocar el interior, abra previamente cualquier artículo empaquetado en sobres o envolturas de esterilización. Póngase guantes estériles mediante técnica aséptica y transfiera todos los artículos pertinentes al área quirúrgica. Ajuste la profundidad adecuada de la broca en el taladro manual (~ 2 mm) y prepare el destornillador. Cubra los materiales estériles con una envoltura estéril hasta que esté listo para comenzar la cirugía.
   6. Prepare un espacio no estéril con una balanza, cortador eléctrico de pelo, jeringas estériles de 1 mL con agujas 26G x 3/8 in (1 por rata), registro quirúrgico y buprenorfina (concentración de 0,03 mg/mL) administrada a 0,1 mL/100 gramos.
      ADVERTENCIA: La buprenorfina es un opioide semisintético de la lista III de la DEA y debe guardarse bajo llave y registrarse adecuadamente.
   7. Verifique el nivel de gas adecuado en el vaporizador de isoflurano; añada más gas si está bajo. Deje las perillas de flujo y mezcla apagadas por ahora. Encienda el tanque de O₂ y verifique que haya suficiente gas para todas las cirugías.
   8. Pese cada rata y registre su peso corporal en el registro quirúrgico. Utilice una tabla de inyección de buprenorfina para determinar el volumen de inyección adecuado.
   9. Abra la válvula del vaporizador hacia la cámara de inducción y deje cerrada la válvula hacia la máscara quirúrgica. Ajuste la mezcla a 3 y el flujo a 3 (3 % de isoflurano con 100 % de O₂ como gas portador a un volumen de 3 L/min).
   10. Coloque una rata en la cámara de inducción y permita que alcance el plano anestésico adecuado (respiración lenta, ausencia de reflejo podal, ausencia de reflejo de parpadeo). Retire la rata de la cámara una vez que alcance el plano anestésico.
   11. Afeite la cabeza con el cortador de pelo, exponiendo una cantidad suficiente de piel para el sitio de incisión y el párpado izquierdo. Si es necesario, coloque nuevamente al animal en la cámara de inducción para alcanzar el plano anestésico antes de continuar con el afeitado.
   12. Desinfecte la piel expuesta aplicando alternadamente isopropanol y povidona-yodo tres veces. Si es necesario, coloque nuevamente al animal en la cámara de inducción para alcanzar el plano anestésico antes de transferirlo a la mesa quirúrgica.
2. Cirugía
   1. Abra la válvula del vaporizador hacia la máscara de anestesia y cierre la válvula hacia la cámara de inducción. Ajuste la mezcla a 2,5 y el flujo a 2 (2,5 % de isoflurano con 100 % de O₂ como gas portador a un volumen de 2 L/min). Transfiera la rata al aparato estereotáxico y siga los procedimientos estándar para fijar su cabeza a la barra incisiva y a las barras auriculares (véase Geiger et al., 2008⁴⁹ como ejemplo).
   2. Administre a la rata una inyección prequirúrgica de buprenorfina (SC) y deseche cuidadosamente la aguja (sin tapón) en un contenedor para objetos punzantes. Coloque un campo quirúrgico estéril sobre la rata, exponiendo solo el área quirúrgica y aislándola del resto del cuerpo.
   3. Póngase una mascarilla quirúrgica, gorro quirúrgico, bata quirúrgica, gafas y cualquier otro equipo de protección personal requerido por el IACUC. Lávese y frótese cuidadosamente las manos y brazos con jabón antimicrobiano. Póngase guantes estériles mediante procedimiento estéril.
   4. Aplique una pequeña cantidad de ungüento oftálmico a ambos ojos usando un hisopo con punta de algodón para evitar que se sequen.
   5. Proceda con la cirugía cuando la rata muestre el plano anestésico adecuado. Monitoree continuamente a la rata durante toda la cirugía y verifique periódicamente el nivel de isoflurano. Ajuste las perillas de flujo y mezcla según sea necesario durante la cirugía, basándose en la respuesta de la rata a la anestesia.
   6. Realice una incisión anteroposterior en la línea media del cráneo con una hoja de bisturí. Esta incisión debe exponer suficiente área delante de los ojos (es decir, exponiendo el hueso frontal) y ligeramente detrás de la sutura lambdoidea.
   7. Rasque cuidadosamente el periostio en la parte superior del cráneo para no causar hemorragia excesiva. Limpie el exceso de tejido conectivo y sangre con un hisopo con punta de algodón.
   8. Perfore un orificio usando la broca con ayuda del taladro manual, comenzando directamente detrás de la sutura coronal en un hueso parietal. Retire cualquier sangre y restos óseos con un hisopo con punta de algodón. Sujete un tornillo 0-80 por la rosca con pinzas para astillas y fíjelo al orificio con el destornillador para joyería; apriételo lo suficiente sin dañar el tejido cortical cerebral (generalmente 3-4 vueltas completas).
   9. Siga los mismos procedimientos descritos en 4.2.8 para fijar otros dos tornillos 0-80 al cráneo, uno directamente detrás de la sutura coronal del hueso parietal opuesto y otro directamente anterior a la sutura lambdoidea derecha. Se ha encontrado que 3 tornillos son suficientes para anclar el cemento dental (véase 4.2.18) al cráneo, ya que un cuarto tornillo (anterior a la sutura lambdoidea izquierda) impediría la colocación del electrodo bipolar.
   10. Retire un cabezal EMG de la placa de Petri. Oriente el cabezal de modo que el cable 10T quede en el lado derecho de la rata. Doble el cable 10T hacia arriba, haciéndolo paralelo al borde inferior de la microtira. Déjelo ligeramente curvado hacia el lado derecho para que el cable pueda rodear los tornillos 0-80 anterior y posterior. Déjelo apartado pero lo suficientemente cerca para alcanzarlo.
   11. [Suponiendo que se es diestro] Coloque unas pinzas de vendaje de 3 in en la mano izquierda y unas pinzas de vendaje de 4 in en la mano derecha. Sujete la piel superior en el sitio de incisión del ojo izquierdo con las pinzas de vendaje de 4 in y dirija las pinzas de vendaje de 3 in hacia la comisura de este ojo; sujete la piel en esta comisura. Mantenga el agarre con las pinzas de vendaje de 3 in mientras suelta las pinzas de vendaje de 4 in.
   12. Tome una aguja de 26G x 3/8 in e insértela a través de la comisura del párpado; gire la aguja para que el bisel quede hacia arriba. Use las pinzas microdisectoras con plataforma para insertar el cable 3T central en el orificio de la aguja. Empújelo a través del orificio unos centímetros sin introducirlo completamente; este cable es el electrodo negativo.
   13. Realice los procedimientos descritos en 4.2.11 y 4.2.12 para insertar el cable 3T externo en la porción media del párpado; este cable es el electrodo positivo.
   14. Sujete ambas agujas con una mano mientras sujeta el cabezal con la otra mano (o con pinzas). Tire de las agujas alejándolas del párpado mientras guía el cabezal en la misma dirección en un movimiento continuo. Si es necesario, gire el cabezal para que el cable 10T quede hacia el ojo derecho del animal; no permita que los cables 3T se crucen. Use pinzas de punta fina para verificar que el electrodo positivo esté en el centro del párpado.
   15. Ajuste el cabezal para que quede centrado entre los ojos y en una posición óptima sobre el hueso frontal, anterior a los tornillos insertados bilateralmente. Sujete el cabezal con una mano y las pinzas de vendaje de 3 in con la otra mano. Enrolle el cable 10T alrededor de uno o ambos tornillos del lado 10T.
   16. Coloque las pinzas de vendaje de 3 in en una mano y las pinzas de vendaje de 4 in en la otra mano. Use las pinzas de 3 in para sujetar la piel en el sitio de incisión hacia la sien izquierda. Use las pinzas de 4 in para crear un pequeño "bolsillo" separando la piel (es decir, la fascia superficial) del músculo temporal. Use las tijeras de iris para cortar más tejido conectivo, trabajando hacia la comisura del ojo izquierdo, para aumentar el tamaño de este bolsillo. Tenga cuidado de no profundizar demasiado ni cortar vasos sanguíneos.
   17. Tome un electrodo bipolar y modele los cables conductores para que se ajusten a la curvatura del músculo temporal, mientras que las dos puntas queden situadas (dorsal y ventral) posterior al ojo izquierdo (véase el video), y el extremo inferior del electrodo bipolar quede directamente encima del cráneo. Deje suficiente distancia entre el cabezal y este electrodo para que los conectores del cable conmutador (Figura 3) puedan conectarse sin impedimentos.
   18. Vierta el polvo de cemento dental en el crisol: comience con aproximadamente 1/3 del crisol y luego ajuste la cantidad según sea necesario. Añada el componente líquido hasta que la consistencia sea acuosa, y mezcle ambos componentes con la espátula. Cuando la consistencia del cemento se vuelva más viscosa, aplíquelo al sitio de incisión, cubriendo todos los bordes de la piel con un margen de al menos 1/8 in.
       1. Aplique suficiente cemento para reforzar el cabezal y el electrodo bipolar sin impedir que la rata cierre ambos ojos. Limpie rápidamente cualquier cemento que gotee sobre áreas no deseadas del pelaje de la rata.
   19. Asegúrese de dejar al menos 4-5 roscas del electrodo bipolar sin sellar con cemento para que el conector bipolar pueda enroscarse (Figura 3). Retire el exceso de cemento del cabezal: la parte superior de la microtira y los tres pines de contacto deben quedar limpios. El cemento se endurece rápidamente y podría impedir fácilmente el acoplamiento completo de cualquiera de estos electrodos a los conectores del cable conmutador. Use pinzas para astillas para retirar el exceso de cemento que ya se haya secado parcialmente.
   20. Espere a que el cemento se endurezca; se volverá transparente. Use las tijeras microdisectoras para cortar el exceso de longitud de los dos cables 3T, dejando unos pocos centímetros de espacio de trabajo.
   21. Sujete las pinzas microdisectoras con plataforma en la mano izquierda mientras sujeta las pinzas microdisectoras con puntas finas en la mano derecha. Sujete un cable 3T con las pinzas izquierdas ligeramente delante del párpado. Con las pinzas derechas, empuje el párpado hacia arriba para exponer más cable 3T y manténgalo en esa posición. Suelte las pinzas izquierdas y use la mano izquierda para sujetar el cabezal (asegúrese de que esté fijo en este momento). Use las pinzas derechas para retirar parte del revestimiento de PTFE, permitiendo que el cable haga contacto con el músculo orbicularis oculi.
       NOTA: Tenga cuidado de no tirar con demasiada fuerza de un cable 3T, ya que podría desprendérselo del pin de contacto. Si un cable se desprende, no será posible reemplazar el pin de contacto, ya que el cemento endurecido no se soltará libremente del cráneo sin causar fractura ósea.
   22. Realice los pasos descritos en 4.2.21 para retirar el exceso de PTFE del segundo cable 3T.
   23. Sujete las dos pinzas microdisectoras como se indica en 4.2.21 (con plataforma en la izquierda, puntas finas en la derecha). Coloque las pinzas izquierdas ligeramente delante de un cable 3T, dejando espacio para que las pinzas derechas se posicionen directamente delante del párpado. Sujete el cable con ambas pinzas.
       1. Cree un "gancho" manteniendo las pinzas derechas fijas y girando las pinzas izquierdas hacia arriba y alrededor hacia el párpado; hágalo en un solo movimiento. Suelte cuidadosamente las pinzas derechas y luego las izquierdas.
          NOTA: El enganche de los electrodos en los párpados ayuda a minimizar la posibilidad de que rocen la córnea. Esto también reduce la posibilidad de rotura del cable durante cualquier fase de pruebas conductuales. Aunque el enganche no evita completamente que el cable roce la córnea en todos los animales, generalmente no muestran signos de daño ocular, como lo reflejan sus altas amplitudes de parpadeo (medidas por el osciloscopio digital en 5.1.7) y las observaciones diarias de salud postquirúrgica (lagrimeo excesivo, cierre parcial del párpado, falta de movilidad por daño ocular). Si una rata muestra signos iniciales de incomodidad, se anestesia con isoflurano (véase 4.1.10) y se examinan y/o reposicionan sus electrodos. Se aplica ungüento oftálmico para prevenir el secado de la córnea. La rata se observa diariamente por posibles complicaciones oculares postprocedimiento y, si persisten, se debe buscar atención veterinaria. Las ratas que presenten complicaciones oculares graves que no puedan corregirse con el reposicionamiento de los electrodos o con tratamiento veterinario, se eutanizan humanamente según los procedimientos operativos estándar del ECU IACUC.
   24. Realice los pasos descritos en 4.2.23 para el segundo cable 3T. Corte el exceso de cable con las tijeras microdisectoras.
   25. Use una mano para liberar a la rata de las barras auriculares mientras sostiene su cuerpo con la otra mano. Inspeccione su cabeza en busca de sangre o restos, límpiela si es necesario y adminístrele una inyección postoperatoria de buprenorfina.
   26. Coloque la rata en un recipiente de recuperación que tenga una fuente de calor (como una almohadilla térmica regulada con agua caliente) para facilitar la recuperación. Registre la hora de finalización de la cirugía en el registro quirúrgico y anote cualquier observación pertinente sobre la rata durante la cirugía. Monitoree a la rata para verificar una respiración adecuada y, cuando muestre recumbencia esternal o se mueva, puede devolverse a su jaula de origen.
   27. Reesterilice los instrumentos (excepto las pinzas microdisectoras, ya que podrían dañarse) usando el esterilizador de perlas y asegúrese de que el área quirúrgica permanezca aséptica, y repita los procedimientos asépticos si se realizarán múltiples cirugías en los párpados.

5. Procedimiento de Condicionamiento Clásico de Parpadeo por Trazado

Figura 3: Caja modificada de condicionamiento operante para el condicionamiento del parpadeo. Las ratas son mamíferos de movimiento libre, por lo tanto se utiliza un conmutador rotatorio para mantener el contacto de la señal eléctrica proveniente de los enchufes de EMG y bipolares que están sujetos a la cabeza. El conmutador está conectado al brazo del soporte, que está contrapesado para aliviar la presión sobre la rata. Un altavoz piezoeléctrico emite un tono de 2,8 kHz a 85 dB, y estos valores se calibran regularmente. La espuma acústica ayuda a atenuar el ruido ambiental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Sistema de condicionamiento del parpadeo. Este sistema construido a medida consta de una unidad integradora de EMG que filtra y amplifica las señales entrantes de las ratas, una unidad de control de estímulos que proporciona diversos estímulos además de tonos y choques, un preamplificador para cada caja operante para aumentar la ganancia de la señal de EMG y un aislador de estímulo para cada caja operante; proporciona niveles variables de choque (en mA). Un osciloscopio digital (no incluido en el sistema estándar de parpadeo) se utiliza con fines de diagnóstico durante la habituación y la adquisición. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Comience la habituación y el entrenamiento de adquisición 5 días después de la cirugía. Someta a cada rata a un día de manejo y habituación al aparato de entrenamiento, que consiste en una caja de condicionamiento operante modificada alojada en una cámara atenuadora de sonido más grande (Figura 3), seguido de 6 días de entrenamiento de adquisición. Realice las sesiones de habituación y adquisición utilizando un sistema personalizado de parpadeo ocular (Figura 4).
   1. Cree un archivo de registro de entrenamiento e imprímalo para usarlo en el control diario. Este registro debe tener asignado previamente, de forma pseudoaleatoria (o mediante otro método de aleatorización), el grupo de ratas a sus cajas de entrenamiento.
   2. Encienda el sistema de parpadeo ocular, la computadora y ejecute el software de parpadeo ocular. Esta versión del software tiene diferentes módulos (o aplicaciones) que funcionan de forma independiente. Ejecute el módulo Animal para crear un archivo *.RAT que contenga información del sujeto (número de sesión, identificación del animal, sexo, peso y número de caja). Un solo archivo RAT gestiona hasta cuatro ratas, lo que constituye un grupo de sujetos. Ingrese los valores correspondientes y guarde el archivo. Cree un archivo RAT independiente para cada grupo de ratas que se entrenará.
   3. Transfiera las ratas desde su vivario hasta la sala de pruebas y cierre la puerta. Manipule cada rata durante 5 min.
   4. Transfiera una rata a su caja designada y conecte los conectores EMG y bipolares del cable del conmutador a la etapa EMG y al electrodo bipolar correspondientes en su cabeza.
      NOTA: En la primera exposición al cable del conmutador, una rata puede resistirse y mostrar signos de estrés. Manipule la rata con cuidado y permita pausas entre intentos fallidos de conexión para aliviar su estrés.
   5. Utilice un conmutador que gire 360° mientras mantiene la transmisión/recepción de la señal eléctrica mientras la rata se mueve libremente dentro de la caja. Tiene 5 canales (3 para los electrodos EMG, 2 para los electrodos bipolares) que conducen a la unidad integradora EMG, que filtra y amplifica la señal cruda.
   6. Verifique que la rata se mueva libremente y que no esté impedida por el peso del ensamblaje del cable del conmutador o del brazo del soporte. Ajuste el contrapeso en la parte trasera del soporte si es necesario. Compruebe que todos los conectores estén seguros y luego cierre la puerta de la caja. Realice el mismo procedimiento de conexión/verificación para todas las ratas.
   7. Utilice un osciloscopio para observar su actividad EMG en busca de señales anormales (por ejemplo, actividad eléctrica de alta frecuencia y/o alta amplitud) y un sistema de videovigilancia para verificar su estado (por ejemplo, actividad motora, sensibilidad al entorno, signos de dolor), si está disponible. Anote cualquier problema observado en el registro de entrenamiento.
   8. Permita que las ratas se habitúen a sus cámaras durante 10 min y luego devuélvalas a sus jaulas de origen.
   9. Limpie y desinfecte las cajas operantes, barra el suelo y limpie la(s) mesa(s). Realice estos procedimientos después de cada sesión.
2. El entrenamiento de adquisición se lleva a cabo durante 6 días consecutivos (sesiones).
   1. Día 1: Transfiera una rata a su caja designada y conecte los conectores EMG y bipolares del cable del conmutador a la etapa EMG y al electrodo bipolar correspondientes en su cabeza. Realice los mismos procedimientos indicados en 5.1.6 y 5.1.7.
   2. Encienda los aisladores de estímulo y configure la corriente para que se entregue a 0.4 mA (4 % de 10 mA, como se muestra en el video). Los aisladores entregan corriente eléctrica de forma alterna (es decir, de ensayo a ensayo), entre las puntas dorsal y ventral del electrodo bipolar. Esto ayuda a reducir la fatiga de las fibras musculares (en cada sitio muscular) durante entregas repetidas del estímulo.
   3. Observe todas las respuestas de parpadeo emitidas y las tolerancias mostradas en cada ensayo para todas las ratas. Después de cada segundo ensayo, aumente la intensidad del estímulo aversivo (US) en 0.4 mA para cada rata, hasta alcanzar 1.6 mA (en los ensayos 7 y 8). Verifique que todas las ratas respondan normalmente en sus cajas, que todos los ajustes de amplificación y ganancia sean constantes, y que las señales eléctricas sean adecuadas (es decir, bajo ruido EMG o poco ruido). Utilice una intensidad de estímulo aversivo de 1.6 mA durante todos los días de entrenamiento de adquisición.
      NOTA: Si una rata muestra dolor ante un nivel determinado de choque (por ejemplo, saltar alto desde el suelo, trepar por las paredes, correr), se pausa el ensayo y se devuelve a la rata al valor anterior de mA (0.4 mA por debajo) durante dos ensayos. Posteriormente, se vuelve a aplicar el valor de choque más alto que no toleró, y si muestra tolerancia, se continúa aumentando hasta alcanzar 1.6 mA. Si no tolera ningún valor, entonces se utiliza durante todo el entrenamiento el valor inferior más cercano (en incrementos de 0.4 mA) en el que sí muestre tolerancia.
   4. Utilice un osciloscopio para observar su actividad EMG en busca de señales anormales (e.g., actividad eléctrica de alta frecuencia y/o alta amplitud) y un sistema de videovigilancia para verificar su estado (e.g., actividad motora, sensibilidad al entorno, signos de dolor).
      NOTA: Explicación del ECC de trazo: Un período representativo de ensayo con formas de onda EMG capturadas se ilustra en Figura 1 y el procedimiento de ECC de trazo se explica en detalle en el video. El archivo de entrenamiento de condicionamiento de trazo está configurado para entregar 100 ensayos (90 ensayos emparejados CS-US y 10 ensayos con solo CS cada 10^º ensayo), con un intervalo promedio entre ensayos de 30 segundos. La sesión completa de entrenamiento dura aproximadamente 52 min (suponiendo que no haya pausas). Todas las ratas son novatas en la Sesión 1 y desarrollarán curvas diferenciales de aprendizaje (determinadas por la expresión de RC) a medida que avancen durante varios días de entrenamiento.
   5. Comience el entrenamiento: Ejecute el módulo de software Blink. Cuando se le solicite, seleccione el archivo RAT correcto y el archivo de entrenamiento para el condicionamiento de parpadeo ocular de tipo "trazo".
   6. Anote la hora de inicio y el nombre del experimentador en el registro de entrenamiento. En este punto, supervise toda la actividad: señales EMG adecuadas, buenas respuestas de parpadeo al estímulo aversivo (es decir, URs altas/frecuentes), estado de salud de los animales y funcionamiento correcto del hardware. Anote cualquier observación relevante en el registro de entrenamiento.
   7. La recopilación de datos se realiza automáticamente mediante el software como archivos RAW (uno por rata, por día). Los archivos RAW contienen amplitud EMG (en voltios), conteos de frecuencia, latencia y datos de área para las respuestas de sobresalto (SR), URs y RCs (totales y adaptativas). El artefacto de choque oculta los primeros 100 ms del período de UR, por lo tanto, solo los últimos 140 ms del período de UR contienen datos de UR.
   8. Al finalizar el entrenamiento, el software se cerrará automáticamente. Retire todas las ratas de sus cajas de entrenamiento y devuélvalas a su vivario.
   9. Repita los pasos 5.2.5 - 5.2.6 para todos los días de entrenamiento posteriores. Antes de iniciar el módulo Blink en un día determinado, actualice el número de sesión dentro del archivo RAT. Esto permite la creación de nuevos archivos RAW para todas las ratas ese día. Cada rata debe tener 6 archivos RAW, suponiendo que ninguna haya sido retirada del entrenamiento.
3. Procese los archivos RAW y cree un archivo filtrado para el análisis estadístico.
   1. Ejecute el módulo de Análisis. Revise cada sesión para cada rata, ensayo por ensayo, en busca de ensayos problemáticos. Esto se realiza para detectar ensayos que puedan estar comprometidos por diversas razones (e.g., actividad excesiva en la línea base previa al CS, movimiento excesivo, desprendimiento del electrodo, problemas con cables o alambres). El software dispone de algoritmos que ayudan al experimentador a detectar y eliminar los "ensayos malos" del conjunto de datos filtrado.
   2. Importe los datos filtrados a un programa de hoja de cálculo y realice los análisis estadísticos pertinentes.

Resultados

El software del eyeblink es capaz de proporcionar un conjunto de datos grande y amplio para muchos tipos de mediciones. Por brevedad, se reporta en este estudio, representante de resultados para el aprendizaje y rendimiento medidas adaptativa porcentaje de CR, amplitud CR adaptable, porcentaje de UR y amplitud de UR. El período adaptativo de CR fue elegido ya que representa la adquisición de eyeblink oportunas respuestas sobre entrenamiento repetido, como resultado de la mayor plasticidad sináptica en el hipocampo durante el rastro ECC^50,51,52. Las medidas de UR fueron escogidas para dilucidar si los déficits de aprendizaje neonatal inducida por el alcohol en trazan ECC fueron debido a trastornos en el aprendizaje asociativo o interrupciones en la respuesta al choque en nosotros - lo cual podría indicar diferencias motivacionales o motor, en lugar de las diferencias de aprendizaje entre grupos de tratamiento. Datos para cada medida se analizaron 2 (sexo) x 3 (Neonatal Group) x 6 (sesión) mezclado ANOVAs, con período de sesiones como el factor de medidas repetidas. Efectos principales significativos para el tratamiento de neonatal se analizaron usando pruebas post-hoc de Tukey e interacciones significativas se analizaron mediante pruebas de efectos simples. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando un mínimo nivel alfa de 0.05 y los resultados en gráficos son media ± SEM.

A partir de la medida de porcentaje de CR adaptable, el ANOVA indicaron un efecto principal significativo de grupo neonatal, F(2,21) = 11.69, p < 0.001, pero ningún efecto principal significativo del sexo (p = 0.71) o interacción significativa entre estos factores (p = 0,20). Como se esperaba, adaptación porcentaje CR aumentó durante las seis sesiones de entrenamiento, F(5, 105) = 81.15, p < 0.001 y las diferencias entre los grupos neonatales dependían de algún nivel de sesión, F(10, 105) = 4.58, p < 0.001. No había ninguna otras interacciones significativas con el factor de la sesión. Además de amplitud adaptativa de CR, otra vez hubo un efecto principal significativo de grupo neonatal, F(2,21) = 22.32, p < 0.001, pero ningún efecto principal significativo del sexo (p = 0.21) o interacción significativa entre estos factores (p = 0.48). Amplitud de CR también aumentó significativamente con las seis sesiones de entrenamiento, F(5, 105) = 59,27, p < 0.001 y las diferencias entre los grupos neonatales dependían de algún nivel de sesión, F(10, 105) = 4.31, p < 0.001. En general, ambas medidas CR mostraron diferencias significativas entre el grupo de medios y estos medios separados considerablemente en diferentes sesiones de entrenamiento. Para confirmar que los grupos difieren significativamente, pruebas post-hoc de Tukey demostraron que las ratas (AI) intubados alcohol realizaron significativamente peor en ambas medidas de CR que el unintubated de control (UC) y ratas (SI) sham intubados (p < 0.01 para el porcentaje de CR; p < 0.001 para amplitud de CR), que no difirieron entre sí (p> 0.05). Efectos simples pruebas realizadas en el grupo Neonatal x interacciones sesión ambas medidas CR, confirmada que las ratas AI fueron significativamente más deterioradas en la adquisición de CRs iniciando a las 2 de la sesión y realizar en la sesión 6 en comparación con ratas UC y SI (todos p< 0.05), que no difieren unos de otros a lo largo de seis sesiones. La única excepción era amplitud CR adaptable para las ratas SI no comenzó a difieren significativamente de las ratas de AI hasta sesión 3. Estos resultados se muestran en la figura 5A, 5B.

No hubo diferencias significativas en las medidas de UR debido a sexo, grupo de Neonatología o las interacciones de estos factores con el factor de la sesión. Estos resultados negativos indican que cada grupo era capaz de emitir respuestas eyeblink al choque nos igual, y que los déficits de aprendizaje observados en las ratas de AI no fueron influyeron por las diferencias motivacionales o motor de centelleo (figura 6A, 6B).

Figura 5 : Adquisición de rastro condicionado respuesta (media ± SEM). La exposición temprana de alcohol (Grupo IA) había afectada significativamente la adquisición de porcentaje de adaptación respuesta condicionada (CR) (A) y amplitud (B). Traza ECC es inherentemente difícil de adquirir, por lo tanto las medidas son relativamente más bajas para todos los grupos - con retraso ECC, porcentajes pueden llegar a 80-85% en modelos de roedores de FASD^21,53. Sin embargo, el rastro, el procedimiento ECC es más impuestos en el hipocampo, que es susceptible a los efectos del alcohol durante el desarrollo temprano del cerebro. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 entre UC y AI ratas; tamaños de muestra se encuentran en paréntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Adquisición de respuestas de unconditioned (media ± SEM). Rendimiento del eyeblink (porcentaje de UR y amplitud de UR) no fue significativamente diferente entre los grupos. La falta de diferencias indican que la intensidad de choque utilizada durante el entrenamiento de la adquisición no alteró diferencialmente motivación en las ratas de AI o su capacidad de producir defensiva parpadear las respuestas al choque, en comparación con ambos grupos de control (UC y SI). Tamaños de muestra se encuentran en paréntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Crías de rata neonatal que recibieron alcohol etílico durante días postnatales 4-9 exhibieron rastro eyeblink acondicionado debilitaciones en la edad adulta. Estos resultados apoyan la idea que el alcohol es un teratógeno con aguantar efectos perjudiciales en la función hippocampal. En general, condicionada respuesta en el procedimiento de seguimiento fue menor en las ratas expuestas al alcohol en comparación con las ratas en ambos grupos de control. Las debilitaciones de aprendizaje asociativo en las ratas expuestas al alcohol no fueron influenciadas por las diferencias de motivación o motor (es decir., no hubo diferencias en parpadear a intensidad de choque U.S.).

Mientras que rastro ECC es una herramienta diagnóstica útil para desdoblamiento neuropatología hipocampo inducida por el desafío, los resultados de este método deben colocarse en el contexto adecuado. En primer lugar, los elementos procesales fundamentales en esta demostración implicó la entrega específica de alcohol durante un período conocido de vulnerabilidad para el cerebro en desarrollo, fabricación de hardware de electrodo que permite la grabación de la actividad electromiográfica y ofrece golpes, implante quirúrgico del citado hardware y prueba animal subsecuente usando un paradigma de aprendizaje que evalúa una función cognitiva de interés. En cada etapa del proceso, se debe tener cuidado para no causar daño innecesario/involuntario a los roedores sujetos y para monitorear sus señales de salud regularmente. Los resultados conductuales proporcionan la "ventana" a cognición, un constructo psicológico que sólo está exactamente descrito cuando su salud no se vea comprometida por los errores experimentales que abarcan dosis de alcohol, defectos de hardware o implantación quirúrgica. Así, cada elemento procesal en el proceso de investigación debe ser aplicado de una manera sana con el fin de asegurar que los resultados de ECC se pueden extrapolar a los resultados en los seres humanos. En segundo lugar, el paradigma de la ECC proporciona una idea sobre la naturaleza del aprendizaje asociativo, pero debe procurar no extender resultados con este enfoque y ampliamente los atribuyen a otros dominios cognitivos - como memoria de trabajo, memorias de corto/largo plazo y la conciencia - a menos que uno ha incorporado algunas facetas de estos dominios dentro de un estudio ECC de diseño experimental. Por ejemplo, esta demostración había examinado de la fase de adquisición del aprendizaje de ECC de rastro, pero no examinaron la retención de memoria en las ratas después de completado el entrenamiento. Memoria es un proceso psicológico independiente que debe ser evaluado además de aprendizaje. Por su diseño, uno puede incorporar un intervalo de retención de memoria para evaluar o capacidad de la memoria a corto plazo o a largo plazo. En tercer lugar, el reconocimiento que hay memoria paralelo sistemas⁵⁴ que pueden funcionar simultáneamente junto con los factores motivacionales, vivenciales y hormonales que contribuyen al comportamiento, es esencial para entender que es la asociatividad (durante ECC) pero uno de los muchos procesos que revelan lo que es "bueno" o "pobre" sobre el aprendizaje. Por último, traza ECC no es una tarea puramente hipocampo dependientes, como otras regiones del cerebro pueden mediar algún componente de la CR. Por lo tanto, una comprensión de las interacciones entre diferentes circuitos neuronales o del tipo de los parámetros de estímulo que se utilizan en un estudio, debe tenerse en cuenta al hacer implicaciones en base a resultados discretos. El cerebelo, por ejemplo, también contribuye al rastro ECC, donde influye en las características topográficas de la CR y CR tiempo, particularmente cuando el ISI es corto en duración. Rastro de ECC no se ve afectado en los seres humanos con daño cerebeloso que se prueban con un intervalo largo rastro (1.000 ms), pero se ve afectado en aquellos que reciben un seguimiento más corto intervalo (400 ms)³⁴. Además, lesiones bilaterales de la corteza prefrontal medial dorsal (mPFC) dirigidos a las regiones agranular anterior del cingulate y medial en ratones, evitar la adquisición de rastro CRs⁵⁵, mientras que la destrucción del mPFC caudal en conejos produce similares resultados⁴⁶. Estos resultados también destacan la importancia de considerar las diferencias especies de contribuciones prefrontales cerebelosa cerebro tallo por aprendizaje asociativo, como rastro ECC. Mientras que la exposición neonatal alcohol durante la adquisición de 4-9 afectado PD de CRs de traza de 500 ms para adulto ratas en este estudio y otros^47,56, no es el mismo caso para las ratas expuestas al alcohol neonatales que experimentar un intervalo de seguimiento de 300 ms, incluso cuando en una relativamente alta dosis de alcohol (5 g/kg)⁵⁷, sugiriendo que la debilitación de la traza en las ratas expuestas al alcohol depende de la duración del intervalo del rastro.

En este estudio, el hipocampo se destacó como ser vital importancia para mediar rastro ECC y cuando por la exposición neonatal alcohol, exposiciones daño neural relacionado como se refleja por deficiencias en la adquisición de traza CRs. Debe advirtió, sin embargo, que el circuito cerebelo-cerebro de vástago, particularmente el núcleo interpositus, es esencial para muchas facetas de la ECC, incluyendo la adquisición, la expresión y características topográficas de la CR, dependiendo del tipo de tarea ECC incluyendo rastro ECC^{36,40,55,58,59}. De hecho, este circuito neural interactúa con el hipocampo para la conducción de la expresión de CRs en formas de orden superior de ECC, como rastro ECC⁶⁰. No está completamente claro si exposición de alcohol durante el desarrollo temprano del cerebro específicamente afecta la función hipocampal en el rastro ECC. Muchas regiones diferentes del cerebro son vulnerables al insulto de alcohol temprano, incluyendo el mPFC, el cerebelo y el hipocampo^{18,19,23,47,61,62}, y es muy probable que el alcohol altera el funcionamiento de estas estructuras en diferentes grados y diversos, pero funcionalmente importantes diferencias en muchos procedimientos ECC. A pesar de las dificultades sobre la interpretación de los resultados de estudios ECC de rastro, adquisición de rastro CRs ha demostrado depender menos de un hipocampo intacto, apoyada por lesión animal estudios^{42,44,63,64,65}. Así, este procedimiento sigue siendo un enfoque altamente valioso para demostrar los vínculos entre la exposición del alcohol del desarrollo trazar acondicionado responder porque el circuito neural subyacente, es mucho mejor entendían que la de otras tareas de dependiente del hipocampo, como lugar de aprendizaje en el laberinto de agua de Morris, reconocimiento de objetos nuevos y contextual y miedo acondicionado.

ECC como forma de conducta a la cognición, del "análisis" tiene amplia aplicabilidad en el campo de desarrollo neuroteratology. De hecho, hallazgos recientes de nuestro laboratorio apoyan la noción que el hipocampo en desarrollo es altamente sensible a los efectos del alcohol, que pueden ser mitigados por diferentes estrategias intervencionistas^18,47. El beneficio clave aquí es que con una mejor comprensión de los déficits de aprendizaje ECC rastro inducida por el alcohol, pueden ser predictivos de otros problemas en funciones basadas en el hipocampo fuera aprendizaje asociativo - particularmente los conocidos ser mediado por el neurocircuitry hipocampo mismo.

Aplicación de seguimiento ECC y sus otras variantes (por ejemplo, demora, reversión, discriminación, compuesta) para dilucidar los mecanismos neurobiológicos y sistemas neurales implicados en el aprendizaje asociativo, se puede extender más allá del campo de la investigación del alcohol en el feto. Por ejemplo, este paradigma ha recibido mucha atención en casos humanos y modelos animales de enfermedades psiquiátricas como esquizofrenia^66,67, enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer^68,69, drogas de abuso^70,71,72. Sus ventajas como método de investigación para evaluar la disfunción y función neurocognitiva así son evidentes a través de muchas disciplinas psicológicas y biomédicas, incluyendo la neurociencia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
alcohol neonatal
190 Proof (USP)	Pharmco-AAPER	225-36000 [Almacén médico de la ECU]	Puede ser sustituido; debe ser USP; evite el uso de alcohol etílico de 200 grados
Contenedor/Cesta para cachorros	Cualquier
aceite de maíz	Cualquier		alimenticio
Bomba de terapia de agua calentada con Almohadillas	Gaymar	TP-500	Para mantener calientes a los cachorros; puede ser sustituido
Agujas hipodérmicas de 22 G x 1 pulg., estériles	Cualquier
aguja hipodérmica de 30 G x 1/2 pulg., estériles	Cualquier
alcohol isopropílico 70%	EMD Millipore	PX1840-4 [Fisher Scientific]	Se puede sustituir; grado de reactivo www.fishersci.com
Ratas Long-Evans (reproductoras femeninas y masculinas)	Charles River Laboratories	N/A [Departamento de Medicina Comparativa de la ECU]	Es necesario especificar la edad y el peso; el precio varía según estos factores www.criver.com
Micro Tijeras de disección, 3,5 pulgadas, 23 mm Hojas Instrumentos de	investigación biomédica	11-2200	Para cortar tubos de PE brisurgical.com
Tubo de polietileno 10 (0.011 pulg. Documento de identidad; 0.024 pulg. D.O.)	BD Diagnostic Systems	22-204008 [Fisher Scientific]	Se puede sustituir www.fishersci.com
Tubo de polietileno 50 (0.023 pulg. Documento de identidad; 0,038 pulg. D.O.)	BD Diagnostic Systems	22270835 [Fisher Scientific]	Puede ser sustituido www.fishersci.com
Calentador de agua regulado o calentador de biberones	para bebés Cualquiera		Opcional; Ayuda a calentar soluciones de leche fría
Jeringas de Tuberculina, Estériles, 1.0 ml	Cualquiera Jeringas
de Tuberculina, Estériles, 10 ml	Cualquiera		Se puede usar para extraer alcohol etílico o usar una micropipeta de tamaño adecuado
Báscula de pesaje	Cualquiera		Debe tener buena resolución (en unidades de gramos)
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>EMG Fabricación de escenario de cabeza y electrodo bipolar Modificaciónbipolar fuerte
, 2 canales SS Twisted	Plastics One, Inc.	MS303/2-B/SPC  ELEGIR SS  2C TW .008"	Debe especificar una longitud personalizada de 20 mm debajo del pedestal www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Insulator (aka, Micro Strip)	ITT Cannon / ITT Interconnect Solutions	CTA4-IS-60* o CTA4-1S-60*	*Depende del proveedor; consulte www.onlinecomponents.com o www.avnetexpress.avnet.com
Alicates dentales, dentados	CMF Medicon	390.20.05	Se puede sustituir; se puede sustituir; se usa para engarzar cables a los pines de contacto macho www.medicon.de
Micro Tijeras de disección, 3.5 pulgadas, 23 mm Cuchillas Instrumentos de	Investigación Biomédica	11-2200	Solo úselo para cortar cables de 3T; cortar cables de 10T dañará la cuchilla - use la cuchilla del pelacables en su lugar brisurgical.com
Alambre de acero inoxidable recubierto de PTFE, 10T (diámetro desnudo .010 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS10T	www.sigmundcohn.com
Alambre de acero inoxidable recubierto de PTFE, 3T (diámetro desnudo 0.003 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS3T	www.sigmundcohn.com
Hoja de afeitar	Cualquiera		Para pelar 1 mm de las puntas del electrodo bipolar
Pin de contacto de enchufe Relia-Tac,	interconexión Cooper	220-P02-100	Ver Allied Electronics Cat # 70144761 www.alliedelec.com
Pinzas, Alta Precisión, Dentadas, 4 3/4 pulgadas	Microscopía Electrónica Ciencias	78314-00D	Para sujetar firmemente el alambre de 10T mientras se pela PTFE con pinzas lisas www.emsdiasum.com
, Alta Precisión, Liso, 4 3/4 pulgadas	Ciencias de la Microscopía Electrónica	78313-00B	www.emsdiasum.com
Pinzas, Puntas Ultrafinas, 4 3/4 pulgadas	Ciencias de la Microscopía Electrónica	78510-0	Para pelar 1 mm de PTFE de un extremo del cable 3T; agarre la parte blindada con pinzas lisas www.emsdiasum.com
Pelacables, 16-26 AWG	Cualquiera		Utilice el extremo de la cuchilla para cortar micro tiras
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>Cirugía de párpados
Instrumentos quirúrgicos (acero inoxidable de alta calidad)
2 x Pinzas de vendaje, 4 en dentado	Instrumentos de investigación biomédica	30-1205	Se pueden sustituir; Pinzas adicionales para agarrar electrodos/tornillos fuera de la bandeja de cirugía brisurgical.com
Pinzas de apósito, 3 pulgadas dentadas	Instrumentos de investigación biomédica	30-1200	Se puede sustituir brisurgical.com
Bandeja de instrumentos	Instrumentos de investigación biomédica	24-1355	Se puede sustituir brisurgical.com
Mango de cuchillo n.º 3, 5 en	instrumentos de investigación biomédica	26-1000	Se puede sustituir brisurgical.com
Micro Pinza de Disección, 3.5 in, Puntos Finos	Instrumentos de Investigación Biomédica	10-1630	Se puede sustituir brisurgical.com
Micro Pinza de Disección, 3.5 in, Plataforma Lisa (0.3 x 5 mm)	Instrumentos de Investigación Biomédica	10-1720	brisurgical.com
Micro Tijeras de Disección, 3.5 pulgadas, Extremadamente Delicadas, Hojas de 15 mm Instrumentos de	Investigación Biomédica	11-2000	Se puede sustituir brisurgical.com
Pinzas de astillas lisas, 3.5 in	Instrumentos de investigación biomédica	30-1600	Puede ser sustituido brisurgical.com
#10 Cuchilla quirúrgica de acero inoxidable para mango #3, estéril	cualquiera		Puede ser sustituido
0-80 x 0.125 en tornillos de acero inoxidable Plastics	One, Inc.	0-80 x 0.125	Puede ser sustituido www.plastics1.com
Almohadillas de preparación con alcohol, estériles	Fisher Scientific	22-363-750 [Fisher Scientific	Puede ser sustituido www.fishersci.com
Betadine Povidone-Iodine Purdue	Frederick Co.	6761815101 [Fisher Scientific]	Puede ser sustituido www.fishersci.com
Almohadillas de preparación de povidona yodada Betadine	Moore Medical	19-898-946 [Fisher Scientific]	Puede ser sustituido www.fishersci.com
Hisopos con punta de algodón, esterilizables en autoclave	Cualquiera		Por lo general, 7,6 cm o 15,2 cm de longitud
Broca para tornillo de banco, #55 (0,052 pulgadas)	Cualquier		metal debe resistir la oxidación y la corrosión
Almohadillas de gasa, 2 pulgadas x 2 pulgadas	Fisher Scientific	22-362-178 [Fisher Scientific]	Se puede sustituir www.fishersci.com
Guantes de látex/nitrilo/vinilo de uso general	Cualquiera
Esterilizador de perlas de vidrio	Cualquiera		Esterilizar instrumentos entre cirugías
Bomba de terapia de agua caliente con almohadillas x 2	Gaymar	TP-500	Se puede sustituir; se recomiendan bombas separadas: 1 para cirugía, 1 para recuperación
Agujas hipodérmicas de 26 G x 3/8 pulgadas, estériles	cualquier
isoflurano	Vedco	NDC 50989-150-12	El fabricante puede ser sustituido; Es posible que se requiera aprobación veterinaria
Sistema de vaporizador de isoflurano, de mesa, que no rerespira	V3000PK Scientific de Parkland		Puede ser sustituido www.parklandscientific.com
Jewelers Destornillador con hoja de 1,8-2 mm	Cualquier		metal debe resistir la oxidación y la corrosión
Paquete Ortho-Jet BCA (Cemento Dental)	Lang Dental	B1334	Contiene polvo (1 lb) y líquido www.langdental.com
Tanque de oxígeno con regulador de presión, gran			proveedor local
Crisol de porcelana, de alta forma, vidriado, 10 ml	CoorsTek, Inc.	07-965C [Fisher Scientific]	Se puede sustituir por Fisher FB-965-I Wide-Form Crucible www.fishersci.com
Puralube Veterinary Ophthalment Oinkment, Estéril	Henry Schein Company	NC0144682 [Fisher Scientific]	Se puede sustituir www.fishersci.com
Quatricide PV-15	Desinfectante antimicrobiano	PV-15	; puede ser sustituido www.pharmacal.com
Mascarillas de anestesia con gas rata para cirugía estereotáxica	Stoelting Company	51610	www.stoeltingco.com
Aparato estereotáxico para ratas con barras para los oídos (45 grados)	Se recomiendan las		barras de 45 grados para evitar dañar los tímpanos
Instrumento quirúrgico Roboz Leche	Roboz Surgical	NC9358575 [Fisher Scientific]	Puede ser sustituido; para lubricar instrumentos durante el autoclave www.fishersci.com
Recortadora de pelo para roedores	Cualquier
cloruro de sodio	Fisher Scientific	S641-500 [Fisher Scientific]	Para producir solución salina al 0,9%; grado de reactivo; USP www.fishersci.com
Microespátula de acero inoxidable (Hoja: 0.75 L x 0.18 in. W)	Fisher Scientific	21-401-15 [Fisher Scientific]	Puede ser sustituido www.fishersci.com
Starrett Tornillo de banco de clavija, 0.000 in - 0.055 in	Cualquier		niquelado o equivalente recomendado para resistir la oxidación y la corrosión
Guantes quirúrgicos estériles	Cualquier
envoltura de esterilización, 20 pulgadas x 20 pulgadas, esterilizable en autoclave	Propper Manufacturing	11-890-8C [Fisher Scientific]	Útil para envolver suministros esterilizables en autoclave y en campo estéril durante la cirugía www.fishersci.com
Paño quirúrgico, estéril/esterilizable en autoclave	Cualquiera		Puede ser necesario cortarlo a medida para ratas
Bata quirúrgica	Cualquiera		* Si lo requiere IACUC
Mascarilla quirúrgica	Cualquier
Jeringas de Tuberculina, Estériles, 1.0 ml	Cualquier
Báscula	de Peso Cualquiera		Debe tener buena resolución (en unidades de gramos)
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Eyeblink (asumiendo un sistema de 4 roedores)
5 canales x 4	Plastics One, Inc.	SL2 + 3C	www.plastics1.com
Cable de electrodo bipolar, Dual 305 x 4	Plastics One, Inc.	305-305 80CM TT2 (C)	Proporciona un extremo de enchufe al electrodo bipolar en la rata y al conmutador; debe modificarse www.plastics1.com
Cable, 5 Canales, Blindado, 26 AWG x 4	Cualquiera		Para fabricar el cable del conmutador, esto debe hacerse desde cero
Cámara para la caja de prueba operante (interior: 24 de alto x 23 de ancho x 14 de profundidad) x 4	Asociados		Se puede sustituir; las dimensiones internas deben caber cómodamente en la caja de prueba operante, con espacio para la espuma acústica; ajuste con ventilador - 55-60 dB www.med-associates.com
y software Eyeblink	JSA Designs	N/A	Patentado y personalizado para el laboratorio
de investigaciónTubo termorretráctil (3/16 pulg., 1/4 pulg., 3/8 pulg., 1/2 pulgada de diámetro)	Cualquiera		Para proteger los extremos y empalmes soldados del cable del conmutador modificado
Espuma acústica de melamina de triple pico con Hypalon negro (24 x 48 pulgadas)	McMaster-Carr	9162T5	Se puede sustituir; cortado para adaptarse a 4 cámaras de carcasa www.mcmaster.com
Caja de prueba operante (exterior 12.5 L x 10 W x 13.5 in H), completa x 4	Med-Associates	Paquete personalizado ENV-007	Con piso de rejilla de acero inoxidable y parte superior personalizada (orificio de 3 pulgadas en el centro para el cable del conmutador) www.med-associates.com
Osciloscopio (opcional)	Cualquiera		Especificaciones mínimas recomendadas: ancho de banda analógico de 200 MHz, muestreo en tiempo real de 1 GS/s, 4 canales; ver www.picotech.com /td>
Tweeters piezoeléctricos (altavoces) x 4 (7 x 3 pulgadas)	MCM Electronics	53-805	Debe coincidir con las especificaciones de rango de frecuencia para el sistema eyeblink (2500 Hz - 25 KHz) www.mcmelectronics.com
Estación de soldadura, Soldadura, Fundente, Estaño	Cualquiera		Para soldar cables de 26 AWG a enchufes hembra (que se ajustan a los pines de contacto relia-tac macho) y enchufes bipolares Aisladores de
estímulo x 4	WPI International	A365	Estas unidades funcionan con pilas alcalinas de 16-9V; está disponible una versión recargable adecuada (A365R) www.wpiinc.com
Cable de electrodo tripolar para conmutador SL3C x 4	plásticos uno, Inc.	335-335 80cm TT3 C	Proporciona un extremo de enchufe a la etapa de cabecera EMG en la rata y al conmutador; debe modificarse www.plastics1.com
USB Luces LED x 4	Cualquier		luz basada en USB no causa "ruido" eléctrico con las señales EMG de las ratas www.plastics1.com
Webcams x 4, Software de vigilancia	Cualquier
PC Ordenador con MS Windows OS	Cualquiera

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