Artículo de método

Las neuronas de imágenes dentro de las secciones del cerebro gruesas, según el método de Golgi-Cox

DOI:

10.3791/55358

⸱

18 de abril de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se presenta un protocolo por el método de tinción de Golgi-Cox en secciones de cerebro de espesor, con el fin de visualizar las neuronas con árboles dendríticos largas contenidos dentro de muestras de tejido individuales. También se presentan dos variantes de este protocolo que implica cresilo contratinción violeta, y la congelación de los cerebros no transformadas para almacenamiento a largo plazo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método de Golgi-Cox de la tinción de las neuronas ha sido empleado durante más de doscientos años para avanzar en nuestra comprensión de la morfología de las neuronas dentro del cerebro muestras histológicas. Si bien es preferible desde un punto de vista práctico para preparar secciones de cerebro en el mayor espesor posible, a fin de aumentar la probabilidad de identificar neuronas teñidas que están contenidos completamente dentro de las secciones individuales, este enfoque es limitado desde un punto de vista técnico por la distancia de trabajo de alto -magnification objetivos de microscopio. Presentamos aquí un protocolo para teñir las neuronas utilizando el método de Golgi-Cox en secciones de cerebro de ratón que se cortan en 500 espesor m, y para visualizar las neuronas en toda la profundidad de estas secciones usando un microscopio vertical equipado con una alta resolución de 30X de silicona 1,05 NA objetivo de inmersión en aceite que tiene una distancia de trabajo de 800 m. describen además dos variantes útiles de este protocolo que se puede emplear para contrateñir la superficie demontado secciones de cerebro con la tinción de violet Nissl de cresilo, o para congelar los cerebros enteros para almacenamiento a largo plazo antes de seccionar y el procesamiento final. El protocolo principal y sus dos variantes producen secciones de cerebro de espesor manchadas, a lo largo de la cual los árboles neurona dendríticas completos y espinas dendríticas se pueden visualizar y cuantificar de forma fiable.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La visualización de las neuronas individuales dentro de muestras de tejido permite el análisis in situ de las neuronas características morfológicas, que ha avanzado significativamente nuestra comprensión del cerebro y cómo puede ser influenciado por la enfermedad endógena o factores ambientales exógenas. El método de tinción de Golgi-Cox es un medio rentables, relativamente simples de la tinción de una muestra aleatoria de las neuronas dentro del cerebro. En primer lugar desarrollado por Golgi 1 y modificado por Cox 2 en la década de 1800, los investigadores han perfeccionado esta técnica en los últimos años para producir neuronas claros y bien teñidas con que se pueden utilizar para visualizar y cuantificar tanto la morfología del árbol dendrítico y la densidad de la columna 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.

Una consideración técnica importante para la visualización de las neuronas teñidas dentro de las secciones del cerebro es el espesor máximo rebanada, que está limitada por la distancia de trabajo de los objetivos disponibles de gran aumento / de alta resolución del microscopio. objetivos de inmersión en aceite comunes en el 60 - 100X gama proporcionan una excelente resolución, pero están limitados por sus distancias de trabajo que son típicamente no mayor de 200 m. Las secciones de cerebro de corte en el rango de 200 micras pueden ser adecuadas para visualizar ciertos tipos de neuronas que pueden estar contenidos dentro de este grosor de corte, por ejemplo las neuronas piramidales en las capas superficiales de la corteza cerebral 10, 11, 12, las neuronas piramidales en la región CA1 de la hipocampo 13, 14, y las células granulares en el giro dentado del hipocampo 15. Las neuronas con relativamente más largoárboles dendríticos, tales como las neuronas piramidales en las capas profundas de la corteza cerebral que para el ratón se puede extender más de 800 m desde el cuerpo celular 16, proporcionan un mayor reto porque tendrían que ser seccionada en un ángulo perfecto cerebros para contener todo el árbol de dendritas dentro de los 200 m rodajas. Esto puede incluso no ser factible si una dendrita o cualquiera de sus ramas se extienden en la dirección rostral o caudal. Si bien es posible abordar esta limitación mediante el trazado de una neurona a través de múltiples secciones de cerebro adyacentes, este enfoque presenta un desafío técnico significativo en la alineación de las secciones con precisión para la localización 17. Un enfoque más práctico sería para visualizar las neuronas enteras contenidas dentro de las secciones del cerebro que se cortan en un espesor mayor.

Presentamos aquí una técnica para teñir las neuronas dentro de 400 - secciones de cerebro de espesor 500 micras de ratones utilizando el método de Golgi-Cox, y para visualizar su morphology usando un silicio objetivo de inmersión en aceite de alta resolución que tiene una distancia de trabajo de 800 m. La impregnación y el procesamiento de protocolo de Golgi-Cox que describimos se modificó a partir de uno de los protocolos modernos más citados en la literatura 6. Nuestro enfoque con secciones de cerebro de espesor proporciona la ventaja de aumentar la probabilidad de identificar neuronas de cualquier tipo que están contenidos completamente dentro de la sección. Además del protocolo principal, también presentes dos variaciones que proporcionan ventajas únicas: (1) la tinción de Golgi-Cox con la contratinción cresil violeta en la superficie de las secciones montadas, con el fin de definir los límites de las regiones del cerebro y para identificar capas de la corteza cerebral, y (2) tinción de Golgi-Cox con una etapa de congelación intermedio para el almacenamiento a largo plazo de cerebros enteros impregnadas antes de seccionar y el procesamiento final.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ratones CD1-deformación hembras adultas se utilizaron en este estudio. tinción similar se puede lograr usando ambos sexos en diversas edades. Los animales experimentales fueron atendidos de acuerdo a los principios y directrices del Consejo Canadiense de los Animales, y el protocolo experimental fue aprobado por la Universidad de Guelph Cuidado de Animales.

1. Golgi-Cox tinción

  1. Golgi-Cox La impregnación de cerebros
    1. Hacer la solución Golgi-Cox de 1% (w / v) de dicromato de potasio, 0,8% (w / v) de cromato de potasio y 1% (w / v) de cloruro de mercurio disolviendo el dicromato de potasio y cromato de potasio en agua de alta calidad por separado . Mezclar las soluciones, añadir el cloruro de mercurio y filtrar la solución final utilizando grado 1 papel de filtro. Guardar la solución en la oscuridad durante un máximo de un mes.
    2. Anestesiar al ratón usando 5% de isoflurano.
    3. La eutanasia el ratón por decapitación y eliminar rápidamente el cerebro.
    4. Coloque el cerebro en un vial de centelleo de 20 mL glass que contenía 17 ml de solución de Golgi-Cox y se incuba en la oscuridad a TA durante 25 d.
    5. Cryoprotect el cerebro colocándolo en un tubo cónico de 50 ml que contenía 40 ml de sacarosa crioprotector (30% (w / v) de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4) en la oscuridad a 4 ° C durante 24 h.
      Nota: Las siguientes tres pasos opcionales se pueden emplear como alternativa al protocolo principal, con el fin de congelar el cerebro en esta etapa para el almacenamiento a largo plazo.
    6. Congelar todo el cerebro sumergiéndolo en 200 ml de isopentano que ha sido previamente enfriada en hielo seco.
    7. Coloque el cerebro congelado en un tubo cónico de 50 ml y almacenar en la oscuridad a -80 ° C.
    8. Cuando esté listo para proceder, descongelar el cerebro colocándolo en un tubo cónico de 50 ml que contiene 40 ml de crioprotector sacarosa en la oscuridad a 4 ° C durante 24 h.
  2. Seccionamiento cerebro
    1. Retire el cerebro de la sacarosa y el bloquek es para seccionar cortando el cerebelo utilizando una hoja de afeitar y dejando un borde plano en el extremo caudal restante del cerebro.
    2. agar de calor (3% (w / v) en agua) hasta que se funde y se deja enfriar hasta que esté ligeramente por encima de su punto de fusión.
    3. Coloque el cerebro en un pequeño plato desechable sopesar con su extremo caudal boca abajo y añadir una cantidad suficiente de agar fundido para cubrir el cerebro.
    4. Una vez que el agar se ha solidificado, recortar el exceso de agar dejando aproximadamente de 2 - 4 mm que rodea el cerebro y la cola del cerebro a la etapa de un vibratome con su cara hacia abajo extremo caudal usando una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato de etilo.
    5. Llenar el área de la etapa de la vibratome con una cantidad suficiente de crioprotector sacarosa para cubrir el cerebro, y la sección del cerebro en un grosor de corte alcanzan 400 - 500! M (dependiendo de la región del cerebro a ser examinado) usando una frecuencia de vibración de 86 Hz y una velocidad de avance de la hoja de 0,125 mm / s.
    6. Usando un pequeño pincel, Secciones lugar cerebro en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos que contiene insertos y de malla inferior comercialmente disponibles precargada con 10 ml de 6% (w / v) de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4.
    7. Incubar las secciones en la oscuridad a 4 ° CO / N.
  3. El desarrollo de las secciones del cerebro
    1. El uso de los insertos de malla inferior, transferir secciones de cerebro en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de paraformaldehído al 2% (v / w) (PBD) en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4. Incubar en un eje de balancín se mueve a velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 15 min.
    2. Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. Lavar en un eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
    3. secciones de transferencia en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de 2,7% (v / v) de hidróxido de amonio. Incubar en un eje de balancín que se mueve a una velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 15 min.
    4. Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. lavar ona eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
    5. Secciones de transferencia en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de fijador A (ver Tabla de Materiales) que ha sido diluido en 10 veces de agua de su original concentración comprado. Incubar en un eje de balancín que se mueve a una velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 25 min.
    6. Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. Lavar en un eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
  4. Montaje de las secciones del cerebro
    1. Usando un pincel pequeño, montar las secciones en portaobjetos de microscopio. Eliminar el exceso de agua y agar usando pinzas y una pequeña de tejido. Asegúrese de que todo el agar se retira antes de proceder a la deshidratación.
    2. Permitir secciones se sequen al aire a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 min (400 m secciones) o 90 min (500 m secciones).
      NOTA: El nivel de temporización y adecuado de sequedad es crítica, y puede necesitar ser determinado en cadalaboratorio dependiendo de la temperatura ambiente y nivel de humedad. Demasiado corto un tiempo de secado conduce a las secciones que están fuera de las diapositivas durante etapas de deshidratación posteriores, y demasiado largo de un tiempo de secado conduce a secciones de craqueo. Secciones todavía parecen ser brillante en el nivel apropiado de sequedad.
    3. secciones se tiñen con violeta de cresilo mediante la colocación de diapositivas en recipientes de tinción Coplin como se indica.
      NOTA: Este paso opcional puede emplearse para las secciones que nunca habían sido congelados, con el fin de teñir los núcleos neuronales con violeta de cresilo. Hemos encontrado que la compensación y la rehidratación de las secciones antes de la incubación en violeta de cresilo conduce a incluso las manchas y bajo fondo a través de secciones.
      1. Colocar en agente de compensación durante 5 min. Repita una vez.
      2. Colocar en 100% de etanol durante 5 min. Repita una vez.
      3. Colocar en etanol al 95% en agua, a continuación, 75% de etanol en agua, y luego etanol al 50% en agua durante 2 min cada una.
      4. Colocar en agua durante 5 min.
      5. Colocar en 0,5% cre (v / w)violeta Syl en agua durante 7 min.
      6. Colocar en agua durante 2 min. Repita una vez.
    4. Deshidratar secciones mediante la colocación de diapositivas en recipientes de tinción Coplin como se indica.
      1. Colocar en 50% de etanol en agua, luego 75% de etanol en agua, y luego etanol al 95% en agua durante 2 min cada una.
      2. Colocar en 100% de etanol durante 5 min. Repita una vez.
      3. Colocar en agente de compensación durante 5 min. Repita una vez.
        Nota: Estos deshidratación y de compensación veces son suficientes para procesar cerebros de ratón como se describe en este manuscrito. Sin embargo, hemos observado para otras especies, incluida la rata y cowbird, que puede necesitar ser extendido hasta 15 min total de la etapa de limpieza final.
    5. secciones cubreobjetos usando un medio de montaje anhidro.
    6. Permitir que se sequen horizontalmente en la oscuridad a temperatura ambiente durante al menos 5 d.

2. Imaging manchado neuronas en el cerebro secciones gruesas

  1. La captura de Pilas de imágenes
    1. Encender la bombilla de luz del microscopio, cámara, y el controlador de fase.
    2. Abra el software de microscopio (por ejemplo, Neurolucida).
    3. Coloque una diapositiva en la platina del microscopio.
    4. Capturar una en toda la vista de la imagen 2D de la sección de cerebro usando un objetivo de baja magnificación como 1,25X 0,4 NA PlanApo o 4X 0,16 NA
      1. Enfoque la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo el tiempo de exposición y balance de blancos.
      2. Crear un punto de referencia haciendo clic izquierdo en cualquier parte de la sección
      3. Capture la imagen seleccionando la opción "recibir la imagen única" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
    5. Captura mediados de resolución pilas de imágenes de la zona que contiene las neuronas (s) de interés, usando un 10X 0,3 objetivo NA UPlan FL N.
      1. Enfocar la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
      2. Establecer los límites superior e inferior de la pila de imágenes, centrándose en la parte superior de la sección de unand selección de "ajuste" al lado de "parte superior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes, y luego se centra en la parte inferior de la sección y seleccionando "set" al lado de "parte inferior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      3. Ajuste la distancia de paso de 5 micras mediante la introducción de "5 micras" junto a "distancia entre imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      4. Capturar la pila de imágenes mediante la selección de "pila de adquirir" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      5. Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superponen en al menos un 10% en los ejes X e Y.
    6. Captura de alta resolución pilas de imágenes de la zona que contiene la neurona de interés, utilizando un 30X 1,05 NA silicona objetivo de inmersión en aceite.
      1. Aplicar 3 - 4 gotas de aceite de inmersión de silicona a la diapositiva y coloque el objetivo sobre el portaobjetos, asegurando a hacer contacto entre el objetivo y el OIl.
      2. Enfocar la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
      3. Establecer los límites superior e inferior de la pila de imágenes, centrándose en la parte superior de la sección y seleccionando "set" al lado de "parte superior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes, y luego se centra en la parte inferior de la sección y seleccionando "set" junto a "parte inferior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      4. Ajuste la distancia de paso de 1 m mediante la introducción de "1 m" al lado de "distancia entre imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      5. Capturar la pila de imágenes mediante la selección de "pila de adquirir" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      6. Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superponen en al menos un 10% en los ejes X e Y.
    7. Guarde el archivo de datos y guardar todos los archivos de imagen en formato TIFF para el procesamiento externo.
  2. La creación de Z-proyección imágenes y sus montajes
    1. Crear imágenes Z-proyección en ImageJ
      1. el software ImageJ abierto que ha instalado el plugin Bio-formatos.
      2. Seleccione "Plug-ins" -> "Bio-formatos" -> "Bio-Formatos importador".
      3. Seleccione el archivo de imagen de pila que se abrirá.
      4. Una vez abierto el archivo, cambiar el formato a RGB seleccionando la opción "Imagen" -> "Tipo" -> "Color RGB".
      5. Crear el Z-proyección seleccionando "Imagen" -> "Pilas" -> "Z proyecto ...".
      6. Guarda la imagen Z-proyección bidimensional como un archivo TIFF.
    2. Crear un montaje de imagen bidimensional de toda el área de interés.
      1. Abra el software (por ejemplo, Adobe Photoshop).
      2. Seleccione "Archivo" -> "Automatizar" -> "Photomerge".
      3. Seleccione "Examinar" y luego añadir todas imagES archivos que se fusionen.
      4. Asegurar que "Blend Images Juntos" está seleccionado y luego seleccione "OK".
      5. Guardar la imagen resultante montaje de toda el área de interés como un archivo TIFF.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo de tinción Golgi-Cox y sus dos variantes opcionales descritos pueden emplearse para visualizar las neuronas individuales dentro de 400 - 500 micras secciones de cerebro de espesor. Montajes de imágenes representativos de dos dimensiones Z-proyecciones capturados usando un objetivo de 10X y 5 micras pasos en el eje Z se muestran en la Figura 1: A1 - C1 para un área grande de secciones cerebrales coronales que incluye el área de la corteza cingulada anterior...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe aquí un protocolo de tinción Golgi-Cox junto con dos variantes útiles para la visualización de las neuronas dentro de las secciones del cerebro de espesor. Como se muestra en los resultados representativos, el uso de un objetivo de alta resolución que tiene una larga distancia m de trabajo 800 permite la visualización fiable de las neuronas enteras a lo largo de la profundidad de las secciones del cerebro cortadas a 500! M. Este estudio de secciones del cerebro relativamente gruesas aumenta la probabilidad d...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por una subvención del descubrimiento de CDCB de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC), un Fondo Líderes concesión de infraestructuras de investigación John R. Evans a CDCB desde Canadá Fundación para la Innovación (CFI proyecto número 30381), y por Descubrimiento de una subvención a MNJ de CRSNG. ELL fue apoyado por una beca de Graduados de Ontario y por una beca de la OVC de la Facultad de Veterinaria de Ontario de la Universidad de Guelph. CDS con el apoyo de una Ayudantía de Investigación de Pregrado Estudiantes de CRSNG. ALM fue apoyado por una beca de Alexander Graham Bell de CRSNG y por una beca de la OVC de la Facultad de Veterinaria de Ontario de la Universidad de Guelph.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
dicromato de potasioFisher ScientificP188-100Peligroso
cromato de potasioFisher ScientificP220-100
Peligroso cloruro de mercurioFisher ScientificS25423
Peligroso Whatman papel de filtro de grado 1Fisher Scientific1001-185
isofluranoSocios farmacéuticos de Canadá
vial de centelleo de 20 mLFisher Scientific03-337-4
sacarosaBioshop CanadaSUC700.1
fosfato sódico monobásicoSigmaAldrich S5011-500G
fosfato sódico dibásicoSigma AldrichS9390-500G
50 mL tubo cónicoFisher Scientific12-565-271
isopentanoFisher ScientificAC126470010También conocido como 2-metilbutano;
agarSigma AldrichA1296-100G
plato de pesaje pequeñoFisher Scientific02-202-100
vibratomoLeicaVT1000 S
placas de cultivo de tejidos de 6 pocillosFisher Scientific08-772-1b
insertos de cultivo de tejidos con fondo de mallaFisher Scientific07-200-214
paraformadelhído (PFA), 16%Microscopio electrónico Sciences15710-S
Hidróxido de amonioFisher ScientificA669S-500Peligroso
Fijador Kodak ASigma AldrichP7542
portaobjetos superfrost plusFisher Scientific12-550-15
Agente de limpieza CitroSolvFisher Scientific22-143-975
alcohol etílico anhidroAlcoholes comercialesN/A violeta
de cresiloSigma AldrichC1791
permountFisher ScientificSP15-100
modelo OlympusBX53
cámara en color, 12 bitsMBF BiosciencesDV-47dQIming parte 01-MBF-2000R-F-CLR-12
Platina, controlador y enómetros de microscopio motorizado 3DMBF BiosciencesN/ASuministrado e integrado con el microscopio por MBF Biosciences
4X objetivo de microscopioOlympus4x 0.16 N.A. Objetivo de microscopio UplanSApo
10XOlympus10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
Objetivo de microscopio 30XOlympus30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
Objetivo de microscopio 60XOlympus60x 1.42 N.A. PlanAPO N
aceite de inmersión de siliconaOlympusZ-81114
Software NeurolucidaMBF BiosciencesVersión 10
Software ImageJInstitutos Nacionales de Salud de EE. UU.Versión actualCon el complemento OME Bio-Formats instalado
SoftwarePhotoshopAdobeversión CS6
CP0406V2 peligroso peligroso Microscopio vertical

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
  2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
  3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38(2016).
  4. Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
  5. Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157(2010).
  6. Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
  7. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
  8. Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
  9. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  10. Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
  11. Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
  12. Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
  13. Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
  14. Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
  15. Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
  16. Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
  17. Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
  19. Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
  20. Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
  21. Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Golgi Cox MethodNeuron StainingThick Brain SectionsSilicone Oil ImmersionCresyl Violet StainBrain SectioningVibratome SectioningImage Stack AcquisitionDendritic Tree VisualizationSpine Density Analysis

Artículos relacionados