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Artículo de método

Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales

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DOI:

10.3791/55359

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27 de agosto de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Anatomy, University of Otago

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Las culturas Organotypic rebanada hippocampal (OHSC) representan un modelo en vitro que simula muy bien la situación en vivo . Aquí describimos un vibratome base mejorado rebanar protocolo para obtener rodajas de alta calidad para uso en la evaluación del potencial neuroprotector de nuevas sustancias o el comportamiento biológico de las células tumorales.

Resumen

En culturas de rebanada hippocampal organotypic (OHSC), las características morfológicas y funcionales de neuronas y células gliales están bien conservadas. Este modelo es adecuado para abordar cuestiones de investigación que involucran estudios de neuroprotección, experimentos electrofisiológicos de neuronas, redes neuronales o invasión del tumor. La arquitectura hippocampal y la actividad neuronal en circuitos multisynaptic están bien conservados en OHSC, aunque el procedimiento de corte inicialmente lesiones y conduce a la formación de una cicatriz glial. La formación de la cicatriz presumiblemente altera las propiedades mecánicas y comportamiento difusivo de moléculas pequeñas, etcetera. Láminas permiten el monitoreo de procesos dependientes del tiempo después de la lesión cerebral sin cirugía animal y los estudios sobre las interacciones entre los diversos tipos de células cerebrales, es decir, astrocitos, microglía y neuronas en fisiológicas y patológicas condiciones. Un aspecto ambivalente de este modelo es la ausencia de flujo sanguíneo y las células inmunes de la sangre. Durante la progresión de la lesión neuronal, migración de células inmunes del juego un papel importante de la sangre. Como esas células faltan en rodajas, se pueden observar los procesos intrínsecos de la cultura sin interferencia externa. Por otra parte, en OHSC la composición del ambiente externo medio es precisamente controlada. Otra ventaja de este método es el menor número de animales sacrificados en comparación con las preparaciones estándar. Varios OHSC puede obtenerse de un animal, posibilitando estudios simultáneos con múltiples tratamientos en un animal. Por estas razones, OHSC son muy adecuadas para analizar los efectos de la nueva terapéutica protectora después de daño de tejido o invasión del tumor.

El protocolo presentado aquí se describe un método de preparación de OHSC que permite generar altamente reproducible, bien conservado láminas que pueden utilizarse para una variedad de investigaciones experimentales, como estudios de neuroprotección o tumor invasión.

Introducción

OHSC son un modelo bien caracterizado en vitro para el estudio de propiedades fisiológicas y patológicas de las neuronas, astrocitos y microglia1. Es fácil de controlar el ambiente extracelular y los cambios morfológicos y celulares después de varios estímulos. La organización de las neuronas de hipocampales y sus conexiones están bien conservadas después de preparación2,3. De varias ventajas, OHSC permiten monitoreo de invasión de la lesión y tumor del cerebro sin cirugía animal. Seis a ocho OHSC puede obtenerse de un solo cerebro de roedor. OHSC por lo tanto ayudar a significativamente a reducir el número de animales y realizar las pruebas de varias concentraciones de la droga, manipulación genética o lesión diferentes modelos en el mismo animal. En rebanada-ensayos, condiciones experimentales pueden ser precisamente controladas. Además, tiempo de desarrollo dependiente de condiciones patológicas como daños secundarios puede controlarse fácilmente por proyección de imagen de Time-lapse.

En el protocolo dado, establecido originalmente por Stoppini et al. 4, los pasos de preparación se describe y se destacan importantes hitos morfológicos para la selección de láminas adecuadas. Se recomienda la preparación del día postnatal 7-9 ratas o ratones de día postnatal 4-5. En estos períodos, OHSC muestran una sólida resistencia a traumas mecánicos y un alto potencial para la reorganización de los circuitos neuronales. Por el contrario, preparaciones de ratas adultas o embrionarias rápidamente cambian su estructura y pierden su morfología organotypic durante el cultivo y por lo tanto son menos convenientes para el estudio de procesos a largo plazo en investigación básica5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. otro punto crítico para la tasa de supervivencia de OHSC es el espesor de la rebanada de sí mismo como la difusión y suministro de nutrientes es limitada12,13,14.

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Protocolo

experimentos con animales se realizaron conforme a la política de la ética y la política sobre el uso de animales en la investigación de la neurociencia aprobado por la Europea comunidades Consejo Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo de la Unión Europea sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.

1. preparación de instrumentos y medios de cultivo

  1. para la preparación de OHSC usan los siguientes instrumentos: dos pequeñas tijeras, dos pinzas curvas, una pinza con punta fina, tres láminas (dos de tamaño 11, uno de tamaño 15), alrededor de tres titulares de bisturí, papeles de filtro (diámetro: 35 mm), agar, una hoja de afeitar, uno sin modificar la pipeta Pasteur y una modificada pipeta Pasteur sin una punta. Esterilizar todos los materiales en autoclave antes de su uso ( figura 1).
  2. Pesar agar 5 g y disolver en 100 mL de agua destilada. Esterilizar la solución por 20 min a 121,7 º C en 210.8 kPa en un autoclave. Distribuir la solución de agar líquido de 3 mL en cajas Petri de 60 mm con una pipeta de vidrio estéril, deje que se solidifique para 5 h, cubra con película de plástico de la parafina para evitar la contaminación y almacenar a 4 ° C hasta su uso posterior. Bloques de agar son necesarios para estabilizar el cerebro durante el procedimiento de corte.
  3. Media
    1. hacer 200 mL del medio de preparación (pH 7,35) que consiste en medio esencial mínimo (MEM) de 198 mL y 2 mL de solución de L-glutamina (concentración final de 2 mM). La solución en el día de la preparación de los medios de comunicación y almacenar a 4 ° C.
    2. Preparar 100 mL de medio de cultivo que consiste en 49 mL MEM, madejas de 25 mL ' equilibrado de soluciones salinas (HBSS), suero de caballo normal 25 mL (v/v) (NHS), 1 mL solución de L-glutamina (concentración final de 2 mM), 100 μg insulina, glucosa 120 mg, estreptomicina 10 mg , 10.000 de U de penicilina y 800 μg de vitamina C, como se informó previamente. Caliente el medio (37 ° C), ajustar el pH a filtro de pH 7,4 y estéril (tamaño de poro de 0,2 μm). Repita el procedimiento (calentamiento, ajuste del pH, etcetera.) cada dos días antes de cambiar el medio. Utilizar el medio a lo más una semana cuando se almacena a 4 ° C.
  4. Llenar un plato de Petri de 35 mm con medio de preparación para almacenar el cerebro. Colocar dos placas de Petri vacía para recoger el tejido en un paquete de enfriamiento en el área de trabajo.

2. Preparación y corte con un Vibratome

  1. uso los cerebros de ratas de 7-9 días o 4-5 días ratones del viejo para la preparación de OHSC según Stoppini et al. 4 después de la decapitación de los animales, retirar la piel del cráneo con las tijeras.
  2. Introducir la hoja de una tijera fina en el foramen magnum y abrir el cráneo por el corte del eje caudal rostral (trasero) (delantero). Haga dos cortes perpendiculares al primero, para que la tijera apunte hacia la oreja izquierda y derecha, respectivamente (" incisión T ").
  3. Abrir el cráneo cuidadosamente con unas pinzas finas, prestando atención de no dañar el cerebro. Utilice un bisturí (tamaño de la hoja 11) para cortar la parte más rostral del polo frontal y el cerebelo.
  4. Por medio de una espátula, retirar el cerebro y colocarla cuidadosamente en la caja Petri con medio de la preparación ( figura 2). Colocar el cerebro en el sostenedor de la muestra y fijar con pegamento del cianocrilato médica. Utilizar los pedazos de agar para asegurar la estabilización mecánica.
  5. Disecar el tejido horizontal de 350 μm OHSC gruesa con un vibratome deslizante.
  6. Evaluar las rebanadas ópticamente usando un microscopio binocular. Deseche inmediatamente OHSC de baja calidad. Es importante tomar sólo las rebanadas con cytoarchitecture intacta aislada de la parte media del hipocampo (ver figuras 3 y 4) entre el dorsal y el ventral hipocampo.
  7. Separar la región del hipocampo y la corteza entorrinal con bisturí (hoja tamaño 15; redondo figura 3). La corteza entorrinal y de perforante debe ser preservada.
  8. OHSC de seis a ocho se obtienen de cada cerebro. Transferencia de 2-3 rebanadas en insertar la cultura de una célula (tamaño 0.4 μm de poro) y colocar en un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos que contienen medio de cultivo 1 mL por pozo.
  9. Incubar los platos bien de 6 a 35 ° C en una atmósfera completamente humidificada con 5% (v/v) CO 2 y cambiar el medio de cultivo celular cada dos días.
    Nota: Llevar a cabo sus experimentos en el día 6 en vitro (div). Las reacciones inflamatorias asociadas con el procedimiento de corte desaparecen por día 6. En esta etapa, las células microgliales volver a mostrar una morfología ramificada y conexiones sinápticas han madurado.

3. Evaluación de la calidad del tejido

  1. fijación, etiquetado y visualización de neuronas en degeneración en OHSC
    1. después de realizar los experimentos, incubar OHSC con 5 μg/mL propidio (PI) por 2 h antes de la fijación, en orden para teñir los núcleos de neuronas en degeneración.
      PRECAUCIÓN: PI es un carcinógeno, use siempre equipo de protección personal (EPP) como guantes.
    2. Lavar la OHSC con tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7,4) y fijarlos con una solución al 4% (v/v) de paraformaldehido (PFA) para 24 h.
      PRECAUCIÓN: PFA es un carcinógeno tóxico y sospecha. Trabajar bajo campana y use PPE.
    3. Lave la OHSC insertos con 1 mL de PBS y use un cepillo de rigger para separar láminas de la membrana.
    4. Etiqueta OHSC con tinte de 4 IB en una placa de 24 pozos ( figura 5).
  2. Conducción de experimentos de invasión del tumor usando fluorescencia etiquetada células
    1. 24 h antes del comienzo de un experimento de la etiqueta las células del tumor usando el colorante fluorescente Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl Ester (CFDA SE).
    2. Separar y contar las células del tumor utilizando una cámara de Neubauer.
    3. Resuspender las células en el medio, tal que 10 μl de la suspensión contiene el número deseado de la célula (células normalmente 50.000 o 100.000).
    4. Aplicar 10 μl de la suspensión celular en el sector cultura y permitir que las células que invaden por 3 días.
    5. Al final del experimento, fijar las culturas rebanada con 4% (v/v) PFA por 24 h y etiqueta los co-cultivos con PI por otro 24 h para visualizar la Citoarquitectura.
      PRECAUCIÓN: PFA es un carcinógeno tóxico y sospecha. Trabajar bajo campana y use PPE.
    6. Monte co-cultivos sobre un cubreobjetos para su posterior análisis utilizando los medios de montaje.

4. Evaluación de los experimentos de OHSC

analizar el OHSC con un láser confocal de barrido (CLSM) del microscopio. Para la detección de PI etiquetado, degeneración de las neuronas o la PI etiquetada cytoarchitecture utiliza luz monocromática de longitud de onda λ = 543 nm y una banda de emisión pasan filtro para longitudes de onda λ = 615 585 nm. Para CFDA etiqueta las células tumorales o IB 4 microglia, utilizar una longitud de onda de excitación de λ = 488 nm. Para ambos tipos experimentales, grabar una pila de z con 2 μm optical rodajas y utilizado para la evaluación.

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Resultados

Estudios de neuroprotección: Para determinar el daño neuronal, el número de núcleos positivos PI y IB4 positivo microglia en cada tercera sección óptica de la capa de la célula del gránulo (GCL) del giro dentado (DG) fue contado. Para los experimentos de la invasión del tumor, la z-proyección de intensidad máxima de la pila se utilizó para el cálculo del área cubierta por las células del tumor, como una medida de la invasión y visualizar patrones de invasión di...

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Discusión

El presente Protocolo describe la preparación de OHSC. Este modelo permite realizar pruebas de capacidades intrínsecas y las reacciones de tejido cerebral después de la aplicación de estímulos fisiológicos y patológicos. Además de los análisis de los parámetros electrofisiológicos, OHSC puede ser lesionado y pueden determinar los efectos del daño en todos los tipos de la célula. Es posible el tratamiento con diferentes sustancias y la descripción detallada de procesos de lesiones o sanación en ausencia de linfocitos y ma...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Christine Auste por su apoyo con la grabación de vídeo y Chalid Ghadban por su excelente asistencia técnica. Urszula Grabiec fue apoyado por el Roux Programm FKZ 29/18.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
6 pocillosFalcon35-3046
AgarFluka5040
AutoclavSystecDX-45
CFDA  Thermo FisherV12883
Microscopio de barrido láser confocal (CLSM) LSM700Carl Zeiss
Eagle&agudo; s Medio Esencial Mínimo Invitrogen32360-034
Fluoresceína marcada con Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin IVector LabsFL-1101
GlucosaMerk1083371000
GlutaminInvitrogen25030-024
Hank´ s Solución salina equilibrada (con Ca2+ y Mg2+)Invitrogen24020-133
Hank´ s Solución salina equilibrada (sin Ca2+  y Mg2+)Invitrogen14170-138
InsulinaSigma AldrichI5500
Ácido L-ascórbicoSigma AldrichA5960
L-GlutaminInvitrogen25030-024
LN229Cell-Lines-Service300363
Pegamento médico de cianoacrilato (pegamento Histoacril)B.Braun1050052
Insertos de cultivo de milicélulasMilliporePICMORG50
Ácido N-metil-D-aspárticoNMDA Sigma AldrichM3262
Suero de caballo normalInvitrogen26050-088
Penicilina EstreptomicinaInvitrogen15140-122
Placas de Petri (todos los tamaños)Greiner627160/664160/628160
PFARoth0335.1tóxico
Propidium yodid (PI)Sigma Aldrich81845-25MGtóxico
U138ATCC HTB-14
VibratomeLeicaLeica VT 1200

Referencias

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