La maduración de madre humanas cardiomiocitos derivado de células en Biowires uso de la estimulación eléctrica

Resumen

La plataforma biowire cardiaca es un método in vitro utilizado para madurar embrionario humano y los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (HPSC-CM) combinando el cultivo de células en tres dimensiones con la estimulación eléctrica. Este manuscrito presenta la configuración detallada de la plataforma biowire cardíaco.

Resumen

Los cardiomocitos derivados de células madre pluripotenciales humanas (hPSC-CMs) han sido una fuente prometedora de células y por lo tanto han fomentado la investigación de sus aplicaciones potenciales en la investigación cardíaca, incluyendo el descubrimiento de fármacos, modelación de enfermedades, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Sin embargo, las células producidas por los protocolos existentes muestran un rango de inmadurez en comparación con los cardiomiocitos ventriculares adultos nativos. Se han hecho muchos esfuerzos para madurar hPSC-CMs, con sólo maduración moderada alcanzada hasta el momento. Por lo tanto, se ha ideado un sistema de ingeniería, llamado biowire, proporcionando señales tanto físicas como eléctricas para conducir los hPSC-CM a un estado más maduro in vitro . El sistema utiliza una plataforma microfabricada para sembrar hPSC-CMs en gel de colágeno tipo I a lo largo de una sutura moldeada rígida para ensamblar en tejido cardiaco alineado (biowire), que es sometido a estimulación de campo eléctrico con una frecuencia progresivamente creciente. En comparación con los controles no estimulados,estimularon biowired cardiomiocitos exhiben un grado mejorado de maduración estructural y electrofisiológico. Tales cambios son dependientes de la velocidad de estimulación. Este manuscrito describe en detalle el diseño y creación de biowires.

Introducción

terapia basada en células es una de las estrategias más prometedoras e investigados para lograr la reparación cardíaca / regeneración. Se ha ayudado por la ingeniería de tejidos cardíaco y el co-suministro de biomateriales ^{1, 2.} La mayoría de las fuentes de células disponibles se han estudiado en modelos animales por sus efectos potencialmente beneficiosos sobre dañadas o envejecidas corazones enfermos ^3. En particular, se han hecho esfuerzos significativos para utilizar células madre pluripotentes humana (HPSC) derivada de los cardiomiocitos (HPSC-CM), una fuente de células autólogas potencialmente ilimitado para la ingeniería de tejido cardíaco. HPSC-CM puede producirse usando varios protocolos establecidos ^{4, 5, 6.} Sin embargo, las células obtenidas muestran fenotipos fetales similar, con una gama de características inmaduras en comparación con los cardiomiocitos ventriculares adultos ^{7, 8.} Esto puede ser un obstáculo para la aplicación de HPSC-CM como modelos de tejido cardiaco de adultos en la investigación y el descubrimiento de fármacos en el desarrollo de modelos de enfermedades cardiacas adultas ^9.

Con el fin de superar esta limitación de inmadurez fenotípica, nuevos enfoques se han investigado activamente para promover la maduración de los cardiomiocitos. Los primeros estudios revelaron propiedades pro-maduración eficaces en cardiomiocitos de rata neonatal a través cíclico mecánico ¹⁰ o la estimulación eléctrica ^11. Compactación Gel y la estimulación mecánica cíclica también se mostró a mejorar algunos aspectos de la maduración HPSC-CM ^{12, 13,} con la mejora mínima de las propiedades de manipulación electrofisiológicos y de calcio. Por lo tanto, un sistema de plataforma llamada "alambre biológica" (biowire) fue ideado por proporcionar ambas claves estructurales y estimulación del campo eléctricon para mejorar la maduración de HPSC-CM ^14. Este sistema utiliza una plataforma microfabricado para crear tejido cardíaco alineados que es susceptible a la estimulación de campo eléctrico. Esto se puede utilizar para mejorar la madurez estructural y electrofisiológica de HPSC-CM. A continuación, describimos los detalles de fabricación de tales biowires.

Protocolo

1. Diseño principal y Fabricación

NOTA: El uso de litografía blanda para la fabricación del dispositivo. Hacer una de dos capas SU-8 maestro para polidimetilsiloxano de moldeo (PDMS).

1. Diseñar el dispositivo mediante un diseño y elaboración de software (Figura 1A, izquierda). Dibuje cada capa del maestro por separado. Imprimir el diseño del dispositivo en dos fotomáscaras en 20.000 dpi, correspondiente a las dos capas del maestro ^15. Ajuste el modelo dispositivo como transparente y sus alrededores como oscuro; las máscaras servirán como plantilla para transferir ópticamente el patrón dispositivo sobre SU-8 mediante litografía (como se describe por otros ^15).
2. Dispense aproximadamente 4 ml de SU-8 50 sobre el centro de una oblea de silicio de 4 pulgadas. Escudo la SU-8 50 uniformemente sobre la oblea usando un revestidor de giro haciendo girar a 2.000 revoluciones por minuto (RPM) durante 30 s. Hornear la oblea en un 95 ° C placa de cocción durante 10 min. Exponer la oblea a los rayos ultravioleta li (UV)lucha a 200 mJ / ^cm2.
3. Verter sobre 4 ml de SU-8 2050 en el centro de la oblea y centrifugado a 2500 rpm durante 30 s. Hornear en el 95 ° C placa de cocción durante 15 min. Enfriar a temperatura ambiente (TA).
4. Repita el paso 1.3 dos veces más.
5. Cubrir la oblea recubierta con la fotomáscara transparencia de primera capa. Exponer la oblea a la luz UV a 270 mJ / cm ² para hacer que la primera capa. Hornear en el 95 ° C placa de cocción durante 15 min.
6. Hacer la segunda capa de SU-8 2050 repitiendo el paso 1.3 dos veces.
7. Alinear la máscara de segunda capa a las características de la primera capa utilizando un alineador de máscara. A continuación, se exponen a la luz UV a 240 mJ / cm2. Hornear a 95 ° C durante 15 min.
   NOTA: El tiempo de exposición se determina por la dosis de UV total requerida y la intensidad de salida de luz UV medido en el día antes de su uso.
8. Desarrollar la oblea sumergiéndolo en acetato de propilenglicol monometil éter (PGMEA) y agitación a 200 rpm durante 30 min en un agitador orbital.
9. Lugarel maestro en una placa de Petri y cuidadosamente vierte la mezcla (base de agente de reticulación en una proporción de 10: 1 en peso) PDMS en el centro de la oblea. Cubrir todas las características y evitar burbujas de aire.
10. El calor en un horno a 70 ° C durante 2 h. Utilice una cuchilla afilada para cortar alrededor del borde de la plantilla biowire PDMS (Figura 1A, derecha). Pelar el PDMS del maestro. Recorte el dispositivo con la hoja. Ponga la plantilla biowire PDMS en una bolsa de esterilización y vapor de agua en autoclave a 121 ° C durante 20 min.
11. En una cabina de bioseguridad (BSC), colocar el PDMS biowire plantilla en una placa de Petri. Use pinzas para sostener y montar una pieza de sutura estéril quirúrgico de seda (6-0) en el centro del canal de los pocillos PDMS por asientos en las ranuras en ambos extremos del canal (Figura 1B-I).

2. Creación de la Cámara de estimulación eléctrica

1. Hacer un par de piezas de policarbonato rectangulares (longitud x anchura x grosor: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) y utilizarlos como el bastidor de la cámara de estimulación eléctrica (Figura 2).
2. Perforar dos 3 mm de ancho agujeros 2 cm de distancia a lo largo de la línea central de cada pieza de soporte de policarbonato.
3. Cortar dos piezas de 1,5 cm varillas larga de carbono. Perforar un agujero de 1 mm de ancho a través de la varilla de carbono de aproximadamente 3 mm del extremo. Pase un alambre de platino a través del agujero de la varilla de carbono y apriete el cable envolviéndolo alrededor de la varilla de carbono. Adjuntar un clip al otro extremo del alambre de platino para la conexión posterior con el estimulador eléctrico.
4. Introduzca las varillas de carbono en las piezas del marco de policarbonato. Coloque el marco ensamblada con las varillas de carbono en un pocillo de una placa de seis pocillos.
5. Verter 2 ml de PDMS en el pozo. Sumergir la parte inferior de los marcos de policarbonato en PDMS mientras se mantiene el nivel de la superficie PDMS cerca pero no llegar a la parte inferior de las varillas de carbono. El calor en un horno a 70 ° C durante 2 h.
6. Tomar la cámara de la estimulación eléctrica de los seisplaca -bien y puso en una bolsa de esterilización para esterilización con vapor a 121 ° C durante 20 min.

3. enzimática La disociación de HPSC-CM

1. Inducir HPSC de diferenciarse en cardiomiocitos utilizando un protocolo establecido ^4.
   NOTA: En pocas palabras, generar cardiomiocitos a través de cuerpo embrioide establecido protocolos (EB) en el tallo pro medio a través de la suplementación secuencial con proteína morfogenética ósea 4, factor de crecimiento de fibroblastos básico, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular, y Dickkopf homólogo 1 ^4. Utilice EBS desde el día 20-34 de diferenciación para hacer biowires.
2. Recoge los EBs de la placa de bajo adjunto con una punta de pipeta P1,000 y transferir a un tubo cónico. Se precipitan por centrifugación durante 5 min a 125 xg y RT. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con pre-calentado, 37 ° C colagenasa de tipo I que contiene 1% desoxirribonucleasa I (ADNasa I). Incubar a 37 ° C durante 2 hpara la digestión.
3. Añadir 5 ml de pre-calentado, 37 ° C el medio de lavado y centrifugar durante 5 min a 125 xg y RT. Descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento con 2 ml de solución de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
4. Añadir 1 ml de medio de parada que contiene 3% (v / v) DNasa I.
5. Adjuntar una aguja 20 G (0,9 mm) a una jeringa de 5 ml y pasar la suspensión a través de él EB 3-5 veces.
6. Añadir 7 ml de medio de lavado y centrifugar a 280 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en un medio (IMDM) de Dulbecco modificado por Iscove y almacenar en hielo. Determinar el número de células con un hemocitómetro. Tomar 0,5 x 10 ⁶ células y sedimento por centrifugación a 280 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante.
7. Pre-fresco todos los componentes del gel en hielo antes de mezclarlos en un tubo estéril. Mezclar los siguientes componentes del gel de colágeno (concentración final): 2,1 mg ml / tipo de colágeno de cola de rata I, glucosa 24,9 mM, NaH 23,8 mMCO _3, NaOH mM 14,3, HEPES 10 mM, y 10% de matriz extracelular en medio 1x M199. Añadir el colágeno y matriz extracelular pasado. Mezclar pipeteando arriba y abajo.
8. Resuspender 0,5 x 10 ⁶ células con 3,5 l de gel de colágeno y mezclar bien.
9. Utilice una punta de pipeta P10 añadir 4 l de la suspensión celular en el 0,5 cm de longitud de canal (Figura 1B-II). Ajustar la posición de la sutura con pinzas estériles si es necesario.
10. Cubrir el fondo de la placa de Petri con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS), asegurándose de no tocar el gel. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
11. Sustituir el PBS con 12 ml de medio de cultivo (por ejemplo, tallo pro o medio recomendado por el fabricante de células), lo suficiente para cubrir las células (Figura 1B-III). Cultura en una incubadora a 37 ° C durante 1 semana. Cambiar el medio cada dos días.

4. Estimulación eléctrica para Biowire Cultivo

1. Enel BSC, añadir 2 ml de PBS a cada pocillo de una placa de seis pocillos que albergará una cámara de estimulador eléctrico. Use pinzas estériles para colocar suavemente el dispositivo de estimulación eléctrica en autoclave en el pozo. Desechar el PBS del pozo.
2. Cubrir las varillas de carbono con 5 ml de medio de cultivo pre-calentado. Use pinzas estériles para montar los biowires en la cámara de estimulación eléctrica y orientarlos perpendicular a las varillas de carbono (Figura 2).
3. Coloque la tapa en la parte superior de la placa de seis pocillos, pero dejar suficientes hilos de platino que llegan fuera de la placa para conectar con el estimulador eléctrico. Colocar la placa de seis pocillos en un incubador de cultivo celular a 37 ° C y conectar el alambre de platino al estimulador eléctrico.
4. Estimular el biowires usando un estimulador eléctrico con la siguiente configuración: pulso repitiendo bifásica, duración del pulso de 1 ms, 3 V / cm, y 1 pulso por segundo (PPS). Elevar el PPS cada 24 h para los siguientes valores: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15, y 6. Cambiar el medio cada dos días.
5. Observe la contractilidad de los cardiomiocitos en respuesta a la estimulación eléctrica bajo un microscopio a un aumento de 10X.
   NOTA: Después de una semana de la estimulación, las biowires llega a la madurez (véase la sección de resultados).

Resultados

El racional para el uso de una sutura en las biowires es servir como una plantilla para la formación de constructos 3D que se alinean en un eje y imitan la forma de fibras cardíacas. Se demuestra que después de siete días de cultivo en el biowire, las células remodelado el gel alrededor de la sutura (Figura 3A). Las células montadas a lo largo del eje de la sutura para formar alineados tejido cardíaco (Figura 3). Después de 7 días de precultivo, las biow...

Discusión

Este manuscrito describe la configuración e implementación de la plataforma de ingeniería, biowire, para mejorar la maduración de HPSC-CM. El dispositivo se puede realizar en instalaciones de microfabricación estándar, y biowires puede ser producido con técnicas de cultivo celular comunes y un estimulador eléctrico.

Hasta donde sabemos, no existe un método similar al reportado biowires. Esta estrategia revela que la mejora de las propiedades de maduración eran dependientes de la pauta de est...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido L-ascórbico	Sigma	A-4544	hPSC-CM compuesto de medios de cultivo
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software para diseñar
dispositivo Varillas de carbono, Ø 3 mm			Componente de la cámara del estimulador eléctrico
Colágeno, tipo 1, cola de rata	BD Biosciences	354249	Gel de colágeno: 2,1 mg/mL de colágeno de cola de rata tipo I en 24,9 mM de glucosa, 23,8 mM de NaHCO3, 14,3 mM de NaOH, 10 mM de HEPES, en 1x M199 con 10 % de Matrigel reducido en factor de crecimiento.
Colagenasa tipo I	Sigma	C0130	0,2% colagenasa tipo I (p/v) y 20% FBS (v/v) en PBS con Ca2+ y Mg2+. Esterilizar con 0.22 μ m filtrar y hacer alícuotas de 12 mL. Almacenar a -20 °C.
Desoxirribonucleasa I (DNasa I)	EMD Millipore	260913-25MU	Prepare una solución madre de DNasa I de 1 mg/mL en agua. Filtre el estéril y almacene alícuotas de 0,5 mL a &menos; 20 ° C
Taladro y brocas (Ø 1 mm y 2 mm)	Dremel		Taladro agujeros en marcos de policarbonato
Estimulador eléctrico	Grass	s88x
Suero fetal bovino (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucosa	Sigma	G5767	Componente de gel
de colágeno L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ &punto medio; cm a 25 ° C, ultrapuro, para hacer todas las soluciones
HEPES	Sigma	H4034	Componente de gel de colágeno
Placa caliente	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
alineador de mascarillas	EVG	EVG 620
Matrigel, factor de crecimiento reducido	Corning	354230	Componente de gel de colágeno
Medio 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11825015	Componente de gel de colágeno
Monotioglicerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM compuesto de medios de cultivo
Agitador orbital	VWR	89032-088
Penicilina/estreptomicina (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Ca2+ y Mg2+	14040133		Thermo Fisher Scientific
(6 pocillos)	353046		Corning
(6 pocillos), fijación baja	Alambres de platino Corning	3471
0,2 mm			Componente de la cámara del estimulador eléctrico
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Éter monometílico de propilenglicol acetato (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		Para desarrollar la bolsa de oblea
, Convertidores de apertura despegable		92308	Para esterilización por vapor
Oblea de silicona, 4 pulgadas	UniversityWafer Inc.
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma	S5761	Componente de gel
de colágeno Hidróxido de sodio	Sigma	S8045	Componente de gel de colágeno
Recubridor Sprin	Sistemas de recubrimiento especiales	G3P-8
Medio de cultivo StemPro-34	Thermo Fisher Scientific	10639011	Medio de cultivo hPSC-CM. Para hacer 50 mL, agregue 1.3 mL de suplemento, 500 μ L de 100 veces; L-Glutamina, 250 μ L de 30 mg/mL de transferrina, 500 μ l de 5 mg/mL de ácido ascórbico, 150 μ L de 26 μ l /2 mL de monotioglicerol (MTG) y 500 μ L (1 %) penicilina/estreptomicina.
Medios			de parada Medio de lavado: FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		fotorresistente, componente maestro
SU-8 2050	MicroChem Corp.		fotorresistente, componente maestro
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM compuesto de medios de cultivo
Tripsina/EDTA, 0,25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM compuesto de medios de cultivo
Medio de lavado			IMDM que contiene 1% de penicilina/estreptomicina