El actual combina protocolo célula emparejados humano TCR alfa y beta cadena secuenciación con optimiza generación de vectores retrovirales compatibles con expresión de TCR in vitro e in vivo .
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Artículo de método
Aerodinámico unicelular TCR aislamiento y generación de vectores retrovirales para In Vitro y In Vivo expresión de TCR humana
En este artículo
Resumen
Resumen
Aunque se han desarrollado varios métodos para la secuencia de pares T cell receptor (TCR) alfa y beta las cadenas de las células T, ninguno hasta ahora han sido propicias para abajo en vivo análisis funcional de TCR heterodímeros. Hemos desarrollado un protocolo mejorado basado en una PCR multiplex nested dos pasos, que se traduce en un producto PCR que se extiende por toda las regiones variables de un humano cadenas alfa y beta TCR. Por identificación de sitios de restricción únicos e incorporarlos en los iniciadores PCR, hemos hecho el producto PCR compatible con directa sub clonación en el vector retroviral de la plantilla. El constructo retroviral resultante codifica un quimérico humano/ratón TCR con un dominio intracelular de ratón, que es funcional en células de ratón o en modelos de ratón en vivo . En general, el protocolo descrito aquí combina humano unicelular emparejado TCR alfa y beta cadena identificación con generación optimizada de vectores retrovirales fácilmente adaptables para la expresión de TCR in vitro e in vivo . El video y el material que lo acompaña están diseñados para dar una descripción muy detallada de la célula PCR, para que los pasos críticos pueden ser seguidos y potenciales peligros evitar. Además, ofrecemos una descripción detallada de las medidas clonaje necesarias para generar el vector de expresión. Una vez dominado, todo el procedimiento de célula clasificación a expresión de TCR puede realizarse en un corto período de dos semanas.
Introducción
El receptor T (TCR) dicta decisión de destino de la célula de T durante el desarrollo, homeostasis de estado estacionario y estimulación antigénica en la periferia1,2,3. La reciente expansión de tecnologías de secuenciación profunda ha descubierto una diversidad TCR anteriormente subestimada en las respuestas de células T específicas de antígeno. Diversidad de los TCR sugiere un potencial de respuestas de células T funcionalmente amplia. Para integrar el análisis de repertorio TCR secuencia con análisis funcionales de TCR, los métodos de secuenciación deben ser diseñados para....
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Protocolo
1. identificar la población de la célula de T de interés.
Nota: antígeno de proliferación específica en combinación con el tinte de la división celular (como éster de succinimidyl Carboxyfluorescein, CFSE) puede utilizarse para aislar las células de T se basa en su proliferación en respuesta a la estimulación antigénica. Si a partir de PBMCs, una expansión de 7 días en vitro debe ser suficiente para identificar un antígeno específico CFSE población bajo 12.
- PBMCs de mezcla 1:1 con las células de alimentador MHC-emparejado y etiqueta con tinte 5 de división de célula de la CFSE del μm.
- ....
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Resultados
La eficiencia de la reacción de PCR anidado multiplex se comprueba en el paso 3.2.7 (figura 2) ejecutando a 5μl de la segunda reacción en un gel de agarosa. En promedio se espera que la eficiencia de amplificación de TCR-beta sería alrededor del 80%, mientras que la eficiencia de la reacción de la TCR-alfa es generalmente más baja, en torno al 50%4. Sólo emparejadas cadenas TCR-alfa y TCR beta pueden utilizarse para la expresión del TC.......
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Discusión
En el actual protocolo, describimos un método eficiente para la célula TCR amplificación y posterior sub clonación de las cadenas de alfa y beta TCR de pares en un vector de expresión retroviral de la plantilla. Aunque se han desarrollado varios protocolos PCR unicelular, ninguno hasta ahora han sido compatible con la inmediata sub clonación en un vector de expresión. En la mayoría de los casos, se amplifica una secuencia parcial que abarca las regiones CDR3 altamente variables, con suficiente secuencia para extrapolar l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por la JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, DK079638-05 de la P30 del NIH 5 PJ de piloto y el Robert y Janice McNair Foundation.
Agradecemos a Sandra Peña y Andrene McDonald para el reclutamiento de pacientes, Samuel Blum para asistencia técnica, el Dr. George Makedonas por el regalo de control utilizado para la optimización de la PCR de DNA y anticuerpos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CFSE | eBiociencia | 65-0850-84 | 5 mM |
| anti-humano CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 mg/mL |
| de CD3 (OKT3) antihumano PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 mg/mL |
| anti-ratón CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2,5 mg/mL |
| Inhibidor de ARNasa recombinante biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems Kit RT de ADNc de alta capacidad | Invirtogen | 4368814 | 9 U (enzima RT) |
| NF-H2O: Agua sin nucleasa 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq ADN polimerasa 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Placa de PCR de media falda | de pozo Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Película adhesiva transparente | ThermoFisher | ||
| Agarosa ultrapura | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | Biolabs de Nueva Inglaterra | R0130 | 15 U (inserto) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (inserto) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (inserto) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (inserto) 80 U (vector) |
| Fosfatasa intestinal (CIP) de terneroNew | England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Ligasa rápida | Biolabs de Nueva Inglaterra | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps sistemas de purificación de ADN | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps Sistemas de purificación de ADN | Promega | A7640 | |
| Kit de limpieza y concentrador de ADN-25 | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 Kit de limpieza y concentrador de ADN-5 | Genesee Scientific | 11-306A | |
| Kit de extracción de gel QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QIAkit de purificación de PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | |
| Eficiencia de subclonación DH5a Células competentes | ThermoFisher | ||
| Transit LT-1 Reactivo 1mL (reactivo de transfección) | Mirus | ||
| BD FACS Aria II (clasificador) | BD | ||
| BD Fortessa (citómetro de flujo) | BD |
Referencias
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immun....
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Reimpresiones y permisos
