Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En respuesta al tratamiento antibiótico

Resumen

La eficacia antibiótica se determina más comúnmente mediante la realización de estudios cinéticos de eliminación y la medición de unidades formadoras de colonias (UFC). Al integrar la microscopía electrónica de barrido (SEM) con estos métodos estándar, podemos distinguir los efectos farmacológicos del tratamiento entre diferentes antibióticos.

Resumen

La evaluación de la acción antibiótica con el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos hacia las bacterias anaerobias es difícil y técnicamente exigente. Para obtener información sobre el posible MOA, los cambios morfológicos asociados con la exposición a los antibióticos se pueden visualizar mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La integración de la imagen de SEM con las curvas de muerte tradicionales puede mejorar nuestra comprensión de la acción de la droga y avanzar en el proceso de desarrollo de fármacos. Para probar esta premisa, las curvas de muerte y los estudios de SEM se llevaron a cabo utilizando fármacos con MOA conocido pero diferente (vancomicina y metronidazol). Las células de C. difficile (R20291) se cultivaron con o sin la presencia de antibiótico hasta 48 h. Durante todo el intervalo de 48 h, las células se recogieron en múltiples puntos de tiempo para determinar la eficacia de los antibióticos y de imágenes en el SEM. De acuerdo con los informes anteriores, vancomicina y metronidazol tuvo una actividad bactericida significativa después de 24 h de tratamiento, medida por la unidad formadora de colonias (UFC)Ting Usando la imagen de SEM se determinó que el metronidazol tuvo efectos significativos sobre la longitud celular (> 50% de reducción en la longitud de la célula para cada antibiótico, P <0,05) en comparación con los controles y la vancomicina. Aunque la respuesta fenotípica al tratamiento farmacológico no se ha documentado previamente de esta manera, son consistentes con el MOA del fármaco demostrando la versatilidad y fiabilidad de la formación de imágenes y las mediciones y la aplicación de esta técnica para otros compuestos experimentales.

Introducción

Clostridium difficile es una bacteria gram-positiva, formadora de esporas, causando aproximadamente 500,000 infecciones anualmente en los Estados Unidos y considerada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) como el nivel más alto de riesgo. ¹ En la última década se ha observado un considerable desarrollo de fármacos en antimicrobianos con actividad contra C. difficile . ^{2 , 3} Los estudios in vitro son un componente necesario del proceso de desarrollo del fármaco. Tradicionalmente, se usan estudios de susceptibilidad ....

Protocolo

1. Aislar C. difficile de diferentes fuentes ambientales o clínicas

1. Aislados medioambientales: Utilizando un calibre de algodón preesterilizado (ligeramente humedecido con NaCl al 0,85%), limpie con un hisopo la superficie de cualquier área de interés (piso, puerta, manija, estante, etc. ). ⁸ Asegúrese de usar guantes estériles y coloque el hisopo en un tubo esterilizado una vez completado.
2. Aislamientos clínicos (heces): Placa de 10 a 100 mg de muestras clínicas de heces en agar de cefoxitina-cicloserina-fructosa (CCFA) utilizando un bucle de inoculación e incubar bajo condiciones anaeróbicas estrictas du....

Resultados

Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas y por lo tanto es esencial para determinar las diferencias morfológicas entre las células vegetativas y esporas antes de cualquier análisis funcional. La Figura 1 muestra imágenes representativas de células vegetativas que fueron capturadas durante la fase exponencial de la curva de crecimiento y las células de esporas. Como se muestra, las células vegetativas son largas, lisas, estructuras en f.......

Discusión

El objetivo del presente estudio fue crear un método de alto rendimiento para aislar C. difficile y probar la susceptibilidad a los antibióticos mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) como medio para una caracterización más completa de la acción farmacológica del antibiótico. Usando los protocolos esbozados aquí, hemos demostrado que la obtención de imágenes de la respuesta fenotípica de la célula al tratamiento con antibióticos puede revelar una visión de la acción farmacológica del fármaco. En tota.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
gasa de algodón	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
tubos de 50 mL Falcon		352098
Brain Infusión Cardíaca (BHI)	Criterio	C5141
L-cisteína	Alfa Aesar	A10389
extracto de levadura	Criterio	C741
taurocolato de sodio	Alfa Aesar	A18346
cámara anaeróbica	Coy		vinyl cámara anaeróbica
cicloserinecefoxitina placas de agar fructosa (CCFA)	Sistemas anaerobios	AS-213
placas de agar sangre	Hardy diagnostica	A-10
reactivo de aglutinación de látex	Oxoid	DR1107A	C. diff kits
de prueba tubos de microcentrífuga	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehído	Fisher Scientific	50-259-98
portaobjetos de microscopio	J. Melvin marca liberada	7525M 75	x 25 mm
campana de flujo	Labconco	Clase II tipo A2	Cabina de bioseguridad
máquina de pulverización catódica de escritorio	Denton Vacuum	Desk II
cinta	Plastic Core	05072-AB	SPI Cinta de carbono adhesiva de doble cara
dorada	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375" Diámetro x .002"
Microscopio electrónico de barrido	FEI	XL-30

de lámina de oro gruesa