Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de Clostridium difficile En respuesta al tratamiento antibiótico

Summary

La eficacia antibiótica se determina más comúnmente mediante la realización de estudios cinéticos de eliminación y la medición de unidades formadoras de colonias (UFC). Al integrar la microscopía electrónica de barrido (SEM) con estos métodos estándar, podemos distinguir los efectos farmacológicos del tratamiento entre diferentes antibióticos.

Abstract

La evaluación de la acción antibiótica con el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos hacia las bacterias anaerobias es difícil y técnicamente exigente. Para obtener información sobre el posible MOA, los cambios morfológicos asociados con la exposición a los antibióticos se pueden visualizar mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La integración de la imagen de SEM con las curvas de muerte tradicionales puede mejorar nuestra comprensión de la acción de la droga y avanzar en el proceso de desarrollo de fármacos. Para probar esta premisa, las curvas de muerte y los estudios de SEM se llevaron a cabo utilizando fármacos con MOA conocido pero diferente (vancomicina y metronidazol). Las células de C. difficile (R20291) se cultivaron con o sin la presencia de antibiótico hasta 48 h. Durante todo el intervalo de 48 h, las células se recogieron en múltiples puntos de tiempo para determinar la eficacia de los antibióticos y de imágenes en el SEM. De acuerdo con los informes anteriores, vancomicina y metronidazol tuvo una actividad bactericida significativa después de 24 h de tratamiento, medida por la unidad formadora de colonias (UFC)Ting Usando la imagen de SEM se determinó que el metronidazol tuvo efectos significativos sobre la longitud celular (> 50% de reducción en la longitud de la célula para cada antibiótico, P <0,05) en comparación con los controles y la vancomicina. Aunque la respuesta fenotípica al tratamiento farmacológico no se ha documentado previamente de esta manera, son consistentes con el MOA del fármaco demostrando la versatilidad y fiabilidad de la formación de imágenes y las mediciones y la aplicación de esta técnica para otros compuestos experimentales.

Introduction

Clostridium difficile es una bacteria gram-positiva, formadora de esporas, causando aproximadamente 500,000 infecciones anualmente en los Estados Unidos y considerada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) como el nivel más alto de riesgo. ¹ En la última década se ha observado un considerable desarrollo de fármacos en antimicrobianos con actividad contra C. difficile . ^{2 , 3} Los estudios in vitro son un componente necesario del proceso de desarrollo del fármaco. Tradicionalmente, se usan estudios de susceptibilidad in vitro y matanza para validar futuros estudios en animales y otros in vivo .

Aunque estos métodos cumplen un papel importante para evaluar la acción de matar, no capturan la respuesta fenotípica de las células al tratamiento farmacológico. Mediante la incorporación de microscopía electrónica de barrido (SEM) conD matando los estudios cinéticos, una caracterización más completa de los efectos directos antibióticos es posible. ^{5 , 6 , 7} Aquí, se presenta un método en el que SEM se utiliza como un medio para perfilar la eficacia del tratamiento con antibióticos.

Protocol

1. Aislar C. difficile de diferentes fuentes ambientales o clínicas

1. Aislados medioambientales: Utilizando un calibre de algodón preesterilizado (ligeramente humedecido con NaCl al 0,85%), limpie con un hisopo la superficie de cualquier área de interés (piso, puerta, manija, estante, etc. ). ⁸ Asegúrese de usar guantes estériles y coloque el hisopo en un tubo esterilizado una vez completado.
2. Aislamientos clínicos (heces): Placa de 10 a 100 mg de muestras clínicas de heces en agar de cefoxitina-cicloserina-fructosa (CCFA) utilizando un bucle de inoculación e incubar bajo condiciones anaeróbicas estrictas durante 48 - 72 h. Almacenar colonias aisladas de C. difficile stock en cryovials a -80 ° C para análisis adicionales. ^{7 , 9 , 10}
3. Enriquecer las muestras de hisopo ambiental en infusión de corazón cerebral (BHI) caldo con taurocolato de sodio al 0,05% y colocar en una cámara anaeróbica a 37 ° Cdurante 5 días. Centrifugar 1 ml del cultivo a 10.000 xg y resuspender el sedimento en 100 μl de etanol.
4. Se colocan las células resuspendidas (50 μl) en placas de agar de fructosa de cicloserinecefoxitina (CCFA) e incuban en una cámara anaeróbica a 37 ° C durante 40-48 h. Almacenar colonias aisladas de C. difficile stock en cryovials a -80 ° C para análisis adicionales.
5. Pruebe las colonias sospechosas de C. difficile utilizando el reactivo de aglutinación de látex o PCR.

2. Cultivo de C. difficile y Killing Cinética Procedimientos

1. Cultivar cepas de C. difficile contaminadas con el medio ambiente o clínicas en placas de agar sangre en una cámara anaeróbica a 37 ° C durante 48 h.
2. Tomar una colonia aislada con un bucle de inoculación, transferirla a 5 mL de medio BHI en un tubo de 15 mL, y crecer durante 24 h en una cámara anaeróbica a 37 ° C.
3. Diluir el precultivo de 1: 100 a aproximadamente 10 ⁶ unidades de formación de colonias(CFU) / ml en BHIS pre-reducido fresco (BHI más 5 g / l de extracto de levadura y 1% de L-cisteína) suplementado con taurocolato de sodio al 0,1% y la concentración apropiada de antibiótico (T0).
4. Recoger una muestra de 1 mL con una pipeta en cada punto de tiempo (T0, T6, T24, T48) y extender una pequeña alícuota (100 μl en diluciones en serie) sobre una placa de agar sangre. Deje que las células crezcan en la placa de agar sangre durante 48 h en una cámara anaeróbica a 37 ° C y cuente el número resultante de colonias para determinar CFU.

3. Preparación de muestras para la microscopía electrónica de barrido

1. Recoger 1 mL de células de cada punto de tiempo en tubos de microcentrífuga y centrifugar a 10.000 xg durante 10 min. Desechar el sobrenadante y lavar las células en PBS.
2. Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 10 minutos y descartar el sobrenadante. Reducir las células en 1 mL de paraformaldehído al 4% e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Centrifugar nuevamente las muestras durante 10 min a 10,000 xg y desechar el sobrenadante. Lavar las células dos veces con agua destilada y rediluir en 100 μl de agua destilada. Ajuste el volumen dependiendo de la turbidez de la solución.
   NOTA: Hacer múltiples diluciones en serie es una buena idea.
4. Marque los cubreobjetos y añada 40 μl de la muestra. Incubar durante 15 minutos en una campana de flujo para evaporar el líquido y permitir que las células se adhieran a la cubreobjetos. Si todavía hay líquido, use un soplador para quitar el líquido.
5. Coloque los cubreobjetos marcados con las células en una máquina de pulverización de escritorio y cinta hacia abajo. Asegure el oro puro en la máquina de pulverización. Encienda la máquina y comience a pulverizar a baja presión (50 mTorr). Recubrir las células durante 30 s a 80 mA, lo que se traduce en 20 nm de recubrimiento de oro.
6. Transferencia de células revestidas al microscopio electrónico de barrido.

4. Imagen de células C. difficile en un microscopio electrónico de barrido

1. Ventilar el microscopio electrónico de barrido (SEM) correctamente por prEl botón de ventilación en el software de la computadora.
2. Usando cinta de carbón, asegure los cubreobjetos recubiertos sobre la platina metálica. Una vez que el SEM se ventila, la puerta debe abrirse fácilmente. Bloquee la etapa de metal en la cámara de SEM atornillándola.
3. Haga clic en el botón BOMBA en el software del ordenador. El SEM será utilizable cuando el sistema lea "Vac OK".
4. Haga clic en el detector de SE bajo la pestaña de detectores. Encienda la viga haciendo clic en el botón que muestra el voltaje. Comience la imagen a una tensión inferior (5 kV) antes de aumentar la tensión (hasta 15 kV). Una imagen aparecerá después de encender el haz.
5. Usando la función de rastreo, encuentre un área en los cubreobjetos recubiertos a la imagen. Zoom en la región y encontrar en forma de barras estructuras; Estos son clostridium difficile .
6. Acercar y enfocar la imagen para calibrar el sistema. Esto debe hacerse a múltiples distancias de trabajo: 15, 9 y 5 mm. Imagen a una distancia de trabajo de 5 mm.
7. Encienda el uLtra modo de imagen de alta resolución y comenzar a enfocar y optimizar el astigmatismo.
8. Comience a enfocar con una ampliación alta. Utilice los botones de enfoque grueso y fino para esto. Ajuste el astigmatismo también para obtener una imagen más clara.
   1. Ajustar el astigmatismo con gran aumento. Para ello, ajuste las teclas de astigmatismo (parecen similares a las de enfoque fino / grueso) y compruebe la claridad de la imagen haciendo zoom digitalmente en el software del ordenador.
9. La función de escaneado lento para recoger una imagen de alta calidad. Guarde la imagen recogida como un archivo .TIFF, que se utilizará para el análisis. Asegúrese de que la barra de datos esté seleccionada si se realizarán mediciones durante el análisis.
10. Recoja las imágenes en ángulos diferentes (hasta 52 ° girando manualmente el ángulo directamente sobre el SEM.) Las imágenes angulares tienden a revelar más información de profundidad.
11. Cambie el voltaje del haz dependiendo de las celdas que se están formando imágenes. Mantenga esto principalmente entre 5 - 15 kV para todos los experimentos.
12. Una vez completada la imagen, apague el haz y eleve la distancia de trabajo hasta 20 mm. La cámara puede ser ventilada y la etapa puede ser removida. Copie todas las imágenes en una unidad para un análisis posterior.

5. Procesamiento y análisis de imágenes

1. Descargue e instale el software libremente disponible, FIJI (http://fiji.sc), en la computadora.
2. Abra el archivo de imagen en FIJI.
3. Utilizando la función de línea, trace con precisión la barra de escala.
4. Haga clic en la pestaña Analizar en el programa FIJI y finalmente seleccione la función Seleccionar Escala. Aparecerá una ventana que requerirá el ajuste de la distancia conocida basada en la barra de escala. Cambie también la unidad de longitud y haga clic en Aceptar.
5. Ahora que el programa está calibrado para la distancia, utilice la función de línea para medir la longitud de la celda. Para obtener la longitud, utilice la función de línea para rastrear la célula en su totalidad. Seleccione de nuevo la pestaña Analizar y, a continuación, haga clic en Medir. La longitud debe aplicarOído en las unidades indicadas anteriormente.

Results

Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas y por lo tanto es esencial para determinar las diferencias morfológicas entre las células vegetativas y esporas antes de cualquier análisis funcional. La Figura 1 muestra imágenes representativas de células vegetativas que fueron capturadas durante la fase exponencial de la curva de crecimiento y las células de esporas. Como se muestra, las células vegetativas son largas, lisas, estructuras en f...

Discussion

El objetivo del presente estudio fue crear un método de alto rendimiento para aislar C. difficile y probar la susceptibilidad a los antibióticos mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) como medio para una caracterización más completa de la acción farmacológica del antibiótico. Usando los protocolos esbozados aquí, hemos demostrado que la obtención de imágenes de la respuesta fenotípica de la célula al tratamiento con antibióticos puede revelar una visión de la acción farmacológica del fármaco. En tota...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
gasa de algodón	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
tubos de 50 mL Falcon		352098
Brain Infusión Cardíaca (BHI)	Criterio	C5141
L-cisteína	Alfa Aesar	A10389
extracto de levadura	Criterio	C741
taurocolato de sodio	Alfa Aesar	A18346
cámara anaeróbica	Coy		vinyl cámara anaeróbica
cicloserinecefoxitina placas de agar fructosa (CCFA)	Sistemas anaerobios	AS-213
placas de agar sangre	Hardy diagnostica	A-10
reactivo de aglutinación de látex	Oxoid	DR1107A	C. diff kits
de prueba tubos de microcentrífuga	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehído	Fisher Scientific	50-259-98
portaobjetos de microscopio	J. Melvin marca liberada	7525M 75	x 25 mm
campana de flujo	Labconco	Clase II tipo A2	Cabina de bioseguridad
máquina de pulverización catódica de escritorio	Denton Vacuum	Desk II
cinta	Plastic Core	05072-AB	SPI Cinta de carbono adhesiva de doble cara
dorada	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375" Diámetro x .002"
Microscopio electrónico de barrido	FEI	XL-30