Artículo de método

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

DOI:

10.3791/55397

⸱

3 de abril de 2017

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1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

En este artículo

Resumen

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Aquí, proporcionamos una, de bajo costo fácil, y eficiente en el tiempo de protocolo para fijar químicamente el tejido cerebral de los primates con fijador acroleína, lo que permite la conservación a largo plazo que es compatible con inmunohistoquímica pre-inclusión para microscopía electrónica de transmisión.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pesar de todos los avances tecnológicos a nivel de microscopía óptica, microscopía electrónica sigue siendo la única herramienta en la neurociencia para examinar y caracterizar los detalles ultraestructurales y morfológicas de las neuronas, como los contactos sinápticos. Buena conservación de tejido cerebral para la microscopía electrónica se puede obtener por métodos crio-fijación rigurosos, pero estas técnicas son más bien costosos y limitar el uso de immunolabeling, que es crucial para entender la conectividad de los sistemas neuronales identificados. métodos de congelación y de sustitución se han desarrollado para permitir la combinación de la crio-fijación con inmunomarcación. Sin embargo, la reproducibilidad de estos enfoques metodológicos por lo general se basa en dispositivos de congelación costosos. Por otra parte, la obtención de resultados fiables con esta técnica es mucho tiempo y habilidad desafiante. Por lo tanto, el tradicional cerebro químicamente fija, particularmente con fijador acroleína, sigue siendo un método eficiente en el tiempo y de bajo costo para combinar de electronesLa microscopía con inmunohistoquímica. Aquí, proporcionamos un protocolo experimental fiable usando fijación acroleína química que conduce a la preservación de tejido cerebral de los primates y es compatible con pre-incrustación de inmunohistoquímica y la transmisión de electrones examen microscópico.

Introducción

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Microscopía de luz, incluyendo confocal y microscopía de dos fotones, ha demostrado ser una herramienta eficaz para el estudio de los procesos neuronales in vivo, entre otras cosas 1, 2. Aunque la resolución espacial típica a nivel microscópico de luz (LM) es de aproximadamente 200 nm, los recientes avances tecnológicos utilizando diferentes fuentes de luz, como la luz ultravioleta extrema y microscopía de rayos X blandos, se han incrementado notablemente la presente resolución a una resolución espacial de casi 10 nm 3 , 4, 5. Otros avances tecnológicos en formación de imágenes incluyen combinar imágenes de resonancia magnética con histología y proporcionar un nuevo método para medir el espesor de la vaina de mielina in vivo, un parámetro que fue tradicionalmente mensurable sólo a nivel de microscopía electrónica (EM) 6, 7. although estos avances en el plano LM proporcionan una excelente herramienta para el estudio de los procesos vivos, una vista detallada y caracterización de estructuras, tales como contactos sinápticos, sólo puede lograrse con EM, lo que ofrece una resolución que puede alcanzar 0,5 nm. Sin embargo, la observación en el nivel EM requiere los especímenes estar muerto y alterado de alguna manera, con fijadores químicos y procesos de deshidratación, con el fin de preservar la citoarquitectura. Por lo tanto, el examen de muestras biológicas en alta resolución puede ser un reto debido al daño por radiación de haz de electrones, bajo contraste, las desviaciones estructurales de las membranas, o incluso la presencia de artefactos que pueden ocurrir después de la deshidratación y epoxi incrustación de 8, 9, 10.

La preservación de especímenes en su forma nativa para el análisis estructural se puede lograr mediante el uso de "Cryo EM de las secciones vitrificados" o CEMOVIS, un enfoque de seccionamiento queconsiste en congelar rápidamente y la incrustación de la muestra en hielo vítreo y el examen de las secciones bajo la EM a una temperatura criogénica 11, 12. Este procedimiento permite el examen de muestras, mientras que todavía son sólidos y completamente hidratado, la eliminación de artefactos causados por la deshidratación de este modo procesa 13. Sin embargo, este método implica dispositivos adicionales para la crio-ultramicrotomía, así como dispositivos adicionales en el estándar de EM, con el fin de permitir que esta observación a muy bajas temperaturas, que generan costes adicionales significativos. Además, el enfoque CEMOVIS impide el uso de técnicas de inmunomarcaje, ya que los anticuerpos por lo general tienen que ser incubaron a RT. Alternativamente, es posible combinar el análisis ultraestructural con procedimientos inmunohistoquímicos utilizando un enfoque de congelación-sustitución, durante el cual las muestras crio-fija se descongelan lentamente mientras sumergido en productos químicos crio-protector y son then incrustado en resinas especializadas, tales como Lowicryls. Post-incrustación immunolabeling entonces se puede realizar en tal material 12. Sin embargo, las técnicas de congelación-sustitución y crio-fijación son mucho tiempo. Requieren la instalación de equipo adicional y todavía requieren muestras de estar expuestos a disolvente orgánico y fijador químico que puede alterar la citoarquitectura, a pesar del uso de una temperatura baja 14, 15. Por lo tanto, a pesar de todos los avances tecnológicos tanto en el LM y el nivel EM, la fijación química del tejido cerebral, en particular con acroleína, sigue siendo un método de bajo costo y eficiente en el tiempo para combinar inmunohistoquímica con EM 16.

En las últimas décadas, se hicieron muchos intentos para encontrar una mezcla de aldehídos que proporcionan la mejor conservación del tejido. Antes de la década de 1960, el único fijador químico que dio resultados aceptables para EM era tetróxido de osmio. Sin embargo, tetróxido de osmio es muy tóxico y caro, lo que impide su uso a través del sistema vascular para fijar órganos tales como el cerebro. La acroleína se introdujo a finales de la década de 1950 como un método fiable para la conservación del tejido animal adecuado para EM observación de las estructuras celulares 17. Se penetra en el tejido más profundamente y reacciona más rápidamente que otros aldehídos cuando se utilizan para la fijación por inmersión y permite una buena conservación de los componentes citoplasmáticos, con contracción mínima del tejido 17. Tal característica proporciona la fijación acroleína una clara ventaja sobre otros aldehídos cuando se usa en tejido fresco, por lo que permite una localización más precisa de vivir compuestos moleculares, tales como enzimas y otras proteínas 18. De hecho, se ha validado a través de los años como un método fácil, eficiente y de bajo costo de fijación para la visualización a nivel de EM en muchas especies, incluyendo anfibios y roedores, ya que de manera eficiente StAbILIzes péptidos y proteínas, conserva la antigenicidad y proporciona ultraestructura relativamente intacto cuando se utiliza en combinación con otro aldehído fijador 16, 18, 19, 20, 21. Los protocolos para la fijación de la acroleína en roedores Desde entonces se han normalizado y utilizado ampliamente, en particular por el grupo Pickel, para poner en práctica la doble inmunomarcación para EM 16, 22. Unos pocos grupos han utilizado la fijación acroleína en el tejido cerebral de primates no humanos 23. Sin embargo, para nuestro conocimiento, no es sólo un protocolo publicado que describe de manera eficiente fijación química con acroleína en primates no humanos que es compatible con EM immunolabeling 24.

En este artículo, proporcionamos un método sencillo y fiable para solucionar de manera eficiente químicamente no-humun cerebro de primates con acroleína, lo que permite una conservación potencialmente a largo plazo junto con pre-incrustación immunolabeling y EM transmisión examen.

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Protocolo

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Ética Declaración: Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección des Animaux de l'Université Laval y se hicieron de acuerdo con el Consejo Canadiense de la Guía del Cuidado de Animales para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (2 ed.). El protocolo descrito aquí se optimizó para los animales adultos de aproximadamente 800 g. Los volúmenes de fijador se deben ajustar de acuerdo con el tamaño del animal.

1. Preparación de soluciones para perfusión transcardiaca

  1. Preparar 1 L de una solución 50 mM tamponada con fosfato de sodio salino (PBS) de acuerdo con los siguientes pasos. Preparar la solución de a lo sumo 24 h antes de la perfusión y mantener a 4 ° C hasta su uso.
    1. Medir 800 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 1 L. Añadir 5,87 g de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na 2 HPO 4), 1,20 g de fosfato monobásico de sodio monohidratado (NaH 2 PO 4 · H 2 O), y 9 gde cloruro de sodio (NaCl). Agitar para disolver.
    2. Ajustar el pH a 7,4 mediante la adición gradual de NaOH 5 N. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 1 L.
      PRECAUCIÓN: NaOH es un compuesto químico corrosivo. Use el equipo de protección individual (EPI;. Bata de laboratorio, guantes, gafas de protección, etc.).
  2. Preparar 2 L de 4% de paraformaldehído (PFA) de acuerdo con los siguientes pasos. Esta solución debe prepararse un máximo de 24 h antes de la cirugía y se mantiene a 4 ° C hasta su uso.
    1. Mida 1,5 L de agua destilada en un 2-L vaso de precipitados. Añadir 23.48 g de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na 2 HPO 4) y 4,80 g de fosfato monobásico de sodio monohidratado (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Agitar para disolver. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 2 L.
    2. Calentar la solución en una campana de ventilación hasta que la temperatura alcanza aproximadamente 45 - 55 ° C. No caliente a más de 60 ° C.
    3. Añadir poco a poco 80 g de PFA a la solución y se agita hasta que se disuelva completamente (aproximadamente 30 - 60 min). Mantener el control de la temperatura para mantenerlo por debajo de 60 ° C.
      PRECAUCIÓN: PFA es altamente volátil en su forma de polvo. Es altamente tóxico si entra en contacto con los ojos o de la piel y es peligroso en caso de inhalación o ingestión. Usar el EPP y utilizar con precaución en una campana de ventilación.
    4. Enfriar la solución a 4 ° C y el filtro. Almacenar a 4 ° C.
  3. Preparar 1 L de 3% de acroleína en 0,1 M de tampón fosfato (PB) de acuerdo con los siguientes pasos. La solución de PB debe ser preparado como máximo 24 h antes de la perfusión.
    PRECAUCIÓN: La acroleína es altamente tóxico si se inhala y puede producir daños inmediatos. También es corrosivo y altamente tóxico si se absorbe a través de la piel. Es cancerígeno y mutagénico. Use el PPE apropiado y utilizar bajo una campana de ventilación.
    1. Medir 800 ml de agua destilada. Añadir 8,66 g de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na 2 HPO 4) y 5,38 g de fosfato monobásico de sodio monohidratado (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Se agita hasta que todas las sales se disuelven. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 1 L. Mantener la solución a 4 ° C.
    2. Antes de la cirugía, la transferencia de 900 ml de la solución de PB a un recipiente de vidrio de 1 L y añadir 30,94 ml de solución de acroleína 97% bajo una campana de ventilación. Añadir solución de PB para llegar a un volumen total de 1 L y se agita. Filtrar la solución y mantenerla a 4 ° C.

2. transcardíaca de perfusión cerebral y disección

  1. Mantener las soluciones en hielo durante todo el procedimiento quirúrgico. Preparar la bomba colocando el tubo en la primera solución para ser utilizado (PBS; 50 mM) y girando la bomba hasta que no quede aire en la manguera. Para la perfusión transcardiaca de un mono macaco, utilizar una aguja 21 G y establecer el flujo de salida en aproximadamente 80 ml / min.
  2. Anestesiar al animal con una inyección intramuscular de una mezclature de ketamina (20 mg / kg), xilazina (4 mg / kg), y acepromacina (0,5 mg / kg). Mantener el animal bajo isoflurano sedación (3%).
  3. Fije las extremidades del animal a una mesa de ventilación.
  4. Con un bisturí, quitar la piel hasta las axilas. Cortar los músculos abdominales. Use las tijeras quirúrgicas de alta resistencia para cortar las costillas lateralmente, evitando cuidadosamente los órganos vitales.
  5. Cortar el diafragma con tijeras quirúrgicas y elevar la caja torácica para exponer el corazón. Una vez que se corta el diafragma, proceda con rapidez, ya que el corazón deja de latir en cuestión de minutos.
  6. Retire el pericardio con una hoja de bisturí e insertar la aguja en el ventrículo izquierdo. Con un bisturí, cuidadosamente hacer una pequeña escisión de la aurícula derecha. iniciar rápidamente la bomba a 72 ml / min y mantener la aguja en su lugar. Si es posible, incline el animal con el fin de tener su cabeza en un nivel más bajo que el corazón.
    NOTA: Tenga cuidado de no perforar el tabique interventricular al insertar la aguja.
    1. Rinse la sangre con aproximadamente 300 ml de PBS hasta que los pulmones son de color blanco y no sale sangre de la aurícula derecha.
  7. Parar la bomba, de forma rápida la transferencia de la manguera / tubo a la solución de acroleína 3%, y empezar de nuevo la bomba. Poco a poco aumentar la velocidad de bombeo a 80 mL / min una vez que el corazón ha dejado de latir. Perfundir aproximadamente 500 ml de la solución de acroleína.
  8. Parar la bomba, de forma rápida transferencia de la manguera a la solución de PFA al 4%, y empezar de nuevo la bomba. Este paso requiere aproximadamente 1 L de PFA.
    NOTA: La fijación se completa cuando las extremidades anteriores son rígidos y el cuello está rígido.
  9. Cortar la cabeza y diseccionar cuidadosamente el cerebro fuera del cráneo. Tenga cuidado de no dañar el cerebro con los instrumentos quirúrgicos. La perfusión es óptima cuando el cerebro está pálido (ningún rastro de sangre) y rígido (Figura 1A).
  10. Sumergir el cerebro intacto en PFA al 4% durante 1 hora a 4 ° C.
  11. En serie cortar el cerebro con un enfriamiento vibratome (4 ° C)en el plano deseado en 50! m de espesor secciones y recogerlas en PBS (0,1 M) (Figura 1B).
    NOTA: Este paso puede llevarse a cabo de muchas maneras según el protocolo deseado. Hemisferios se pueden separar antes de vibratome de corte, o toda mantenido. Si el cerebro es demasiado grande para la plataforma vibratome, se puede cortar en bloques más pequeños. Después de este paso, las secciones se pueden almacenar durante un largo período de tiempo a -30 ° C en una solución anticongelante hecha de 40% PB (50 mM), 30% de glicerol, y 30% de etilenglicol.

Inmunohistoquímica 3. Pre-incrustación (Figura 1C)

  1. Preparar un 4 L solución madre de tampón Tris salino (TBS, 50 mM, pH 7,6) como sigue.
    1. Mida 2 l de agua destilada en un vaso de precipitados de 4 L, añadir 24,23 g de aminometano trihidroximetil (THAM; C 4 H 11 NO 3), y agitar hasta disolver.
    2. Ajustar el pH a 7,6 con aproximadamente 148 ml de HCl 1 N. El ácido se debe añadir con ITUACen para evitar llegar a un pH inferior a 7,6. El volumen total debe ser de 4 L.
      PRECAUCIÓN: HCl es altamente corrosivo. Llevar el EPP apropiado.
  2. Seleccione las secciones (de la etapa 2.11) que contienen la región de interés a ser procesados ​​para EM inmunohistoquímica.
  3. Lavar las secciones de flotación libre 3x en PBS (0,1 M, pH 7,4) durante 5 min a RT para enjuagar la solución anticongelante.
  4. Preparar una solución de 0,5% de NaBH 4 diluido en PBS.
    1. Pesar 0,05 g de NaBH4 y se diluye en 10 ml de PBS. No cubrir. Preparar esta solución justo antes de su uso.
  5. Incubar las secciones en la solución recién preparada NaBH 4 durante 30 min a RT. Agite con cuidado. No cubrir.
  6. Lavar 3x en PBS durante 10 min a TA, meciéndose vigorosamente hasta que ninguno de gas de reacción se mantiene.
  7. Preparar una solución de bloqueo durante EM con 2% de suero normal apropiado y 0,5% de gelatina de pescado frío diluido en PBS.
    NOTA: La cantidad should ser calculado con el fin de tener suficiente para los tres pasos siguientes. Utilizar un suero a partir de la misma especie animal que alojan el anticuerpo secundario. Evitar el uso de métodos de recuperación de antígeno o adición de pequeñas cantidades de triton (para aumentar la penetración de los anticuerpos), ya que estos métodos comprometer significativamente la calidad del tejido.
  8. Incubar las secciones en la solución de bloqueo durante 1 h a TA. Agite con cuidado.
  9. Preparar la solución de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo.
    NOTA: La concentración del anticuerpo primario es generalmente el mismo que para la inmunohistoquímica LM, pero debe tener en cuenta la realización de ensayos con diferentes concentraciones de anticuerpo de antemano, ya que algunos anticuerpos primarios pueden no funcionar con acroleína. Si es así, es posible utilizar una mezcla de glutaraldehído (0,1 - 2%) y 4% PFA para la perfusión transcardiaca y obtener resultados similares. Optimizar el tiempo de incubación y la temperatura también.
  10. Incubar las secciones en solución de anticuerpo primariodurante la noche a RT con agitación suave. Utilice un tiempo de incubación previamente probado y temperatura.
  11. Lavar las secciones 3x en PBS durante 5 min a TA con suave balanceo.
  12. Preparar una solución 1: 1000 de anticuerpo secundario biotinilado diluido en la solución de bloqueo.
    NOTA: El anticuerpo secundario debe elevarse contra la especie huésped utilizadas para generar el anticuerpo primario.
  13. Incubar las secciones en solución de anticuerpo secundario durante 1,5 h a TA. Agite con cuidado.
  14. Preparar una solución de avidina-biotina-peroxidasa (ABC) al menos 60 min antes de la final de la incubación el anticuerpo secundario.
    1. Utilizar una pipeta calibrada para medir 8,80 l / ml de las soluciones A y B y se diluye en PBS.
    2. Roca suavemente durante al menos 60 min a RT para permitir la unión entre las moléculas de avidina y biotina completa.
  15. Después de la incubación en solución de anticuerpo secundario, lavar 3x en PBS durante 10 min a TA.
  16. Se incuban las secciones en el modo ABClution durante 1 h a TA. Agite con cuidado.
  17. Lavar una vez en PBS y dos veces en TBS durante 10 min a TA con suave balanceo.
  18. Se prepara una solución fresca de 0,05% de 3,3'-diaminobencidina (DAB) con 0,005% de H 2 O 2 diluido en TBS.
    1. Pesar 12,5 mg de DAB y diluir en 25 ml de TBS frío. Proteger de la luz.
      PRECAUCIÓN: El polvo DAB es muy volátil y nocivo si se inhala. Es cancerígeno y teratogénico. Por lo tanto, las mujeres embarazadas o lactantes no deben manipular este producto, incluso cuando se diluye. Usar una máscara N95 al manipular y usar el EPP.
    2. Filtrar la solución y añadir 4,5 l de 30% de H 2 O 2 justo antes del uso.
  19. Incubar las secciones en la solución DAB durante 3 a 7 min a TA. Agite con cuidado.
    NOTA: El precipitado marrón no debe ser demasiado oscuro para evitar un alto nivel de tinción de fondo. El tiempo de incubación debe ser optimizado en consecuencia.
  20. Detener la reacción lavando dos veces rápidamenteen TBS frío, luego dos veces durante 10 min en TBS frío a TA, seguido de dos veces durante 10 min en PB, con balanceo suave.
    NOTA: El uso de PB (y no PBS) es crítica con el fin de eliminar cualquier traza de NaCl, ya que reaccionaría con cristales de osmio y la forma.

4. Osmification e incrustación de electrones observación microscópica

  1. Preparar una solución de 1% de tetróxido de osmio (OsO4) diluido en PB. Proteger de la luz.
    PRECAUCIÓN: El osmio es muy tóxico y no debe entrar en contacto con la piel, los ojos o la boca y no debe ser inhalado. Puede causar la muerte si se ingiere. Sólo se debe utilizar en una campana de ventilación y con PPE apropiado.
  2. Incubar las secciones en OsO4 solución durante 30 min a TA bajo el capó de ventilación (sin agitación) y cubrir con papel de aluminio para protegerlas de la luz. Completamente aplanar las secciones antes de añadir la solución de OsO4.
    NOTA: Las secciones se vuelven muy oscuro y riGID y deben ser manipulados con cuidado después de este paso.
  3. Preparar resina epoxi repelente al agua durante el osmification.
    1. Añadir cantidades apropiadas de cada componente de la mezcla de resina epoxi (20 g de resina epoxi, 20 g de endurecedor, 0,6 g de acelerador y 0,4 g de plastificante) a un gran vaso de plástico. Agitar con una varilla de madera o pipeta de plástico hasta que se obtiene un color marrón homogénea.
      NOTA: Es importante utilizar la proporción exacta de cada componente.
    2. Transferencia de cantidades iguales a recipientes de aluminio de tamaños apropiados, dependiendo del número de secciones a procesar. Deje reposar.
  4. Lavar las secciones osmificated 3x en PB durante 10 min a RT con balanceo de baja velocidad.
  5. Deshidratar las secciones en la siguiente serie de etanol graduado durante 2 minutos cada uno: 2 veces en 35% de etanol; 1 vez cada uno en 50, 70, 80, 90, y 95% de etanol; y 3 veces en etanol al 100%.
  6. Transferir las secciones a viales de vidrio para completar los dehydratien proceso mediante la incubación de las secciones 3 veces durante 2 minutos en óxido de propileno.
    PRECAUCIÓN: El óxido de propileno es un disolvente orgánico muy volátil y tóxico. Puede causar graves daños a los ojos o la piel en caso de contacto o si se inhala o se ingiere. Ha sido clasificado como una sustancia cancerígena grado 2. Sólo se debe utilizar en una campana de ventilación y con PPE. También es altamente inflamable y debe mantenerse alejado de cualquier fuente de calor.
    NOTA: Antes de este paso, las secciones deben ser transferidos cuidadosamente en viales de vidrio, ya que el óxido de propileno es un disolvente orgánico y es incompatible con el plástico. En este punto, las secciones son muy frágiles y deben ser manipulados con cuidado. Secciones se pueden transferir alternativamente a viales de vidrio antes de la etapa 4.5.
  7. secciones de transferencia con cuidado, uno por uno, en las copas de aluminio y evitar el contacto con el aire tanto como sea posible. -Flat incrustar las secciones en resina epoxi repelente al agua previamente mezclada y se incuba durante la noche bajo la venting campana a TA.
    NOTA: En este paso, las secciones son completamente deshidratado y muy frágil y debe manipularse con cuidado.
  8. El uso de aceite mineral, preparar portaobjetos de vidrio recubierto con grasa junto con cubreobjetos de plástico engrasados.
  9. Ablandar la resina mediante la incubación de tazas de aluminio a 60 ° C durante 12-15 min como máximo. aplanar cuidadosamente las secciones en el lado engrasado de la lámina de vidrio. Coloque el cubreobjetos engrasado y empuje con cuidado para sacar el aire restante.
  10. Incubar los portaobjetos a 60 ° C durante 48 h.
    NOTA: Es fundamental para no exceder de 48 h de tiempo de incubación, como la resina será demasiado duro.
  11. Quitar el cubreobjetos de plástico.

5. Preparación de muestras para ultrafino Seccionamiento y la observación usando un microscopio electrónico de transmisión

  1. Utilizar binoculares para encontrar la región de interés y cortar un pequeño trozo cuadrangular de aproximadamente 1 mm 2 con un bisturí.
  2. Archivo de la punta de un bloque de resina y la cola de la qupiece adrangular sobre ella (Figura 1C). Deje que el pegamento se seque durante al menos 1 h o durante la noche antes de seccionar.
  3. El uso de un ultramicrotomo, cortar la pieza cuadrangular en 80 secciones micras de espesor (Figura 1D).
    1. Coloque el bloque de resina en una cubierta ultramicrotomo en la posición vertical y, usando una hoja de afeitar afilada, corte gradualmente cada lado del bloque de resina para formar un trapecio con lados lisos.
    2. Ponga la cubierta en su posición horizontal y girar el bloque hasta que el lado más largo del trapecio quede hacia abajo.
    3. Utilice una herramienta de diamante de corte o una cuchilla de vidrio para recortar la superficie de la pieza cuadrangular. Ajuste el ultramicrotomo para cortar 300 micras de espesor secciones a 1 mm / s. Ajuste el cuchillo para ser verticalmente paralela a la pieza cuadrangular y para mostrar un ángulo muy pequeño horizontal de aproximadamente 1 °.
      NOTA: Este ángulo le permitirá al usuario acercarse al tejido casi paralelo a la superficie de la bbloquear, donde es más probable que se encuentre elementos immunolabeled. Cuando se utilizan estos parámetros con la herramienta de diamante de corte, la resina muestra un color blanco brillante. Cuando se corta el tejido, cambia a un color púrpura o verdoso.
    4. Utilice un ultra cuchillo de diamante 45 ° equipado con un bote lleno de agua destilada para cortar 80 micras de espesor secciones, suavizar secciones pasando por encima de ellos con un trozo de papel con punta en xileno de absorción, y recoger las secciones de serie en rejillas-formvar recubierto tragamonedas de níquel o desnudas 150 rejillas de cobre de malla (Figura 1E).
  4. Colocar las rejillas en una caja de almacenamiento de red.
  5. Tinción de las rejillas con citrato de plomo.
    1. Utilice una jeringa de 5 ml y un filtro de jeringa de 0,2 micras para preparar una solución 1: 1 de solución madre de citrato de plomo filtrada y agua destilada filtrada. Protegerlo de la luz.
      NOTA: La solución madre de citrato de plomo debe hacerse fresco cada mes para evitar la formación de sólidos DEPOSsus. Consulte la hoja de datos de la receta de valores. Además, si es necesario teñirlos muchas series de rejillas, cambiar la solución diluida cuando se vuelve lechoso.
    2. Colocar cada rejilla sobre una gota de la solución diluida, con la sección en contacto con la solución. Incubar durante 3 min.
    3. Utilice pequeñas pinzas para sostener la red, y enjuagar bien en dos vasos de precipitados que contienen agua destilada.
    4. Eliminar el exceso de agua mediante el uso suavemente papel absorbente. Almacenar las rejillas en una celda de la malla. Esperar 30 min antes de examinar las secciones por microscopía electrónica de transmisión (TEM; Figura 1F).

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Resultados

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En esta sección, se presentan los resultados representativos que se obtuvieron después de la observación, en el nivel EM transmisión, del tejido cerebral de primates a inmunotinción fija químicamente con una mezcla de 3% de acroleína y 4% PFA. Hemos logrado una buena conservación de la ultraestructura, como se indica por la vaina de mielina relativamente intacto y la visualización ordenada de membranas dobles (Figura 2A). Contactos sinápticos, además de elementos neurona...

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Discusión

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En este artículo, se presenta un protocolo fiable para la perfusión transcardiaca de primates no humanos y la inmunohistoquímica pre-incrustación adecuado para el examen de la muestra EM. Aunque típica crio-EM, tales como CEMOVIS, proporciona una buena preservación de la ultraestructura del cerebro, sino que también limita el uso de inmunohistoquímica 12. Otras técnicas, incluyendo la crio-sustitución y técnica Tokuyaso, permiten post-incrustación de inmunohistoquímica, pero estas técnicas son ca...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, 401.848 a 2.011 a MP). MP recibió un premio de la carrera desde el Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE fue el beneficiario de una beca de doctorado de las FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Agradecemos a Marie-Josée Wallman para la asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fosfato de sodio anhidro dibásico (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
Fosfato de sodio monobásico monohidrato (NaH2PO4· H2O)EM ScienceSX0710-1
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher scientificS271-3
Hidroximetilaminometano (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl EMDHX0603-3Dilución 1 N. El producto es corrosivo. Úselo con la protección adecuada.
Dilución de NaOHEMDSX0590-15 N. El producto es corrosivo. Úselo con la protección adecuada.
Paraformaldehído (PFA)SigmaP6148Dilución al 4%. El producto es altamente volátil en su forma de polvo y altamente tóxico. Úselo con precaución debajo de una campana de ventilación con la protección adecuada.
Acroleína (90%)Sigma110221dilución al 3%. El producto es altamente tóxico. Úselo debajo de una campana de ventilación con la protección adecuada.
Mesa de ventilación para autopsiasMopecCE400
Bomba de perfusión electrónicacole parmermasterflex L/S 7523-90
Aguja (perfusión)terumo NN-1838R18 G 11/2
Agujaterumo NN-2713R21 G 1/2
Ketamina20 mg/kg
Xilacina4 mg/kg
Acepromazina0,5 mg/kg
Bisturí
Hojas de bisturíPluma                    Lanza201011                    J9913Nº 22 para cirugía y Nº 11 para EM
Tijeras quirúrgicas
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200SCalibrar la cuchilla antes de cada uso, cuando el dispositivo lo permita
Hoja de afeitar VibratomeGilletteGIN 642107
GlycerolFisher scientificG33-430% dilución
EtilenglicolFisher scientificE178-430%
dilución Borohidruro de sodio (NaBH4)SigmaS-9125
Suero normal de caballo (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-121% de dilución
Gelatina de pescado fríoAurion900.0330,5% de dilución. El producto original se concentra al 40%
Anticuerpo primario, SERTSanta Cruz biotechnologySC-1458Dilución 1/500
Anticuerpo primario, ChATChemicon (Millipore)AB144PDilución 1/25
Anticuerpo primario, THImmunoStar22941Dilución 1/1.000
Anticuerpo secundario biotinilado, cabraLaboratorios de vectoresBA-95001/1.000 dilución
Anticuerpo secundario biotinilado, ratónLaboratorios de vectoresBA-2000Dilución 1/1.000
Vectastain elite ABC kitLaboratorios de vectoresPK61008.8 y micro; L/mL de A y B cada uno
3,3'-diaminobenzidina (DAB)SigmaD5637dilución al 0,05%. El producto es altamente volátil en su forma de polvo y tóxico. No tires los residuos en el fregadero.
Peróxido (H2O2) 30%Fisher scientificH-3230.005%
dilución Tetróxido de osmio (OsO4)Ciencia de microscopía electrónica2% 19152
4% 19150
La solución original puede ser 2 o 4%. Preste atención a cuál se utiliza para calcular la dilución final del 1%. El producto es muy sensible a la luz. El osmio es altamente tóxico. Úselo solo debajo de una campana de ventilación con la protección adecuada.
Resina epoxi hidrófuga DurcupanSigmaA: M resina epoxi (44611)
B: endurecedor 964 (44612)
C: acelerador 960 (DY 060) (44613)
D: plastificante (44614) 		Polimerizar 48 h a 58 &° C antes de tirar la basura.
Tazas de aluminioCiencia de la microscopía electrónica70048-01
Etanolalcoholes comerciales1019CDiluido en agua destilada con la concentración adecuada
Óxido de propileno Ciencia dela microscopía electrónica20401Disolvente orgánico. Altamente volátil y tóxico. Úselo debajo de una campana de ventilación.
Portaobjetos de vidrio medio sin recubrimiento laboratoriosinvestigación cerebral3875-FRSuperficie de grasa con aceite mineral
Película de plástico (película de incrustación Aclar)Ciencia microscópica electrónica50425-25 Superficie degrasa con aceite mineral
UltramicrótomoLeica UC7EM UC7
Herramienta de corte de diamante (ultratrim)Diatome UT 1081Puede usar un cuchillo de vidrio alternativamente
Ultra 45 & deg; Diatome Cuchillo de diamanteDiatome MC13437equipado con un barco
XilenesFisher scientificX5SK-4
Rejillas de cobre de 150 mallasCiencia de microscopía electrónicaG150-cu
Caja de rejillamicroscopía electrónica71138Puede almacenar hasta 100 rejillas
Citrato de sodioAnachemia81983
Nitrato de plomoSigmaL-6258Haga una solución madre de citrato de plomo hecha de 1.33   g de nitrato de plomo y 1,76   g de citrato de sodio diluido en 42 ngs; mL de agua destilada prehervida y enfriada a la que 8  mL de 1  Los N NaOH se agregan después de que se completa la conversión de nitrato de plomo a citrato de plomo. El pH debe ser de aproximadamente 12. Guarde la solución en una botella de plástico hermética y protéjala de la luz.
Jeringaterumo SS-05L5 mL
Filtro de jeringaCorning4312220.2 y micro; m
Papel absorbente (papel bibuloso)Ciencia microscópica electrónica70086-1
Parafilm Películade laboratorio PM-999
Aceite mineralSigmaM5904
2 de de

Referencias

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