La evaluación simultánea de Hemodinámica cerebral y propiedades de dispersión de luz de la En Vivo Cerebro de rata utilizando multiespectral de imágenes de reflectancia difusa

Summary

La evaluación simultánea de la hemodinámica cerebral y las propiedades de dispersión de luz de ratas in vivo en el tejido cerebral se demuestra usando un sistema de imagen de reflectancia difusa multiespectral convencional.

Abstract

La evaluación simultánea de la hemodinámica cerebral y las propiedades de dispersión de la luz del tejido cerebral de rata in vivo se demuestra utilizando un sistema convencional de imágenes de reflectancia difusa multiespectral. Este sistema está construido a partir de una fuente de luz blanca de banda ancha, una rueda de filtros motorizada con un conjunto de filtros de interferencia de banda estrecha, una guía de luz, una lente colectora, una lente de zoom de video y una cámara de dispositivo monocromático de acoplamiento cargado (CCD). Se realiza una ventana craneal elipsoidal en el hueso del cráneo de una rata bajo anestesia con isoflurano para capturar imágenes de reflectancia difusa multiespectrales in vivo de la superficie cortical. La regulación de la fracción de oxígeno inspirado mediante un dispositivo de mezcla de gases permite la inducción de diferentes estados respiratorios como normoxia, hiperoxia y anoxia. A continuación, se realiza un análisis de regresión múltiple basado en simulación de Monte Carlo para las imágenes de reflectancia difusa multiespectrales medidas en nueve longitudes de onda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 y 760 nm) para visualizar los mapas bidimensionales de la hemodinámica y las propiedades de dispersión de la luz del cerebro de rata in vivo.

Introduction

La imagen de reflectancia difusa multiespectral es la técnica más común para obtener un mapa espacial de señales ópticas intrínsecas (IOSs) en el tejido cortical. Los IOS observados en el cerebro in vivo se atribuyen principalmente a tres fenómenos: variaciones en la absorción de la luz y propiedades de dispersión debido a la hemodinámica cortical, variación en la absorción dependiendo de la reducción o oxidación de los citocromos en las mitocondrias y variaciones en las propiedades de dispersión de la luz inducidas por alteraciones morfológicas ¹ .

La luz en el rango espectral visible (VIS) al infrarrojo cercano (NIR) es efectivamente absorbida y dispersada por el tejido biológico. El espectro de reflectancia difusa del cerebro in vivo se caracteriza por espectros de absorción y dispersión. Los coeficientes de dispersión reducidos μ _s ' de tejido cerebral en el intervalo de longitud de onda VIS-a-NIR dan como resultado una exposición monótona del espectro de dispersióning magnitudes más pequeñas en longitudes de onda más largas. El coeficiente de dispersión de espectro μ reducida _s '(λ) se puede aproximar a estar en la forma de la función de la ley de potencia ^{2, 3} como μ _s' (λ) = a × λ ^-b. El poder de dispersión b está relacionada con el tamaño de dispersores biológicas en el tejido ^{2, 3} viviente. Las alteraciones morfológicas del tejido y la reducción de la viabilidad de tejido vivo cortical pueden afectar el tamaño de los dispersores biológicos ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Un sistema óptico para obtener imágenes de reflectancia difusa multiespectral se puede construir fácilmente a partir de un li incandescentefuente de lucha, componentes ópticos simples, y un dispositivo de carga acoplada monocromática (CCD). Por lo tanto, varios algoritmos y sistemas ópticos para obtención de imágenes multiespectrales de reflectancia difusa se han utilizado para evaluar la hemodinámica corticales y / o la morfología del tejido ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18.}

El método descrito en este artículo se utiliza para visualizar tanto la hemodinámica y las propiedades de dispersión de luz de tejido cerebral de rata in vivo usando un sistema de imagen de reflectancia difusa multiespectral convencional. Las ventajas de este método sobre técnicas alternativas son la capacidad de evaluar los cambios espacio-temporales en ambos hemodinámica cerebral y el tejido corticalmorfología, así como su aplicabilidad a diversos modelos animales de disfunción cerebral. Por lo tanto, el método será adecuado para las investigaciones de lesión traumática cerebral, ataque epiléptico, derrame cerebral e isquemia.

Protocol

cuidado de los animales, la preparación y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Tokio de Agricultura y Tecnología. Por esta metodología, la rata se encuentra en un ambiente controlado (24 ° C, 12 h ciclo de luz / oscuridad), con comida y agua disponible ad libitum.

1. Construcción de un sistema convencional de reflectancia de imágenes multiespectrales difusa

1. Monte nueve filtros de interferencia óptica de banda estrecha con longitudes de onda centrales de 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, y 760 nm para los orificios de filtro de la rueda de filtros motorizada.
2. Construir un sistema de imagen multiespectral utilizando una fuente de luz blanca de banda ancha, una rueda de filtros motorizada con el anterior conjunto de filtros de interferencia de banda estrecha, una guía de luz, una lente colectora, una lente de zoom de vídeo, y una cámara CCD monocromática. La disposición de los componentes ópticos, que se muestran en la Figura 2, se puede hacer referencia a para el thes el procedimiento de construcción.
   NOTA: El ángulo de iluminación es de aproximadamente 45 ° con respecto a la superficie de la muestra.
3. A su vez en la fuente de luz de la lámpara de halógeno para iluminar la superficie de la muestra a través de un filtro de interferencia, la guía de luz, y la lente colectora.
4. Abra el software de funcionamiento de la cámara CCD.

2. Preparación de los animales

NOTA: En este protocolo, la rata no se usó para los experimentos futuros y se sacrificó inmediatamente después de las mediciones de imágenes multiespectrales.

1. Conectar el puerto de entrada de una cámara de inducción al orificio de salida de una máquina de anestesia con un tubo. Conectar el puerto de salida de la cámara de inducción al puerto de entrada de la máquina de anestesia con un segundo tubo.
2. Coloque la rata en la cámara de inducción y inducir la anestesia con 5,0% de isoflurano. Mantener la anestesia a una profundidad tal que la rata no responde a pellizcos del dedo del pie. LA 2,0% de isoflurano utilizando un botón giratorio en la máquina de anestesia.
3. Fijar la cabeza de la rata en un marco estereotáxico. Conecte una boquilla para anestesia al marco estereotáxico.
4. Conecte el orificio de entrada de la boquilla al orificio de salida de la máquina de anestesia con un tubo. Conecte el orificio de salida de la boquilla al orificio de entrada de la máquina de anestesia con un tubo.
5. Afeitar la región de la cabeza más allá del sitio de la incisión prospectivo utilizando cortadoras de pelo hasta que aparezca la superficie de la piel.
6. Hacer una incisión longitudinal de aproximadamente 20 mm de largo a lo largo de la línea media de la cabeza usando un bisturí quirúrgico ( Figura 1 (a) ) y exponer los tejidos conectivos subcutáneos ( Figura 1 (b) ).
7. Retire los tejidos conectivos subcutáneos usando una cureta afilada o una pinza y tire de ella a ambos lados de la cabeza para exponer el hueso del cráneo ( Figura 1 (c) ).
8. Cavar una zanja elipsoidal en el hueso del cráneo dentro del sutur cranealES (sutura coronal, sutura sagital, y de sutura lamboidea) usando un taladro de alta velocidad (Figura 1 (d)).
9. Poco a poco y de forma homogénea excavar el hueso del cráneo dentro de la zanja usando el taladro de alta velocidad.
10. Presione ligeramente en la superficie del cráneo adelgazada con la punta de la pinza para estimar el espesor y la resistencia ósea después de que aparezca un vaso sanguíneo cerebral. Si la región cráneo adelgazada deprime fácilmente, terminar la reducción del hueso del cráneo con el taladro de alta velocidad.
11. Cortar la línea frontera elipsoidal del cráneo adelgazada poco a poco usando la punta de la pinza o pequeñas tijeras quirúrgicas.
12. Retire el cráneo adelgazado desde la superficie del cerebro lenta y suavemente utilizando la pinza.
13. bañarse suavemente la ventana craneal con solución salina fisiológica y se cubre con una placa de vidrio transparente de aproximadamente 0,1 mm de espesor.

3. Regulación de la fracción de oxígeno inspirado

NOTA: La condi respiratoriación se puede cambiar mediante la regulación de la fracción de oxígeno inspirado (FiO _2).

1. Uso de un tubo, conectar el primer puerto de un conector de tubo en forma de Y (conector 1) al primer puerto de otro conector de tubo en forma de Y (conector 2).
2. Conectar el puerto de entrada de la boquilla al segundo puerto de conector de tubo 1.
3. El uso de un tubo, conecte el tercer puerto de conector de tubo 1 a un dispositivo de monitor de concentración de oxígeno.
4. Con un tubo, conectar el segundo puerto de conector de tubo 2 al orificio de salida de una máquina de anestesia.
5. El uso de un tubo, conecte el tercer puerto de conector de tubo 2 al orificio de salida de un dispositivo de mezcla de gas.
6. Conectar un puerto de entrada del dispositivo de mezcla de gas a una alta presión 95% O ₂ - 5% de CO ₂ cilindro de gas usando un tubo.
7. Conectar el otro puerto de entrada del dispositivo de mezcla de gas a un ₂ de alta presión 95% N - cilindro de gas CO ₂ al 5% utilizando un tubo.
8. Cambiar las velocidades de flujo de gas of O ₂ y N ₂ usando los botones giratorios en el dispositivo de mezcla de gas.
9. Comprobar y regular la FiO ₂ utilizando el dispositivo de monitor de concentración de oxígeno.

4. Adquisición de la reflectancia difusa imágenes multiespectrales

1. Adquisición de imágenes de referencia
   NOTA: Los componentes ópticos utilizados en este experimento, tales como la fuente de luz, fibra óptica, y los detectores tienen sus propias características espectrales. Por lo tanto, la intensidad de la luz pasa a través de estos componentes debe ser registrada como imagen de referencia. La imagen de referencia es una imagen tomada con un difusor blanco estándar iluminado con la luz de la fuente de luz.
   1. Ponga el difusor blanco estándar en el escenario horizontalmente.
   2. Enfoque la lente de la cámara en la superficie del difusor blanco girando el anillo de zoom del barril.
   3. Ajustar el tiempo de integración de la cámara, seleccione el valor apropiado de laEn la lista desplegable de tiempos de integración en el software de funcionamiento de la cámara de manera que la mayor cantidad de luz que produce una señal que es aproximadamente el 75% de los recuentos máximos. Mientras observa el histograma de valores de pixel, ajustar el tiempo de integración hasta que el nivel de intensidad de la señal es de aproximadamente 75% de los recuentos máximos.
   4. Seleccionar la opción "Guardar" en el menú archivo para guardar una imagen en un archivo.
   5. Cambiar la ubicación del filtro mediante la rotación de la rueda de filtros.
   6. Guardar una imagen en las otras longitudes de onda de acuerdo con el proceso descrito anteriormente. El nombre del archivo debe identificar la muestra y la longitud de onda utilizada (por ejemplo, W500, W520, W540 W760 ...).
2. Adquisición de imágenes de muestra
   Nota: Las imágenes de la intensidad de la luz reflejada de forma difusa de cerebro de rata expuestos en nueve longitudes de onda son capturados y guardados en el disco duro de un ordenador personal usando las mismas condiciones de adquisición.
   1. Con cuidado, coloque el ren la etapa y lentamente ajustar el nivel de escenario para que la cámara puede enfocar en la superficie del cerebro de la rata.
   2. Seleccionar la opción "Guardar" en el menú archivo para guardar una imagen en un archivo.
   3. Cambiar la ubicación del filtro mediante la rotación de la rueda de filtros.
   4. Guardar una imagen en las otras longitudes de onda de acuerdo con el proceso descrito anteriormente. El nombre del archivo debe identificar la muestra y la longitud de onda (por ejemplo, R500, R520, R540 R760 ...).
3. Adquisición de las imágenes oscuras
   NOTA: La cámara CCD puede generar una intensidad de luz en respuesta a una señal eléctrica. Sin embargo, hay algo de producción de menor importancia debido al ruido en los circuitos eléctricos y los detectores, incluso si la luz no entra al detector; esto se llama ruido de corriente oscura. Para medir con precisión la intensidad espectral de la luz, el componente de corriente oscura debe ser registrada como una imagen oscura y luego se resta de la señal medida. La imagen oscura es una toma de imagenn con la trayectoria de luz bloqueado.
   1. Apagar la fuente de luz de la lámpara de halógeno.
   2. Bloquear el paso de luz al sistema de cámara CCD usando una placa de protección.
   3. Seleccionar la opción "Guardar" en el menú archivo para guardar una imagen en un archivo. El nombre del archivo debe identificar la muestra (por ejemplo, oscuro).

5. La visualización del contenido de hemoglobina y de la dispersión de luz Parámetro

NOTA: Un conjunto de imágenes multiespectrales de reflectancia difusa se guarda en el disco duro de un ordenador personal y analizada fuera de línea. Un análisis de regresión múltiple con la ayuda de una simulación de Monte Carlo ¹⁹ de las imágenes de reflectancia difusa multiespectrales en nueve longitudes de onda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, y 760 nm) se realiza a continuación, para visualizar el bidimensional mapas de concentración oxigenada hemoglobina, la concentración de hemoglobina desoxigenada, concentración total de hemoglobina, la saturación de oxígeno cerebral regional, y Scattering poder. El algoritmo detallado ha sido publicada en la literatura ^{17, 18.}

1. Restar la imagen oscura tanto el la imagen de la muestra a cada longitud de onda imagen de referencia y de.
2. Normalizar la imagen de muestra la imagen de referencia por en cada λ la longitud de onda. El tratamiento de la imagen normalizada como la imagen de reflectancia difusa R.
3. Calcular la absorbancia (o densidad óptica) de una imagen tomando el logaritmo de la inversa de la difusa R imagen reflectancia en cada λ la longitud de onda:
   (1)
4. Generar una matriz tridimensional por el apilamiento de las imágenes de absorbancia en el orden de sus longitudes de onda, donde el x - plano y muestra la información estructural obtenida para la superficie del cerebro y la z eje x muestra la información espectral.
5. Educación físicarforma un análisis de regresión múltiple para el espectro de absorbancia A (λ) en cada xy de coordenadas.
6. Utilice el espectro de absorbancia A (λ) como la variable dependiente y el coeficiente de extinción espectros molar de hemoglobina oxigenada ε _HbO (λ) y _HBr desoxigenada hemoglobina ε (λ) como las variables independientes para la etapa 5.5 (valores publicados para ε _HbO (λ) y ε _HBr (λ) se proporcionan en la Tabla 1).
7. Compruebe los mapas bidimensionales (imágenes) de los tres coeficientes de regresión múltiple de un _{HBO, HBr,} y un _0.
8. Generar una matriz tridimensional por el apilamiento de las imágenes de los coeficientes de regresión múltiple en el orden de un _{HBO, HBr,} y un _0, donde el y muestra la información estructural obtenida para la superficie del cerebro y el eje x z muestra los coeficientes de regresión múltiple.
9. Calcular la concentración de hemoglobina oxigenada C _HBO, la hemoglobina desoxigenada concentración C _HBr, y el poder de dispersión b del conjunto de regresión múltiple coeficientes a _{HBO, HBr,} y un ₀ en cada coordenada XY usando las siguientes fórmulas empíricas (él valores de β _{HBO, i,} β _{HBr, i,} y β _{0, i} (i = 0,1,2,3) se proporcionan en la Tabla 2):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Compruebe los mapas bidimensionales (imágenes) de la concentración de hemoglobina oxigenada C _HbO , la concentración de hemoglobina desoxigenada C _HbR y el poder de dispersión b .
11. Calcular un mapa bidimensional de la concentración total de hemoglobina C _HbT sumando C _HbO y C _HbR en cada _coordenada x - y .
12. Calcular un mapa bidimensional de la saturación regional de oxígeno cerebral rSO ₂ dividiendo la concentración de hemoglobina oxigenada C _HbO por la concentración total de hemoglobina C _HbT en cada _coordenada x - y .

Results

Imágenes espectrales representativos de reflectancia difusa adquirido de in vivo cerebros de rata se muestran en la Figura 3. Las imágenes en 500, 520, 540, 560, 570, y 580 nm visualizar claramente una densa red de vasos sanguíneos en la corteza cerebral. El deterioro del contraste entre los vasos sanguíneos y el tejido circundante se observa en las imágenes a 600, 730, y 760 nm refleja la menor absorción de la luz por la hemoglobina en longitudes de onda NIR má...

Discussion

El paso más crítico en este protocolo es la eliminación de la región del cráneo adelgazada para hacer la ventana craneal; Esto debe realizarse cuidadosamente para evitar el sangrado inesperado. Este paso es importante para obtener imágenes reflectantes difusas multiespectrales de alta calidad con alta precisión. Se recomienda el uso de un estereomicroscopio para el procedimiento quirúrgico si es posible. Pequeños trozos de esponja de gelatina son útiles para la hemostasia.

El sistema óptico ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fuente de luz de lámpara halógena de 150 W	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japón	LA-150SAE
Guía de luz	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japón	LGC1-5L1000
Lente colectora	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japón	SH-F16
Filtros de interferencia l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#65088
Filtros de interferencia l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#65093
Filtros de interferencia l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#65096
Filtros de interferencia l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#67766
Filtros de interferencia l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#67767
Filtros de interferencia l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#65646
Filtros de interferencia l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#65102
Filtros de interferencia l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#65115
Filtros de interferencia l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	#67777
Rueda de filtro motorizada	Andover Corporation, NH, EE. UU.	FW-MOT-12.5
Cámara CCD monocromática de 8 bits	THE IMAGINGSOURCE, Alemania	DMK21BU618. H
Lente zoom de video	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japón	VZMTM300i
Spectralon blanco estándar con reflectancia difusa del 99%	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, EE. UU	SRS-99-020