Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Summary

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Abstract

Existe una creciente demanda para analizar muchas muestras biológicas para la comprensión de la enfermedad y el descubrimiento de biomarcadores. estrategias proteómica cuantitativa que permiten la medición simultánea de múltiples muestras se han generalizado y reducir en gran medida los costes y los tiempos experimentales. Nuestro laboratorio ha desarrollado una técnica llamada precursor combinado marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT), que mejora la muestra de multiplexación de marcaje isotópico tradicional o enfoques de etiquetado isobáricas. cPILOT Global se puede aplicar a las muestras procedentes de células, tejidos, fluidos corporales, o organismos completos y proporciona información sobre la abundancia relativa de proteínas a través de diferentes condiciones de la muestra. cPILOT funciona por 1) usando condiciones de tampón de pH bajo para selectivamente péptido dimethylate N-terminales y 2) usando condiciones de tampón de pH alto para etiquetar aminas primarias de residuos de lisina con reactivos isobáricas comercialmente disponibles (véase la Tabla de Materiales / Reactivos). El grado demultiplexación muestra disponible depende del número de etiquetas precursores utilizados y el reactivo de marcado isobárica. A continuación, presentamos un análisis de 12-plex usando luz y dimetilación pesado combinado con seis plex reactivos isobáricas para analizar 12 muestras de tejidos de ratón en un solo análisis. multiplexación mejorada es útil para reducir el tiempo y el coste experimental y lo más importante, lo que permite la comparación a través de muchas condiciones de la muestra (réplicas biológicas, estadio de la enfermedad, los tratamientos con fármacos, genotipos, o longitudinales puntos de tiempo) con sesgo menos experimental y error. En este trabajo, el enfoque cPILOT global se utiliza para analizar el cerebro, el corazón, el hígado y los tejidos biológicos a través de repeticiones de los controles modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de Alzheimer. Global cPILOT se puede aplicar para estudiar otros procesos biológicos y adaptado para aumentar la multiplexación muestra a mayor de 20 muestras.

Introduction

Proteómica menudo implica el análisis de muchas muestras utilizadas para comprender mejor los procesos de enfermedad, la cinética enzimática, modificaciones post-traduccionales, de respuesta a los estímulos ambientales, de la respuesta a los tratamientos terapéuticos, el descubrimiento de biomarcadores, o mecanismos de drogas. Los métodos cuantitativos se pueden emplear para medir diferencias relativas en los niveles de proteína a través de las muestras y puede ser libre de etiqueta o implicar marcaje isotópico (metabólica, química o enzimática). métodos de marcaje de isótopos estables han crecido en popularidad debido a que permiten muchas muestras a ser analizadas ....

Protocol

Ética declaración: Los ratones fueron adquiridos de una institución independiente de investigación biomédica, sin ánimo de lucro y alojados en la División de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pittsburgh. Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh.

1. extracción de proteínas y la generación de péptidos de Química-etiquetado

1. Extracto de proteína a partir de tejido, células, o fluidos corporales.
   1. Homogeneizar 60-90 mg de tejido (por ejemplo cerebro, el corazón y el hígado) en solución ....

Results

cPILOT utiliza la química basado en amina a químicamente péptidos de la etiqueta en el extremo N-terminal y los residuos de lisina y mejora las capacidades de multiplexado de la muestra. La Figura 2 muestra los datos de MS representante que se obtiene a partir de un análisis cPILOT 12-plex de cerebro, el corazón y los tejidos del hígado de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer. Como se muestra en la Tabla 1, .......

Discussion

cPILOT permite la medición simultánea de más de 12 muestras únicas. A fin de garantizar el etiquetado exitosa tanto en el N-terminal y lisina residuos de péptidos, es imperativo para que el pH correcto para cada conjunto de reacciones y para llevar a cabo la reacción dimetilación primero para el etiquetado del péptido. dimetilación selectiva en el extremo N-terminal se realiza por tener un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Esto se consigue mediante la explotación de las diferencias de los valores de pKa de los grupos amino en la lisi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agua - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L cantidad no es necesaria
Acetonitrilo - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L cantidad no es necesaria
Ácido acético	J.T. Baker	9508-01
Solución de hidróxido de amonio (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Formiato de amonio	Acros Organics	208-753-9
Ácido fórmico	Fluka Analytical	94318-250ML-F
Kit de ensayo de proteínas BCA	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Ditiotreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Yodoacetamida (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-cisteína	Sigma Aldrich, química	168149-25G
L-1-tosilamido-2 feniletil clorometilcetona (TPCK) tratada con tripsina del páncreas bovino	Sigma Aldrich, ciencias	T1426-100MG
solución de formaldehído (CH2O); 36,5 - 38% en H2O	Sigma Aldrich, Ciencias	de la VidaF8775-25ML
Solución de formaldehído (13CD2O); 20 % en peso en D2O, 98 átomo % D, 99 átomo % 13C	Sigma Aldrich, Química	596388-1G
Cianoborohidruro de sodio; grado reactivo, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Cianoborodeutérido de sodio; 96 átomo % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Química	190020-1G
Puntas de centrifugado de intercambio catiónico fuerte (SCX) kit de preparación de muestras	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Tampón de bicarbonato de amonio trietilo (TEAB)	Sigma Aldrich, Ciencias de la Vida	T7408-100ML
Kit de etiquetado isobárico (TMT 6 plex) - 6 reacciones (1 x 0,8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Clorhidrato de hidroxilamina	Sigma Aldrich, Química	255580-100G
Mezclador de vórtice estándar	Fisher Scientific	2215365	se puede utilizar cualquier mezclador
Cartuchos de extracción Oasis HLB de 1 cc (10 mg)	Waters 186000383		Estos son cartuchos C18
Colector de vacío Visiprep SPE, DL (liner desechable), modelo de 24 puertos	Sigma Aldrich	57265	Un modelo de 12 puertos también es suficiente
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	cualquier marca de speed vac es suficiente Cámara de baño de
agua	Thermo Scientific	2825/2826	Cualquier marca de una cámara de baño de agua con temperaturas controladas es suficiente.
Homogeneizador mecánico (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D con muestreador automático Nano LC AS-2	Sciex-Este		modelo ya no está disponible. Cualquier nano LC con un muestreador automático es suficiente.
Espectrómetro de masas LTQ Orbitrap Velos	Thermo	Scientific-Este	modelo ya no está disponible. Se pueden utilizar otros instrumentos de alta resolución (p. ej. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion o Orbitrap Fusion Lumos).
Software de proteínas (p. ej. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Balanza analítica	Mettler Toledo	AL54
Placa de agitación	VWR	12365-382	Cualquier marca de placas de agitación es suficiente Medidor de
pH (compatible con Tris)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Cualquier marca de medidor de pH es suficiente
Tampón de pH 10	Fisher Scientific	06-664-261	Cualquier marca de tampón de pH 10 es suficiente
pH 7 tampón	Fisher Scientific	06-664-260	Cualquier marca tampón de pH 7 es suficiente
1,5 mL tubos eppendorf, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Cualquier marca de tubos eppendorf de 1,5 mL es suficiente
0,6 mL tubos eppendorf, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Cualquier marca de tubos eppendorf de 0,6 mL son suficientes
0,65 µ m Unidades de filtro centrífugo Ultrafree MC DV Tubos de microcentrífuga	EMD Millipore	UFC30DV00
2 mL, 72 unidades	Thermo Scientific	69720
C18 (5  y micro; m, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	Este artículo ha sido vendido en Bruker. El material de embalaje alternativo con las especificaciones enumeradas será suficiente
material de embalaje C18 (5  y micro; m, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	Este artículo ha sido vendido en Bruker. El material de embalaje alternativo con las especificaciones enumeradas será suficiente