Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

Resumen

Aquí, se muestra cómo analizar enrutamiento dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas. El flujo de trabajo incluye una visualización dual técnica de imagen para mejorar la calidad de imagen y herramientas computacionales para el seguimiento, el registro de los cenadores dendríticas en la matriz de la columna de referencia y para el análisis de las estructuras dendríticas en el espacio 3D.

Resumen

En muchas regiones del sistema nervioso central, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la corteza de los vertebrados, los circuitos sinápticos se organizan en capas y columnas para facilitar el cableado del cerebro durante el desarrollo y tratamiento de la información en los animales desarrollados. las neuronas postsinápticas dendritas elaboradas en los patrones específicos de tipo en capas específicas que hacen sinapsis con las terminales presinápticas apropiadas. El neurópila mosca médula se compone de 10 capas y alrededor de 750 columnas; cada columna está inervado por las dendritas de más de 38 tipos de neuronas medulares, que responden a las terminales axonales de unos 7 tipos de aferentes de una manera específica del tipo. Este informe detalla los procedimientos para analizar la imagen y dendritas de las neuronas medulares. El flujo de trabajo incluye tres secciones: (i) la sección de formación de imágenes de doble vista combina dos pilas de imágenes confocal recogidos en las orientaciones ortogonales una imagen en 3D de alta resolución de las dendritas en; (Ii) la dendrita rastreo y registro de huellas sección dendríticascenadores en 3D y los registros de huellas dendríticas en la matriz de la columna de referencia; (Iii) la sección de análisis dendríticas analiza los patrones dendríticas con respecto a las columnas y capas, incluyendo la terminación y la proyección plana dirección de capa específica de cenadores dendríticas, y calcula las estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Los protocolos utilizan plugins personalizados construidos en la MIPAV de código abierto (Procesamiento de Imágenes Médicas, análisis y visualización) cajas de herramientas personalizadas de la plataforma y en el idioma de laboratorio matriz. En conjunto, estos protocolos proporcionan un flujo de trabajo completo para analizar el enrutamiento dendríticas de Drosophila neuronas médula en capas y columnas, para identificar tipos de células, y para determinar defectos en los mutantes.

Introducción

Durante el desarrollo, las neuronas dendritas elaboradas en los patrones complejos ramificados, pero estereotipados para formar sinapsis con sus socios presináptica. patrones de ramificación dendríticas se correlacionan con la identidad y las funciones neuronales. Las ubicaciones de los cenadores dendríticas determinan el tipo de entradas presinápticos que reciben, mientras que la ramificación dendrítica de complejidad y de campo tamaños gobiernan el número de entrada. Por lo tanto, las propiedades morfológicas dendríticas son elementos indispensables para la conectividad sináptica y la computación neuronal. En muchas regiones del cerebro complejos, tales como los ló....

Protocolo

Nota: El protocolo contiene tres secciones: de doble punto de vista de imagen (secciones 1 - 3), el rastreo y registro dendríticas (secciones 4 - 6), y el análisis dendríticas (secciones 7 - 9) (Figura 1). Los códigos y archivos de ejemplo se proporcionan en la Tabla de Materiales / Equipos.

1. Adquisición de doble imagen

NOTA: Este paso está diseñado para adquirir dos pilas de imágenes de la neurona de interés en dos orientaciones ortogonal (horizontal y frontal).

1. Prepare cerebros de moscas que contienen escasamente etiquetados neuronas médula (~ 10 células / lóbul....

Resultados

Uso de la vista de doble procedimiento de imagen que se presenta aquí, un cerebro de la mosca que contiene neuronas TM20 escasamente etiquetados fue fotografiada en dos direcciones ortogonales. Antes de la formación de imágenes, el cerebro se tiñeron con anticuerpos primarios y secundarios adecuados para la visualización de GFP y fotorreceptoras axones membrana anclada. Para formación de imágenes, el cerebro se montó primero en la orientación horizontal (Figura 2A, B). U.......

Discusión

Aquí, se muestra cómo reproducir y analizar los árboles dendríticos de neuronas medulares de Drosophila. En la primera sección, de doble punto de vista de imagen, se describe la deconvolución y la combinación de dos pilas de imágenes en una pila de imágenes de alta resolución. La segunda sección, el trazado de las dendritas y el registro, se describe el rastreo y registro de las dendritas de las neuronas medulares en la matriz de la columna de referencia. En la tercera sección, el análisis dendríticas, describe.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Software
Huygens	Professional Scientific Volume Imaging	versión 16.05	para la deconvolución de imágenes (https://svi.nl).  software comercial
MIPAV		versión 7.3.0	para la recombinación y registro de imágenes (http://mipav.cit.nih.gov/);
plugin MIPAV gratuito: PlugInDrosophila Complemento MIPAV gratuito RetinalRegistration.class
: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			gratuito
Imaris	Bitplane		para el seguimiento de neuritas y la asignación de puntos de referencia para el registro de imágenes (http://www.bitplane.com); software comercial
Vaa3D			para visualizar archivos swc ( https://github.com/Vaa3D/release/releases/); software gratuito
Matlab	Mathworks	R2014b	para el análisis morfométrico de dendritas (http://www.mathworks.com); software comercial
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	para analizar parámetros morfométricos dendríticos (http://www.treestoolbox.org/download.html); software gratuito
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	Para el cálculo de parámetros morfométricos (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>Sample files
SWC definición			de archivo http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
Los códigos y los archivos de muestra para la combinación de imágenes y el registro			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Ejemplo de punto de referencia			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Sistema informático
MS Windows Windows 7 x64 o Macintosh OS X 10.7 o posterior			Procesador de cuatro núcleos de 3 GHz y 64 bits, 16 G de RAM (mínimo)
Opcional: Quadro4000  (o superior) tarjeta gráfica	Nvidia		para la visualización estereográfica de dendritas.
Opcional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Opcional: Pantalla LCD de 120 Hz para NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Número de catálogo	>Comentarios
>Reactivos para la imagen
	Hibridoma	24B10
GFP Tag Anticuerpo	Thermofisher Scientific	G10362
Cabra anti-Conejo (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Cabra anti-Ratón (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Montaje Medio Vectorial	Laboratorios	H-1000
Montaje  Arcilla	Fisher	S04179
70% de glicerol en 1x PBS
Coverglass, alto rendimiento, D = 0,17  mm	Zeiss	474030-9000-000