El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Summary

Este artículo presenta un protocolo optimizado para la producción de chips de microfluidos y la configuración de los experimentos de microfluidos para medir la vida útil y los fenotipos celulares de células de levadura individuales.

Abstract

La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae es un organismo modelo importante en la investigación del envejecimiento. Los estudios genéticos han revelado muchos genes con efectos conservados en la esperanza de vida de todas las especies. Sin embargo, las causas moleculares del envejecimiento y la muerte siguen siendo difíciles de alcanzar. Para obtener una comprensión sistemática de los mecanismos moleculares que subyacen al envejecimiento de la levadura, necesitamos métodos de alto rendimiento para medir la vida útil y cuantificar varios fenotipos celulares y moleculares en células individuales. Anteriormente, desarrollamos dispositivos microfluídicos para rastrear las células madre de levadura en ciernes a lo largo de su vida útil mientras eliminamos las células hijas recién nacidas. Este artículo presenta un método para la preparación de chips microfluídicos y para la configuración de experimentos microfluídicos. Se pueden utilizar múltiples canales para rastrear simultáneamente las células en diferentes condiciones o de diferentes cepas de levadura. Una configuración típica puede rastrear cientos de células por canal y permitir imágenes de microscopio de alta resolución durante toda la vida útil de las células. Nuestro método también permite la caracterización detallada de la vida útil, los marcadores moleculares, la morfología celular y la dinámica del ciclo celular de células individuales. Además, nuestro dispositivo microfluídico es capaz de atrapar una cantidad significativa de células madre frescas que se pueden identificar mediante el análisis de imágenes posteriores, lo que permite medir la vida útil con mayor precisión.

Introduction

La levadura en ciernes es un poderoso organismo modelo en la investigación del envejecimiento. Sin embargo, un ensayo de vida útil convencional en levaduras se basa en la microdisección, que no sólo es un trabajo intensivo sino también bajo rendimiento ^{1, 2.} Además, el enfoque de microdisección tradicional no proporciona una vista detallada de diversas características celulares y moleculares en las células madre individuales a medida que envejecen. El desarrollo de dispositivos microfluídicos ha permitido un procedimiento automatizado para medir la vida útil de la levadura, así como de seguir los marcadores m....

Protocol

1. Molde de fabricación de obleas de silicio

NOTA: La fotomáscara se ha diseñado con el software AutoCAD y fabricado por una empresa comercial. Este diseño contiene tres capas de diferentes patrones ( Archivo 1 ). Las alturas de la primera, segunda, y tercera capas son aproximadamente 4! M, 10 m, y 50! M, respectivamente. El molde oblea de silicio se ha creado a partir de la fotomáscara mediante litografía blanda ^{9, 10.}

1. Hornear una oblea de silicio a 200 ° C durante 10 min para evaporar el vap....

Results

Después de los experimentos, la vida útil de las células y muchos fenotipos celulares y moleculares se pueden extraer de las imágenes de lapso de tiempo grabados. Puesto que hay un número de diferentes características que se pueden extraer de cada celda, el primer paso del análisis es para anotar las células y eventos, incluyendo las posiciones y los límites de las células y la sincronización de los diversos eventos que se está realizando el seguimiento, tales como los acontecimientos en.......

Discussion

El dispositivo de PDMS necesita ser recién hecho. De lo contrario, las burbujas de aire causadas por la inserción de tubos en el dispositivo serán difíciles de eliminar. Paso 3.4 es importante para mejorar la eficiencia de carga de células mediante la concentración de las células. Para aumentar el rendimiento del experimento, de 4 a 6 módulos en el mismo chip PDMS conectados a independiente bombas que operan normalmente se utilizan para realizar de 4 a 6 experimentos diferentes (diferentes cepas o composiciones de medio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' < 111> oblea de silicona	Addison Engineering
SU-8 Serie 2000 y 3000	MicroChem
Sylgard® 184 Kit de elastómero de silicona	ellsworth	2065622	Incluye base de elastómero de silicona Sylgard y agente de curado
Placas de Petri	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punzón (diámetro interno 0,75 mm)	Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cubreobjetos	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Hojas de afeitar	VWR	55411-050
etanol puro, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
Jeringa BD de 5 mL (Luer-Lock™ Consejo)	Becton, Dickinson and Company	309646
Tubería de pared estándar de PTFE (100 pies, tamaño AWG: 22, ID nominal: 0.028)	Compañía de suministro	de componentes SWTT-22
Surtido de agujas	Compañía de suministro de componentes	NEKIT-1
Desecador	HACH	2238300
Horno de laboratorio	Fisher Scientific	13246516GAQ
Microscopio Nikon TE2000 con objetivo de 40X y 60X	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 con objetivo de 40X y 60X	Zeiss
	Longerpump	TS-1B