Artículo de método

El uso de biosensores basados ​​en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer

DOI:

10.3791/55418

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3 de mayo de 2017

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1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

En este artículo

Resumen

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A continuación, describimos la configuración, software de navegación, y el análisis de datos de un método espacial y temporalmente precisa de medir tónico y cambios extracelulares de glutamato fásicas in vivo usando matrices de microelectrodos ligados a enzimas (MEA).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

alteración de neurotransmisores es a menudo un componente clave de las enfermedades del sistema nervioso central (SNC), que juega un papel en la patología subyacente de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la depresión y la ansiedad. Tradicionalmente, microdiálisis ha sido la técnica más común (alabado) para examinar los cambios de neurotransmisores que se producen en estos trastornos. Pero debido a microdiálisis tiene la capacidad de medir cambios lentos 1-20 minutos a través de grandes áreas de tejido, tiene la desventaja de invasividad, potencialmente destruyendo conexiones intrínsecas dentro del cerebro y una capacidad de muestreo lento. Una técnica relativamente nueva, la matriz de microelectrodos (MEA), tiene numerosas ventajas para la medición de cambios de neurotransmisores específicos dentro de las regiones discretas del cerebro que se producen, lo que para un enfoque espacial y temporalmente precisa. Además, utilizando los AMA es mínimamente invasiva, permitiendo para la medición de las alteraciones de neurotransmisores en vivo. En nuestro laboratorio, HÅHe sido específicamente interesados ​​en los cambios en el neurotransmisor, glutamato, relacionado con la patología de la enfermedad de Alzheimer. Como tal, el método descrito aquí se ha utilizado para evaluar posibles perturbaciones del hipocampo en glutamato en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer. Brevemente, el método utilizado consiste en el recubrimiento de un microelectrodo multi-sitio con una enzima muy selectivo para el neurotransmisor de interés y el uso de sitios de autorreferencia para restar el ruido y los interferentes de fondo. Después de sembrar y de calibración, el MEA puede ser construido con una micropipeta y se baja en la región del cerebro de interés utilizando un dispositivo estereotáxico. Aquí, el método descrito implica anestesiar RTG (TauP301L) 4510 ratones y el uso de un dispositivo estereotáxico para orientar con precisión sub-regiones (DG, CA1 y CA3) del hipocampo.

Introducción

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La medición de las alteraciones de neurotransmisores en el cerebro es una herramienta esencial para los neurocientíficos que estudian las enfermedades del sistema nervioso central (SNC) que a menudo se caracteriza por la desregulación del neurotransmisor. Aunque microdiálisis en combinación con cromatografía líquida de alta presión (HPLC / CE) ha sido el método más ampliamente utilizado para medir cambios en los niveles de neurotransmisores extracelulares 1, 2, 3, 4, la resolución espacial y temporal de las sondas de microdiálisis puede no ser ideal para los neurotransmisores , tales como glutamato, que están estrechamente regulada en el espacio extracelular 5, 6. Debido a los recientes avances en la genética y la formación de imágenes, hay métodos adicionales que se pueden utilizar para mapear glutamato in vivo. Uso de reporteros fluorescentes glutamato codificados genéticamente (iGluSnFR) unad de dos fotones de formación de imágenes, los investigadores son capaces de visualizar la liberación de glutamato por las neuronas y astrocitos tanto in vitro como in vivo 7, 8, 9. En particular, esto permite la grabación de un campo de visión más amplio y no interrumpe las conexiones intrínsecas del cerebro. Aunque estas nuevas técnicas ópticas permiten la visualización de la cinética de glutamato y la medición de respuestas evocadas sensoriales y la actividad neuronal, que carecen de la capacidad de cuantificar la cantidad de glutamato en el espacio extracelular en regiones discretas del cerebro.

Un método alternativo es la matriz de microelectrodos ligado a enzimas (MEA) que puede medir selectivamente niveles de neurotransmisores extracelulares, tales como el glutamato, a través del uso de un esquema de registro por sí mismo se hace referencia. La técnica MEA se ha utilizado para estudiar las alteraciones en el glutamato extracelular siguientes cerebral traumáticalesión 10, 11, 12, el envejecimiento 13, 14, la tensión 15, 16, epilepsia 17, 18, enfermedad de Alzheimer 19, 20, y la inyección de un viral imitador 21 y representa una mejora sobre las limitaciones espaciales y temporales inherentes a microdiálisis. Mientras que microdiálisis restringe la capacidad de medir cerca de la sinapsis 22, 23, AAM tienen una alta resolución espacial que permite medidas selectivas de desbordamiento de glutamato extracelular cerca de sinapsis 24, 25. En segundo lugar, la resolución temporal baja de microdiálisis (1 - 20 min) limita la capacidad para investigar ladinámica rápida de la liberación de glutamato y el aclaramiento que se producen en la milésima de segundo a segundo rango 26. Debido a las diferencias en la liberación o el aclaramiento de glutamato pueden no ser evidentes en las medidas de tónico, descansando los niveles de glutamato, puede ser esencial que la liberación de glutamato y el aclaramiento medirse directamente. MEAs permiten para tales medidas debido a su alta resolución temporal (2 Hz) y bajos límites de detección (<1 m). En tercer lugar, los AMA permiten examen de las modificaciones subregionales de neurotransmisores dentro de una región particular del cerebro, tales como el hipocampo de rata o de ratón. Por ejemplo, usando MEAs podemos dirigir por separado el giro dentado (DG), Cornu ammonis 3 (CA3) y Cornu ammonis 1 (CA1) del hipocampo, que están conectados a través de un circuito de trisynaptic 27, para examinar las diferencias subregionales en glutamato extracelular. Debido al tamaño de las sondas de microdiálisis (1 - 4 mm de longitud) y los daños causados por la implantación 28 </ sup>, 29, las diferencias subregionales son difíciles de tratar. Además, los sistemas ópticos sólo permiten la estimulación a través de estímulos externos, tales como una estimulación de la barba o parpadeo de la luz, que no permite la estimulación subregional 7. Un beneficio final de los AMA sobre otros métodos es la capacidad para estudiar estas subregiones in vivo sin interrumpir sus conexiones extrínsecos e intrínsecos.

A continuación, describimos cómo un sistema de grabación (por ejemplo, FAST16mkIII) en combinación con AAM, que consta de un microelectrodo de múltiples sitios a base de cerámica, se puede recubrir de forma diferencial en los sitios de registro para permitir a los agentes de interferencia para ser detectado y eliminado de la señal de analito. También demostramos estas matrices se pueden utilizar para los estudios basados en Amperometry de regulación de glutamato in vivo dentro de la DG, CA3, CA1 del hipocampo y subregiones de anestesiado RTG (TauP301L) 4510 ratones, un m comúnmente utilizadoouse modelo de la enfermedad de Alzheimer. Además, proporcionamos confirmación de la sensibilidad del sistema de MEA a la dinámica rápida de la liberación de glutamato y el aclaramiento mediante el tratamiento de los ratones con riluzol, un fármaco se muestra in vitro para disminuir la liberación de glutamato y aumentar la captación de glutamato 30, 31, 32, 33, y la demostración de estos respectivos cambios en vivo en el modelo de ratón TauP301L.

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Protocolo

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1. Recubrimiento de la matriz de microelectrodos con enzimas o capa de matriz

  1. Preparación de la solución de matriz de proteínas
    1. Pesar 10 mg de albúmina de suero bovino (BSA) y transferir al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Añadir 985! L de agua DI al tubo de microcentrífuga que contiene BSA. Mezclar la solución por agitación manual (re-pipeteado utilizando 1.000 l pipeta ~ 3 veces, hasta que la BSA se disuelve).
      NOTA: No utilice vórtice para mezclar la solución ya que podría introducir aire en la solución. Además, establecer la pipeta a un volumen <1,000 l (por ejemplo, 700 l) para evitar la introducción de burbujas de aire. La solución se puede colocar en una microcentrífuga si es necesario.
    3. Una vez que se disolvió la solución de BSA, añadir 5 l de solución de glutaraldehído al 25%. Mezclar la solución invirtiendo el tubo cerrado 3 - 5 veces. La solución resultante es del 1% BSA con 0,125% de glutaraldehído.
    4. Se anule la solu matriz proteicación durante 5 min. La solución aparecerá de color amarillo claro.
  2. Preparación de la solución de la enzima deseada (por ejemplo, glutamato oxidasa)
    1. Prepare la solución de glutamato oxidasa mediante la adición de agua DI filtrada para el liofilizado, la enzima purificada (por ejemplo, 50 l de agua DI añadió a 25 unidades de glutamato oxidasa para producir 0,5 U / l).
      NOTA: Alícuota de la solución madre (por ejemplo, 1 l) y almacenar las partes alícuotas en recipientes de tamaño adecuado (por ejemplo, 500 tubos de microcentrífuga l) a -20 ° C. Las alícuotas se pueden almacenar durante un máximo de 6 meses en estas condiciones.
    2. Añadir 4 l de la solución de BSA / glutaraldehído al tubo alícuotas de microcentrífuga que contiene glutamato oxidasa. Mezclar la solución por agitación manual (re-pipeteado con una pipeta de 10 mL. La pipeta se debe establecer en volumen <5 l). La solución resultante es 1% de BSA, 0,125% de glutaraldehído y 0,1 U / l de glutamato oxidasa.Use la solución para recubrir inmediatamente.
      Nota: solución de revestimiento oxidasa glutamato sólo puede ser utilizado dentro de 15 min. Aunque varios MEAs se pueden recubrir con una solución preparada, se recomienda que no exceda de la ventana de tiempo utilizable para glutamato oxidasa. El número de electrodos que se pueden revestir dentro de los 15 min varían. En general, de 4 a 6 electrodos se pueden recubrir a la vez.
  3. El recubrimiento de la MEA
    1. Típicamente, capa un par de sitio de registro (s) en un MEA con la enzima deseada (glutamato oxidasa) y un par diferente de sitio (s) de grabación (sitio 'centinela' (s)) está recubierta con la proteína de la matriz inactiva.
    2. Utilice puntas romas Hamilton microjeringas (por ejemplo, 10 l) para MEAs capa con L-glutamato oxidasa o una solución de matriz de proteína inactiva (BSA + glutaraldehído). Los procedimientos usados ​​para revestimientos de proteína de matriz de la enzima o inactivos son los mismos.
    3. Limpiar las jeringas antes y después de su uso (3 enjuagues conagua DI, 3 enjuagues con metanol, 5 enjuagues con agua DI).
      NOTA: Dedicado jeringas se utilizan para la aplicación de capas de enzima (glutamato oxidasa) o proteína de matriz. No utilice la misma jeringa para una solución diferente. Se recomienda realizar recubrimientos de proteínas de matriz antes de recubrimientos de enzimas.
    4. Elaborar glutamato oxidasa o matriz de proteína utilizando una jeringa de 10 l Hamilton. Presione suavemente el émbolo para dispensar una pequeña gota de solución en la punta de jeringa (visualizado usando un microscopio de disección).
    5. Usando el microscopio de disección para apuntar a los sitios de grabación MEA, aplicar la solución a los sitios de grabación apropiadas poniendo en contacto brevemente los sitios de grabación con la solución de gotita / perlas, que representa una capa. Tres capas son suficientes tanto para la proteína de matriz y la capa de enzima. Las capas gruesas pueden reducir la sensibilidad del MEA.
    6. Elevar la gotita de solución hacia arriba y fuera de los sitios de grabaciones (es decir, el Syrinpunta ge no debe raspar través de la superficie MEA).
    7. Establecer un temporizador durante 1 min. Este es el requisito de tiempo mínimo entre aplicaciones de recubrimiento en el sitio (s) de grabación. Permitir MEAs enzima recubierto para curar a 4 ° C durante 5-7 días.
    8. Registrar el número de capas aplicadas, el tiempo que tomó para aplicar los revestimientos, el número de electrodos, y un nombre y fecha en un cuaderno de laboratorio.

2. Electroplating con m-fenilendiamina para selectividad mejorada

  1. Preparación de dihidrocloruro de m-fenilendiamina solución (MPD)
    NOTA: Placa de la capa de exclusión, MPD, para evitar la oxidación de la dopamina y otras moléculas grandes, interferentes (por ejemplo, ácido ascórbico), mejorando así la selectividad del sensor para el glutamato / H 2 O 2 sobre otras moléculas potencialmente interferente.
    1. Medir 50 ml de 0,05 M tampón fosfato salino (PBS) en un matraz volumétrico y transferir 50 ml de 0,05M PBS a una más grande (150 ml) matraz Erlenmeyer.
    2. Usando el tubo conectado a un tanque de nitrógeno (por ejemplo, usando el tubo conectado un eyector de presión), adjuntar una punta de pipeta (por ejemplo punta P200) para el extremo abierto de la tubería. Colocar el tubo con la punta de pipeta unida en solución de PBS y para abarcar la solución débilmente con parafilm. A su vez en solución de burbujas de nitrógeno y suavemente durante 20 min.
    3. Pesar 0,045 g de mPD.
      Precaución: mPD es una sustancia potencialmente cancerígena. Con un peso de mPD se debe realizar usando una escala contenida dentro de una campana de humos. Use guantes y mascarilla cuando se utiliza mPD. Asegúrese de que la campana es funcional y que la hoja se retiró al nivel de trabajo apropiado. superficies Inmediatamente limpias que pueden haber sido contaminados con mPD para evitar manchas permanentes.
    4. Después de burbujear, transferir todo el mPD a la solución de-gaseados PBS. Cubrir la apertura matraz con parafilm y solución suavemente remolino para disolver mPD en solución. Evitar aggressive de mezcla o el uso de un vórtice ya que podría introducir gases en la solución.
    5. Transferir la solución a un vaso de precipitados de 50 mL. Una barra de agitación no es necesario.
  2. Galvanoplastia el electrodo
    1. Obtener un electrodo de referencia. Utilizar electrodos de referencia dedicadas a mPD única en placas. Utilizar un electrodo de referencia diferente para procedimientos de calibración.
    2. Coloque el brazo de plástico del soporte del electrodo de referencia sobre el vaso de precipitados. Compruebe burbujas de aire en el electrodo de referencia de vidrio (puede no ser capaz de ver). flick suavemente el extremo distal del electrodo de referencia para eliminar cualquier burbuja de aire en la punta.
    3. Coloque el electrodo de referencia a través de la abertura en el brazo de plástico e inferior en el vaso de precipitados que contiene PBS. Asegúrese de que el electrodo de referencia no hace contacto con la parte inferior del vaso de precipitados.
    4. Conectar el electrodo de referencia para el cabezal de la platina (por ejemplo, 2 pA / mV) y conectar (por ejemplo, conector DIP) el MEA sea placa mPDd para el cabezal de la platina.
    5. Bajar la MEA en la solución vaso de precipitados de tal modo que sólo la punta MEA se sumerge en solución. No sumerja las puntas de MEA en un líquido más allá de la 'burbuja' negro (el aislamiento negro situado por encima de la punta MEA). Si lo hace, puede dañar el MEA.
    6. Ejecutar una calibración de 'prueba' para comprobar la funcionalidad de los canales de los electrodos y la conexión con el cabezal de la platina.
      NOTA: Aunque la configuración de hardware deben reflejar el equipo que se utiliza, los detalles relacionados con el tipo de analito / interferente y la concentración no tiene que ser introducido para la calibración de 'prueba'. El modo de grabación debe ser 'Amperometry' y el 'V-aplicado' debería ser -0,7 V. Verificar grabación típico para todos los canales.
    7. Cancele seleccionando 'Cancelar' cuando se verifica la conectividad de todos los sitios de registro. No es necesario guardar los datos de calibración.
    8. Seleccionar el icono "galvanoplastia" en el escritorio. La galvanoplastia Paraaparecerá ol Menú. Verificar se introducen los ajustes correctos:
      amplitud PP: 0,25
      Offset: -0.5
      Frecuencia: 0,05
      Duración (min): 20
    9. Seleccione el botón de 'pausa' para comenzar chapado. El campo de tiempo transcurrido debe comenzar la cuenta atrás.
    10. Al finalizar (todo el tiempo transcurrido), seleccione 'otro MEA' en el menú surgido para comenzar mPD chapado un MEA adicional. Sustituir el MEA chapada con una MEA que se mPD plateado y repita el procedimiento de electrodeposición mediante la herramienta de galvanoplastia.
      NOTA: Se recomienda el uso de la solución preparada mPD no más de 2 veces o dentro de un período de tiempo de 1 h. Preparar una solución fresca para preparar más de 2 AMA.
    11. Seleccione 'software de salida' para terminar la galvanoplastia. Enjuague puntas de los electrodos metalizados mPD con agua DI (para evitar un residuo de sal) y almacenar (24 h) antes de la calibración.
    12. Retire el electrodo de referencia de la solución y enjuague con agua DI antes de colocar en los s apropiadassolución LMACENAMIENTO (por ejemplo, 3 M NaCl). Asegúrese de que la punta del electrodo de referencia está sumergido en solución. electrodo de referencia de vidrio Lentamente inferior en la solución para evitar daños en el vidrio.
    13. Desechar de la solución de mPD en un contenedor de desechos peligrosos debidamente etiquetado.

3. Calibre el MEA para la detección de glutamato y la selectividad (Figura 1) 21

  1. Preparación de las soluciones necesarias para la calibración.
    NOTA: Consulte la Tabla 1.
  2. Realice la calibración bajo agitación constante (batería magnético operado agitador) a 37 ° C. A su vez en la almohadilla de calentamiento o baño de agua circulante y obtener una pequeña barra de agitación. Revuelva lentamente, pero lo suficientemente rápido que cuando se hace una adición (a continuación), el nuevo nivel se alcanza rápidamente.
  3. Conectar el cabezal de la platina (2 pA / mV) al sistema de control de grabación e inserte la punta MEA en 40 ml de agitada 0,05 M PBS (utilizar un vaso de precipitados de 50 ml).
  4. Conectar el referencia electrodo. Flick el final para asegurar que no hay burbujas de aire.
  5. Abra el programa de grabación y haga clic en "Calibración". Asegúrese de que los ajustes son correctos (comprobar que los sitios centinela se seleccionan ya que esto puede cambiar en función de electrodos), elegir el número de MEA y pulse "Inicio".
  6. Permitir de 5 - 10 min para el equilibrio; comenzará una vez que la línea de base se ha estabilizado (<0,004 nA / cambio min).
  7. Seleccionar "línea base" y añadir 500 l de 20 ácido ascórbico mM (interferente; definitiva [250 mu M]) y seleccione "interferente" (AA se considera como interferente en todo el cerebro) una vez que la corriente ha alcanzado un nuevo, meseta estable, si alguna. Permitir 0,5-1 min entre adiciones. Si el MEA se galvaniza correctamente, debe observarse casi ningún cambio.
  8. Añadir 40 l de 20 mM de L-glutamato (Final [20? M]) y una vez que la corriente ha alcanzado un nuevo, meseta estable, marca de 1 Además st "analito". Repetir tres veces para un total de 3 glutamate adiciones.
  9. Añadir 40 l DA. No seleccione "analito"; seleccionar "Sustancia de ensayo" - DA puede ser sólo un interferente en áreas que contienen DA.
  10. Añadir 40 mu L de peróxido. No seleccione "analito"; seleccione "Sustancia de ensayo".
  11. Haga clic en el botón "Stop" una vez finalizada la calibración.
  12. Para determinar la funcionalidad de la MEA, haga clic en la ficha Cálculo y registrar los siguientes parámetros en un cuaderno de laboratorio.
    1. Para el diseño MEA (3000 m 2) utilizados en estas calibraciones, utilice un MEA con una pendiente de ≥ 0,004 nA / M pero pendientes inferiores se pueden utilizar para ciertos experimentos. Si hay menos de un 10% de diferencia en la pendiente entre los sitios de enzimas recubierto y sin recubrir, a continuación, utilizar estos MEAs para la liberación evocada solamente o limpio / desechar el MEA.
    2. Utilice un límite de detección (LOD) ≤ 1,5? M. Si el límite de detección es mayor que 1,5 M, a continuación, utilizar estos AAM para releas evocadosE y la demanda tienen. No utilice estos electrodos para registrar los niveles tónicos.
    3. Utilice una selectividad para el analito deseado (es decir, glutamato) sobre el interferente de> 20 unidades arbitrarias. Si la selectividad es menos de 20, a continuación, limpia / desechar el MEA.
    4. Utilice una linealidad (R 2) de la curva de calibración de ≥ 0,90. Si la linealidad es inferior a 0,90, entonces limpia o descartar MEA.
  13. Guarde el archivo con el # de la MEA, la fecha y las iniciales de la persona de calibración.

4. Monte el Micropipeta

NOTA: Micropipetas (vidrio capilar) debe tener una punta con un diámetro interno de 10 - 15 m.

  1. Coloque la micropipeta centralmente entre todos los sitios de registro cuatro de platino y montar 50-100 micras por encima de la MEA con cera pegajosa y arcilla de modelado.
  2. Para cargar la micropipeta, usar una jeringa de 1 ml lleno de glutamato o solución de KCl, un 0,22-micras jeringa estéril filtranter, y un 97 mm de largo, 28 de calibre pipeta de llenado, rellenar el micropipeta. Es decir, insertar la aguja en la parte superior de la micropipeta y rellenar en la parte inferior de la micropipeta (el extremo hacia el MEA), asegurándose de que no hay burbujas.
  3. Coloque la micropipeta al sistema de expulsión de la presión a 2 - 20 psi durante aproximadamente 1 s.

5. Placa de la miniatura electrodo de referencia para el uso in vivo

  1. Preparar la solución de recubrimiento (50 g NaCl / 90 ml 1 M HCl en un baño de 100 ml vaso de precipitados (chapado)) y cortar el electrodo de baño (~ 10 cm de longitud de platino (Pt) de alambre (~ 0,02" de diámetro)).
  2. Cortar un 10 - 15 cm de largo pieza de Teflon alambre de plata recubierto (0,008" desnudo) y el uso de una hoja de afeitar para raspar ~ 1 cm de revestimiento de teflón de cada extremo del extremo del alambre de plata.
  3. Soldar un alfiler de oro en un extremo y colocar un extremo del alambre de plata expuesta en el baño de chapado.
  4. El uso de un adaptador de CC (use sólo un adaptador de CC que tiene una potencia de 9 ~ -. 15 VDC max),sujetar el (+) de alambre "rojo" a la (electrodo de referencia) alambre de plata preparada en el lado alfiler de oro. Sujetar el "negro" (-) de alambre para Pt cátodo baño.
  5. Conecte el adaptador DC. Busque el proceso de recubrimiento correcta - burbujas deben aparecer en el electrodo de baño; electrodo de referencia se torna de color plata / gris.
    PRECAUCIÓN: No cambie los cables [Negro (-) vs Rojo (+)] - baño galvánico se arruinará si esto ocurre y se tienen que hacer en una solución fresca de chapado. Una mala solución se volverá de color amarillo: NO USAR!
    NOTA: El chapado reacción toma 2-5 min general: Ag 0 + Cl - → AgCl + e -
  6. Pruebe el electrodo de referencia.
    1. Establecer un multímetro para el 100 - 200 mV DC entorno.
    2. Coloque un punto de referencia (es decir, un electrodo previamente probado conocido de trabajar) electrodo de referencia en 3 M de NaCl y se prueba contra el electrodo de referencia recién plateado.
      NOTA: Si nosing un nuevo electrodo de referencia, sumergirlo en 3 M NaCl antes de su uso (12 h recomendado).
    3. Coloque el cable "rojo" (+) en el alfiler de oro del electrodo de referencia a ensayar. Coloque el "negro" - el plomo en el electrodo de referencia (). Un intervalo de lectura aceptable es de ± 10 mV. 0 mV es ideal a través de los electrodos de referencia 2.

6. Cirugía Animal General de MEA Grabaciones

  1. Preparación para la cirugía
    1. Colocar herramientas de cirugía en un desinfectante de la noche anterior.
    2. Retire las herramientas del desinfectante y enjuague bien y colocar las herramientas en una plataforma de la cirugía estéril. Obtener una almohadilla térmica.
    3. Calibrar dos electrodos y adjuntar la micropipeta como se describe en los procedimientos 3 y 4.
    4. Hacer que el electrodo de referencia tal como se describe en la Sección 5.
    5. Hacer 200 glutamato mu M y KCl 70 mM. Consulte la Tabla 1.
    6. Obtener el animal y registrar su peso en las hojas de la cirugía.
    7. Preparar la anestesia y gire sobre el cojín eléctrico.
  2. Realizar la cirugía MEA
    1. El uso de isoflurano (flujo 4% en oxígeno), anestesiar al animal en una cámara de inducción hasta que la tasa respiratoria ha disminuido significativamente y el animal no responder a dedo del pie o pellizco cola. frecuencia respiratoria Record y la temperatura corporal cada 15 min.
    2. Colocar el animal en el dispositivo estereotáxico utilizando las barras de oído para estabilizar la cabeza. Asegúrese de que el animal es seguro y la cabeza no se mueve. Bajar el flujo de isoflurano al 1,5 - 3% en oxígeno. Asegúrese de que la almohadilla de calefacción está colocado correctamente en el animal y se puso a 37 ° C para proporcionar calor suplementario. Si no se proporciona calor adicional puede resultar en hipotermia profunda y la muerte prematura del animal.
    3. Aplicar ungüento para los ojos utilizando un aplicador de algodón estéril y registrar la frecuencia respiratoria ytemperatura corporal. El uso de un condensador de ajuste con pilas, afeitarse la parte superior de la cabeza. Utilizar las pequeñas tijeras quirúrgicas para eliminar la piel cerca de los oídos.
    4. En este punto, se puso los guantes de cirugía estériles. Aplicar yodo y luego alcohol (tres veces) para el cuero cabelludo.
    5. El uso de un bisturí, hacer una incisión recta por el medio del cuero cabelludo y la propagación de la piel con pinzas perro del toro. Tome una punta de algodón estéril para absorber cualquier sangre. Utilice el peróxido de hidrógeno para facilitar la aparición de bregma y lambda.
    6. Compruebe que la cabeza está correctamente posicionado mediante la medición de la D / V y las coordenadas M / L de bregma y lambda. Coordinar los cambios debe ser cero si la cabeza está en una superficie plana. Ajuste las barras de la cabeza y del oído como sea necesario para asegurar una superficie plana.
    7. Encuentra bregma, y ​​poner a cero las coordenadas. Utilizando las coordenadas deseadas, mover a la izquierda y la derecha y hacer una marca con un marcador permanente. El uso de un cauterizador / marcador, hacer una gran plaza alrededor de la marca, con espacio suficiente para llegar a laregión deseada.
    8. El uso de una herramienta rotativa estéril, perforar alrededor de la marca cuadrado. Empapar cualquier sangre usando un aplicador de algodón estéril. A fondo desinfectar la broca antes de cada uso.
    9. Una el MEA con el cabezal de la platina y rellenar la pipeta con la primera solución deseada. Asegúrese de dejar un hueco en la pipeta y sin solución para que la solución de haber sido expulsado puede ser examinado. Una el tubo a la micropipeta de vidrio.
    10. A su vez en el tanque de nitrógeno y el eyector de presión (psi = 5, el tiempo = 0,6 s). Prueba (pulse el botón rojo manual) para asegurar la pipeta no esté obstruido antes de comenzar.
    11. Calibre la micropipeta. Comience a 0 en el punto de mira y coloque un trozo de cinta azul en el cabezal de la platina para indicar el punto de inicio. A su vez en el lector digital y restablecer a cero. Ir abajo 1 mm (DV) y contar el número de garrapatas de la solución se ha movido en el retículo. 10 garrapatas debe ser igual a 1 mm (1 mm = 250 nL), de modo 1 garrapata = 25 nL.
    12. Colocar el electrodo de referencia en unaubicación remota desde el MEA tal que todavía está en contacto líquido con el cerebro para completar el circuito.
    13. Encuentra bregma con el MEA adjunto y cero el lector digital. Mover el MEA a las coordenadas deseadas. baje lentamente el MEA hasta que la punta toca el cerebro. Poner a cero el DV coordinar y baje lentamente el MEA en el cerebro.
    14. En el programa de grabación, haga clic en el electrodo calibrado deseada y haga clic en "Realizar Experimento". Entonces, el sistema comenzará a grabar los niveles tónicos para el analito de interés, mientras que el animal es anestesiado.
    15. Reducir a un eje que ayudará en la observación de la línea de base y permitir que el electrodo a base de referencia para 20 - 45 min.
    16. Después de la línea de base es estable, establecer el eyector presión para .6 s y 5 psi y presione el botón rojo en el eyector de presión para expulsar. Registre el tiempo y la presión, así como de volumen / garrapatas movido en la hoja de la inyección (Figura 2). Tomar notas que son necesarios (es decir,picos más grandes, los efectos de dilución, pipeta obstruidos, ruidoso línea de base / o de alcance).
    17. Para las inyecciones de glutamato, espere de 3 - 5 min entre inyecciones. Para KCl inyecciones esperan 1 - 2 min entre inyecciones. Inyectar usando la misma presión y tiempo de al menos 3 veces. Cambiar el tiempo y repetir. Trate de no cambiar la presión a menos que se obstruye la micropipeta.
    18. Si se obstruye la micropipeta, aumentar la presión hasta 30 psi.
    19. Registro de las regiones del cerebro deseados, repitiendo en ambos lados del cerebro usando diferentes soluciones. Grabación de una línea de base en cada nueva región durante 20 min.
    20. Tomar la MEA con micropipeta adjunto, enjuague con agua DI y de inmersión en PBS durante la noche hasta que toda la sangre se ha ido.
    21. La eutanasia del animal y guardar el cerebro en un tubo de pre-marcado y almacenar en el congelador C -80 ° o mantener un lado para la fijación. Para la eutanasia al animal, sobredosis con isoflurano (inhalación). Realizar la decapitación usando tijeras quirúrgicas y diseccionar las regiones deseadas.

7. AAM limpieza recubiertos después de su uso

  1. Hacer AAM no limpias si no se utiliza. Si hay pelusa o polvo en la superficie, limpio con metanol y dejar secar durante 24 h antes del recubrimiento.
  2. A su vez en el baño de agua (80 ° C) y tomar la punta de la MEA durante 30 min. Con cuidado, limpie la punta del electrodo con una punta de algodón aplicador para eliminar los residuos que puedan quedar en la punta del electrodo. No permita que la "sección de aislamiento" negro del MEA mojado.
  3. Usando tres sonicadores diferentes, remoje la punta de la MEA en (1) Citrisolv, un disolvente y de compensación agente comercial (2) de isopropilo, y (3) de agua DI durante 5 min. Con cuidado, limpie la punta del electrodo con punta de algodón aplicador para eliminar los residuos que puedan quedar en la punta del electrodo.
  4. Examine las puntas bajo un microscopio de disección para asegurar las capas se han eliminado con éxito.

8. Análisis

  1. Para analizar los datos,primero exportar el experimento deseada haciendo doble clic en el experimento terminó y seleccionando la opción "exportar datos" en el menú desplegable de archivos.
  2. Guardar estos datos en la ubicación del archivo deseado y abrir el programa de análisis. Haga clic en "abrir" en el programa de análisis y elija el archivo guardado recientemente.
  3. Dar al programa un momento para cargar el archivo y luego comprobar experimento bajo la pestaña de marcadores de eventos. Bajo la producción, active las casillas de los parámetros deseados. Por ejemplo, la línea de base, amplitud, área de pico (área bajo la curva), T subida, y T 80.
  4. Haz clic en Actualizar y luego analizar para exportar los datos a una hoja de cálculo (esto puede tardar unos minutos). El programa dará un mensaje para guardar el archivo en la ubicación deseada. Una vez guardado, el archivo puede ser editado en una hoja de cálculo.

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Resultados

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Mientras que esta tecnología se puede utilizar para medir las alteraciones en la señalización glutamatérgica en muchos tipos de modelos animales, tales como lesión cerebral traumática, el envejecimiento, el estrés y la epilepsia, aquí se demuestra cómo la tecnología MEA puede ser utilizado para examinar alteraciones glutamatérgicas en modelo de ratón transgénico de tauopatía humano 19, 20. El RTG (TauP301L) 4510 ratón expresa la ...

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Discusión

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La técnica MEA permite la medición de la cinética rápida de la liberación de neurotransmisores y la absorción in vitro e in vivo. Por lo tanto, la tecnología produce una amplia variedad de salida de datos incluyendo los niveles de neurotransmisores tónicas, la liberación de neurotransmisores evocada, y el aclaramiento del neurotransmisor. Sin embargo, ya que el uso de los AMA es un procedimiento relativamente complejo, existen numerosos factores que pueden necesitar ser optimizado para el uso con éxito...

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Divulgaciones

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GG es el único propietario de Quanteon, LLC que hace que el sistema de grabación-16 RÁPIDO utilizado para las mediciones de glutamato en este estudio. JEQ es un consultor pagado por Quanteon.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Asociación de Alzheimer (MNR; NIRG-12-242187), WVU Facultad de Investigación del Senado Grant (MNR), y WVU PSCOR Subvención (MNR).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
FAST-16mkIII-8 canalQuanteon16mkIII
Matrices de microelectrodosCenMetW4 o 8-TRK
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA-305910 g (caduca después de 1 mes)
GlutaraldehídoSigma-AldrichG-6257100 mL (caduca a los 6 meses)
Glutamato oxidasaUS Biological o Sigma AldrichG4001-01 o 10064650 UI (caduca a los 6 meses)
Jeringas HamiltonHamilton#803832 jeringas
MetanolBDHUN12304 L
clorhidrato de m-fenilendiamina (mPD)ACROS Organics133056025025 g
Electrodos de referencia (RE-5B)BASMF-20793 electrodos
Alimentado por batería Magnético placa de agitaciónCole-parmerEW-04804-01Se puede comprar de diferentes proveedores
GlutamatoSigma-AldrichG-1626100 g
Ácido ascórbicoTCI50-81-7500 g
Clorhidrato de dopaminaAlfa Aesar62-31-75 g
Ácido perclóricoVWRUN2920500 mL
Cloruro de postásicoVWR7447-40-71 kg
Cloruro de sodioVWR7647-40-71 kg
Cloruro de calcioMP153502100 g
Hidróxido de sodioBDH1310732500 g
Pipetas de expulsión a presión de vidrioCenMet
Cera pegajosaKerrlab625Se puede comprar a diferentes proveedores
MicrojeringaWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Arcilla para modelarWalMartPuede comprar de diferentes proveedores
Picospritzer IIIParker
Sistemas de AM de alambre de plata#786500
Ácido clorhídricoBDH76470102.5 L
Alambre de platinoAM Systems778000
Pistola de soldaduraLowes o Home DepotPuede comprar de diferentes proveedores
MultímetroWalMartPuede comprar de diferentes proveedores
PhysioSuiteKent ScientificPuede comprar de diferentes proveedores
SomnoSuiteKent ScientificPuede comprar de diferentes proveedores
DispositivoestereotáxicoStoeltingPuede comprar de diferentes proveedores
Digital Lab StandardStoeltingPuede comprar de diferentes proveedores
Meiji Microscopio EMZMeijiEMZ-5
DrillDremelMicro
MetricideMetrex102800
BisturíVWRPuede comprar de diferentes proveedores
Tijeras de cirugíaVWRSe pueden comprar de diferentes proveedores
Bastoncillos de algodón estérilesPuritan25806Se pueden comprar de diferentes proveedores
Ungüento para los ojosPuralube Ungüento para veterinarios Obtenerdel veterinario
Hisopos de yodoVWRS48050Se pueden comprar de diferentes proveedores
Hisopos con alcohol FarmacialocalPuede comprar de diferentes proveedores
Cortina de cirugía estérilDynarex4410Puede comprar de diferentes proveedores
Solución salina estérilTeknovaS5815Puede hacer su propia solución usando filtros
Peróxido de hidrógeno (3%)FarmaciaPuede comprar de diferentes proveedores
Almohadilla térmicaWalMartPuede comprar de diferentes proveedor
local

Referencias

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