Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Resumen

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

Resumen

Conjugados de anticuerpos (ACs) modificados con péptidos derivados de virus son una clase potencialmente poderosa de tumor de la célula entrega agentes de cargas moleculares utilizadas en el tratamiento del cáncer y la proyección de imagen debido a la creciente acumulación celular sobre ACs actual. Durante el temprano AC en vitro desarrollo, técnicas de fluorescencia y radioinmunoanálisis son suficientes para determinar la localización intracelular, la acumulación eficiencia y especificidad de la célula blanco. En la actualidad, no existe consenso en los métodos estandarizados para la preparación de las células para evaluar la localización y acumulación intracelular de AC. Las pruebas iniciales de ACs modificado con péptidos derivados de virus es fundamental sobre todo si se han construido varios candidatos. Determinar la acumulación intracelular de fluorescencia puede ser afectado por la señal de fondo de ACs en la superficie celular y complicar la interpretación de la acumulación. Para radioinmunoanálisis, células tratadas normalmente se fracciona y midió la radiactividad en compartimentos celulares diferentes. Sin embargo, lisis celular varían de célula a célula y compartimientos a menudo citoplasmáticos y nucleares no están adecuadamente aislados. Esto puede producir la engañosos datos sobre propiedades de entrega de carga. La inyección intravenosa de radiactivos ACs de péptido modificado derivado de virus en ratones seguidos por gammagrafía del cojinete del tumor es un método eficaz para determinar propiedades de tumor targeting y carga entrega en la fase de en vivo de desarrollo. Sin embargo, esto es un avance relativamente reciente y pocos grupos han evaluado derivados de virus ACs péptido modificado de esta manera. Describimos el tratamiento de células tratadas para evaluar con mayor precisión derivados de virus modificado de péptido AC la acumulación cuando se utiliza el radioinmunoanálisis y microscopía confocal. Específicamente, un método para quitar la superficie de la célula de las células trypsinizing bound ACs. También proporcionamos un método para mejorar el fraccionamiento celular. Por último, este protocolo proporciona un método en vivo utilizando tomografía por emisión de positrones (PET) para evaluar el tumor inicial dirigida a propiedades en ratones con tumores. Utilizamos el radioisótopo ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h) como una carga de ejemplo en este protocolo.

Introducción

Conjugados de anticuerpos (ACs) son productos biofarmacéuticos que están madurando en una clase transformadora de medicamentos eficaces para mejorar los tratamientos contra el cáncer y para detectar tumores. Compuesta por un anticuerpo monoclonal (mAb) conjugado con la moleculares cargas tales como radioisótopos, moléculas pequeñas y las toxinas biológicas, ACs son capaces de entregar las cargas útiles a las células cancerosas con destino exquisito antígeno afinidad y especificidad. Así, ACs tienen el potencial para reducir toxicidad inespecífica considerablemente y aumentar la actividad de carga en el sitio del tumor. Terapéutico, ACs transporte citotóxicas moléculas pequeñas (comúnmente contempladas como fármacos de anticuerpos conjugados) han sido aprobados para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama y linfoma de Hodgkin, que han fracasado los tratamientos convencionales ^{1, 2}. Además, radioisótopos transporte ACs (comúnmente contempladas como radioimmunoconjugates) también están en desarrollo. CA transporte de radioisótopos para la proyección de imagen está aprobado para la identificación de metástasis de cáncer de próstata ³. Con muchos ACs más terapéutico presentado para aprobación ⁴, el optimismo es alto para el futuro de ACs para mejorar la atención de cáncer ⁵.

Sin embargo, cuando ofrecer quimioterapia o radioisótopos, ACs tener dificultad con eficacia acumulando estas cargas dentro de las células diana. Este aspecto contribuye significativamente en muchos casos la imposibilidad de ACs para proporcionar larga duración de supervivencia libre de enfermedad o tumor de alto contraste proyección de imagen de ^6,7. En general, una vez que ACs se unen su antígeno blanco se internalizan a través de un proceso conocido como endocitosis mediada por receptor. Los ACs son atrapados dentro de endosomas y trata a los lisosomas para su degradación y liberación de carga ⁸. El proceso de tráfico intracelular plantea desafíos para el ACs lograr una carga alta especificidad y eficacia contra las células cancerosas de destino. Por ejemplo, muchos antígenos como Her2 (target para terapéutica AC Trastuzumab-emtansine) puede reciclar hasta un 85% de los anticuerpos encuadernados en los primeros 30 min ⁹. Además, una vez que se produce degradación, quimioterápicos liberado y radioisótopos pueden ser activamente exportados por aumento de la expresión o actividad de transporte de membrana asociada proteínas ^10,11. Degradación del lisosoma también impide la entrega de novela cargas biológicas tales como enzimas terapéuticas y oligonucleótidos que pueden ser desactivado de ^12,13. En esencia, la célula cancerosa es altamente efectiva en abrogar la necesaria acumulación intracelular de cargas por ACs.

Este protocolo describe cómo implementar el concepto de ACs-unida a péptidos derivados de virus, especialmente para escapar captura endosome y localizar al núcleo celular. Con tal sofisticación para manipular sistemas host de la célula, no es sorprendente que el desarrollo de péptidos y proteínas derivadas del virus como potenciales biofármacos durante mucho tiempo ha sido arraigado en investigación terapéutica ¹⁴. Durante millones de años los virus han evolucionado para adquirir una colección excepcional de proteínas capaces de explotar los sistemas fisiológico normal de la célula mamífera para entrar eficazmente en las células del huésped. Para virus que son internalizados por endocitosis mediada por receptor, son también desafiaron con escape trata al lisosoma donde el embate de una concentración localizada de proteasas puede ser problemático para la supervivencia. Un bien caracterizado péptido viral derivados utilizado en la entrega de la droga para escapar captura endosome es el virus de inmunodeficiencia humana transactivator de transcripción (Tat) proteína ¹⁵. TAT es capaz de escapar captura endosome detectando en qué punto cambios conformacionales de la proteína ocurren Tat propicio para insertarse en y alterar la membrana endosomal del ¹⁶de pH bajo. Esto resulta en conjugados de Tat-carga útil acceder al citoplasma. El segundo elemento de manipulación viral relacionada con este protocolo es el enfoque utilizado para entregar genes terapéuticos y medicamentos para la de núcleo ¹⁷. Virus han evolucionado para manipular con éxito maquinaria de la célula huésped para progresar más allá de la membrana nuclear pasando a través del poro nuclear complejo (NPC). Macromoléculas celulares contienen (o se unen a proteínas que contienen) transportan de señales de localización nuclear (NLSs) necesarias para atar a nuclear proteínas (e.g. carioferinas α y β), que proporcionan los movimientos requeridos a través de la APN. Virus han desarrollado proteínas para contener secuencias NLS que les proporcionen la capacidad para utilizar proteínas de transporte de la célula anfitrión para realizar la transición en el núcleo ¹⁸.

Numerosos ACs previamente han sido funcionalizados con péptidos derivados de Tat y NLS y probados por su capacidad para acumular dentro de las células cancerosas y para apuntar tumores ^{19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30} (tabla 1). Entrega de cargas citotóxicos los estudios han demostrado que ACs modificado con péptidos derivados de virus son capaces de aumentar significativamente la acumulación celular, citotoxicidad y tumor matando sobre si ACs ^22,26. Una característica común de esta nueva clase de AC es su construcción. Por lo general, péptidos contienen una cisteína terminal proporciona un grupo sulfhidrilo libre. MAbs se reaccionó primero con un crosslinker bifuncional de noncleavable que contiene N- hydroxysuccinimide (NHS) y grupos de maleimida en extremos opuestos. Los ésteres de NHS reaccionan con aminas primarias en el mAb para formar enlaces amida. El mAb reaccionado con los grupos de maleimida gratis es entonces reaccionado con los grupos sulfhidrilo de los péptidos para formar un thioester enlace y así une el péptido y el mAb. Aunque homobifunctional reticulados han utilizado ²⁸, heterobifunctional crosslinker son más comúnmente utilizados en la construcción de ^22,23,de péptido derivado de virus-ACs^{26, 31,32}. Este protocolo utiliza específicamente el crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) por su facilidad de uso y porque se utiliza en el conjugado de anticuerpo-medicamento aprobado Trastuzumab-emtansine y en muchos ^{22, 8,23,26,}de péptido derivado de virus-ACs de^31,32. Electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) es el método principal para determinar inicialmente la eficiencia verbal y para la cuantificación del número de péptidos por mAb. La microscopia confocal utiliza un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia específico para el mAb suele ser el método para evaluar inicialmente la propiedades de la distribución intracelular de ACs de péptido modificado derivado de virus. Hasta el momento, radioisótopos son las cargas primarias por virus derivados péptidos modificados ACs. Radioisótopos son ventajosas porque la radioactividad en las células se cuantifica fácilmente contando gamma. Además, ACs que se traducen en modelos de ratón de los cánceres humanos proporcionan los investigadores con la capacidad de evaluar tumor targeting mediante modalidades de proyección de imagen moleculares, tales como emisión de fotón único tomografía computada y tomografía por emisión de positrones (PET) ^{23 , 32 , 33}. en general, la construcción y validación de métodos utilizados principalmente por los investigadores de pruebas proporcionan una muy buena evaluación de ACs modificado con péptidos derivados de virus durante la fase de desarrollo inicial con eficacia y entregar los capacidad de carga interior de las células diana y atacan tumores.

TAT y NLS-modificado ACs tienen iluminadas áreas clave para mejorar aún más la entrega de la carga útil dentro de las células cancerosas y tumores. Con respecto a ACs NLS-modificado, la eficiencia en la acumulación intracelular puede ser modesta ^23,31,34. Ineficaz acumulación intracelular es causada por compresión continuada endosomal. En vivo tumor targeting puede también disminuir con tanto Tat y NLS-modificado ACs. Las secuencias activas de Tat y NLS contienen varios residuos cargados positivas. Cuando sujeta a mAbs, la carga total catiónica puede ser significativamente mayor de ³⁵. Como consecuencia, el Tat y NLS-modificado ACs han aumentado absorción en tejidos sanos y aumenta la separación rápida de la sangre.

Nuestro grupo desarrolló un compuesto compuesto compuesto de ácido cólico relacionado con NLS (ChAcNLS; Figura 1). Modificado de ChAcNLS ACs son capaces de aumentar la acumulación intracelular de radioisótopos entregados y mejorar tumor targeting en comparación con el tradicional y modificado de NLS ACs ^33,34. El mecanismo detrás de ácido cólico se inspira en la capacidad de seleccionarlos nonenveloped virus que no puede confiar en la fusión de la membrana a utilizar ácido cólico para activar endosome escape a través de la formación de ceramida. Por ejemplo, virus entérico porcino reclutas de ácido cólico que activa la esfingomielinasa, que cataliza la hidrólisis de esfingomielina a ceramida ^36,37,38. Esto desestabiliza la membrana endosomal y permite el escape del virus. Así, el ácido cólico es otro componente derivado de virus que complementa NLS.

Como este campo se mueve hacia adelante y el futuro los avances se producen en la entrega de la carga de ACs con péptidos derivados de virus, es un momento oportuno para ofrecer las manifestaciones visuales de sus características bioquímicas y funcionales durante el desarrollo inicial. Aquí, describimos nuestro protocolo para la evaluación inicial de los derivados del virus modificado de péptido ACs para la determinación simple pero eficaz de acumulación intracelular y tumor orientación durante el desarrollo temprano de la etapa. Usamos los mAbs comercialmente disponibles 7 3 y A14 como sistemas modelo de ejemplo. Procedimiento 1 describe el uso de SDS-PAGE como un método que permite las decisiones ' go/no go' de ACs construido. Procedimiento 2 describe un método mediante tripsinización permitiendo mejor visualización de la acumulación y la distribución intracelular de AC. Procedimiento 3 describe un método para mejorar fraccionamiento intracelular determinar con precisión la localización nuclear. En este procedimiento utilizamos la carga ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h) ya que es vulnerable a la emanación celular y es un emisor de positrones ¹⁰. Así, 4 procedimiento describe en vivo tumor a caracterización por animal doméstico proyección de imagen para visualizar la captación del tumor en relación con el fondo (es decir, tejidos sanos no objetivo) y determinar si el ejemplo AC puede específicamente y con eficacia atacan tumores. Estos métodos son suficientes para los investigadores desarrollar ACs modificado con péptidos derivados de virus para identificar a candidatos para más adelanto.

Protocolo

Los en vivo animal experimentos descritos se realizaron según un protocolo aprobado y bajo las normas éticas del Comité de ética de la Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke en experimentos animales.

1. anticuerpo péptido verbal

Nota: ChAcNLS puede sintetizarse en cualquier fabricante comercial péptido o plataforma de servicio de síntesis de péptido Universidad-afiliado. La síntesis de ChAcNLS puede encontrarse en la referencia ³⁴. Para los procedimientos 1 y 2 usar el mAb 3 7, que es específico para el antígeno de la leucemia IL-3Rα ³⁹.

1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, preparar un 10 mg/mL solución (anticuerpo total de ~ 1 mg) de 3 de 7 en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,6.
2. Disolver el sulfo-SMCC en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración de 5-10 mM. Vortex la solución completamente funciona mejor con el fin de lograr la disolución completa.
3. Agregar al tubo que contiene 3 7 la solución disuelta de sulfo-SMCC (normalmente entre 5-20 μL dependiendo de la relación molar de sulfo-SMCC-a - 7 3 deseado). Se recomienda la prueba sulfo-SMCC-a - 7 3 ratios de 10, 25 y 50 a 1. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Purificar y concentrar la maleimida derivatizada 7 3 utilizando un cambio de tampón y dispositivo de ultrafiltración en PBS, pH 7.0. Centrifugue a 8.000 g x aproximadamente 5 min descartar flujo a través y se llenan de PBS, pH 7.0 y centrifugar nuevamente.
   1. Realizar este 7 - 8 veces para intercambiar completamente el búfer. Recuperar el concentrado 3 7 proteína colocando hacia abajo el dispositivo de filtro en un tubo de microcentrífuga limpio. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g. volumen de recuperación debe ser aproximadamente de 0,3 mL
5. En el tubo que contiene los 3 7 activado maleimida, añadir 2 veces exceso molar de ChAcNLS en relación con la proporción de sulfo-SMCC-a - 7 3 utilizada en el paso anterior e incubar durante una noche a 4 ° C. Por ejemplo, si se utilizó una proporción de sulfo-SMCC-a - 7 3 10 a 1, entonces utilice una proporción de 20 a 1 ChAcNLS-a - 7 3. Volumen total no debe ser cambiado significativamente.
   Nota: Aunque ChAcNLS no provoca precipitación durante el proceso verbal se trata de una posibilidad que podría ocurrir con otros péptidos. Observar el tubo durante la reacción para las muestras de precipitación, que es probablemente causada por péptidos son hidrofóbicos. En estos casos puede ser vale la pena revisar el péptido de interés para diseñar cambios para proporcionar mayor hidrofilia.
6. Concentran el 7G 3-ChAcNLS utilizando un dispositivo de ultrafiltración deseado intercambio concentración y buffer pH 7.4 (ver paso 1.4) de PBS. El rendimiento de recuperación de la proteína total debe ser ≥ 75% de material original de partida.
7. Realizar SDS-PAGE para evaluar a los candidatos de ChAcNLS 3 G 7 construido usando un gel de poliacrilamida al 12% (proporciona suficiente separación de la ChAcNLS conjugada pesado y cadenas de las cadenas más ligeras). Mix 10 μg de 7G 3-ChAcNLS de carga de las páginas de búfer que contiene 2 μL de β-mercaptoetanol y carga en bien.
8. Establecer la adecuada tensión (120 V durante 1 hora para un gel de 12%) y correr la electroforesis. Detener la electroforesis cuando el frente del tinte Coomassie alcanza la parte inferior del gel.
   Nota: No deje que el frente del tinte Coomassie escurr el gel.
9. Retirar el gel del aparato de electroforesis y enjuague con extracción de solución que contiene 10% v/v de ácido acético glacial y 20% metanol v/v.
10. Tomar una fotografía del gel y con una regla y medir la distancia (cm) emigraron para los estándares y 7 3 conjugados. Calcular el valor del factor (Rf) de retención, que es la distancia migraron dividida por la longitud del gel (de donde la proteína se carga en el frente de migración de Coomassie). Parcela el peso molecular (MW) en el registro contra los valores de Rf de cada proteína estándar y extrapolar el tamaño de los 3 7 conjugados.
11. Calcular el número de péptidos por anticuerpo dividiendo la diferencia de MW entre 7 3 conjuga y sin modificar 3 7 por 1768.5 g/mol (MW de ChAcNLS).
12. Tomar imágenes digitales del gel teñido de Coomassie y realizar análisis de densitometría. En este punto, selección de un candidato del plomo puede basarse en la CA con el número máximo de moléculas de ChAcNLS que no contiene especies agregadas significativas.

2. confocal microscopio para la evaluación de la acumulación intracelular

Nota: Es importante comprobar la selectividad de la célula de la acumulación intracelular de los mAbs péptido modificado antes de desarrollar formulaciones con una carga útil de interés. Porque Tat también ha demostrado tener una propensión para la penetración del celular no específico, vale la pena el primer análisis intracelular célula y acumulación selectividad antes de pasos de desarrollo costoso de empresa con cargas costosas. Por esta razón, procedimiento 1 también deben modificar isotipo control irrelevante específico mAbs. Para el resto del protocolo vamos a trabajar con ACs modificado con 10 moléculas de ChAcNLS por anticuerpos. Un esquema incluyendo pasos clave para procedimientos de 2 y 3 se describe en la figura 2.

Atención: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación del paraformaldehido. Siga las instrucciones del fabricante cuando maneje.

1. Tratamiento de las células de la blanco TF-1a con 200 nM de 7G 3-ChAcNLS incluyendo modificado control mAbs. Incubar 5 x 10⁶ células de antígeno-positivas con los conjugados por 1 h a 37 ° C.
2. Después de 1 h, eliminar el sobrenadante y lavar con 1 mL x 3 en PBS helado. Añadir medio fresco e incube durante una hora adicional a 37 ° C.
3. Después de la hora adicional, eliminar el sobrenadante y lavar x 3 en 1 mL PBS helado. Añadir 0.5 mL de PBS con un 0.25% tripsina y etilendiaminotetracético ácido (EDTA) a 37 ° C por arriba de 3 a 30 min.
   Nota: Durante pruebas piloto inicial se recomienda no trypsinize las células con el fin de determinar las diferencias en la acumulación intracelular de AC. Este protocolo promueve el uso de la tripsina y demostramos cómo esto mejora la evaluación de la eficacia de la acumulación intracelular de diferentes candidatos de AC.
   1. Prueba los diferentes tiempos de incubación comprobando visualmente todas las células están separadas. Además, incubar alícuotas de células con soluciones de tinción de viabilidad y realizar el análisis cytometric del flujo como se describió anteriormente ⁴⁰.
   2. Neutralizar la tripsina con 1,5 mL del cultivo celular RPMI 1640 media/10% suero bovino fetal. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y lavar 3 x 0,5 mL PBS helado.
4. Fijar las células en 0.5 mL de PBS conteniendo paraformaldehído al 1% y 1% de sacarosa en el hielo para el lavado de 30 minutos células 3 x en 0.5 mL de PBS helado y centrifugar a 250 x g por 5 min Permeabilize las células en 0.5 mL de PBS con un 0.15% Tritón X-100 durante 5 minutos en hielo. Lavar las células en PBS helado y repetir la centrifugación.
5. Suspender las células en PBS 0, 1 mL que contiene 2 μg/mL (o el fabricante recomendada concentración) de un anti-murino (isotipo específica) Fc secundaria anticuerpo policlonal conjugado con 647 AlexaFluor por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
   1. Centrifugue a 250 x g por 5 minutos y lavar las células 3 x en 0.5 mL de PBS helado. Suspender las células en 0.5 mL de PBS.
      PAUSA: Las células pueden almacenarse en el refrigerador.
      Nota: Es esencial para seleccionar un anticuerpo secundario que reconoce el isotipo correcta del mAb de interés. AF647 se selecciona debido a su emisión de infrarrojo lejano, que no interfiere con la propidio yoduro (PI) tinción del núcleo.
6. Añadir PI a una concentración de 10 μg/mL en el contenedor con las células. Montar 1 x 10⁵ células en portaobjetos usando medios de montaje y la tapa con un cubreobjetos de vidrio.
7. Examinar las células con un objetivo Plan Apo 60 X de inmersión aceite NA 1.42 en un láser invertido microscopio confocal de barrido. Detectar fluorescencia de PI usando el láser de argón 488 nm y el prisma de análisis espectral de 600-650 nm. Para AF647 fluorescencia utiliza los 633 nm láser de helio-neon y el prisma de análisis espectral de 650-700 nm. Recoger las emisiones de fluorescencia de PI y AF647 secuencialmente.
   Nota: Utilice la misma configuración a lo largo de la evaluación y comparación de las células. Sin embargo, deberás ajustar la configuración para las células tripsinizaron comparadas a las células no tripsinizaron.
8. Usar software de microscopio para adquirir imágenes. Recoger imágenes usando serie horizontales secciones ópticas de 1.024 x 1.024 pixeles con 2 X línea promedio tomadas a intervalos 0,5 μm a través del espesor de toda la célula. Presente las imágenes apiladas como z-proyecciones de cuatro cortes consecutivos en la intensidad de fluorescencia máxima.
9. Analizar las células con el software del microscopio. Grabar el patrón de distribución celular de los conjugados. Específicamente, evaluar si la fluorescencia intracelular en el citoplasma se agrupa y cerca de la célula superficial o difusa y homogénea. También evaluar la intensidad de fluorescencia relativa por la célula.

3. radiactiva CA construcción y fraccionamiento celular para la evaluación de la eficiencia de transporte intracelular Cu ⁶⁴

PRECAUCIÓN: Los procedimientos 3 y 4 implican el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos, los investigadores deben han aprobado formación de seguridad y protocolos de actuación aprobados de autoridad de seguridad de radiación de su institución de origen.

Nota: Para los procedimientos 3 y 4 se utiliza el mAb A14, que es específico para el antígeno de cáncer de vejiga invasivo IL-5Rα⁴¹. Además, todos los experimentos son sensibles debido a la corta vida media de ⁶⁴Cu. En general, es mejor no esperar 1 semana para realizar experimentos en vitro y no más de 72 h para los estudios en vivo .

1. En un tubo de 1,7 mL suspender el ácido 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic (NOTA-NHS) de DMSO a una concentración de 10 mM.
2. Reaccionar 50-fold exceso molar de NOTA-NHS con A14 (2 mg a partir de material) de bicarbonato de sodio de 0.1 M a pH 8.6 por 1 h a temperatura ambiente en un volumen ≤ 0,5 mL (volumen final de la NOTA-NHS no debe exceder 2% v/v del volumen total).
3. Purificar y amortiguador-cambio NOTA-A14 utilizando un dispositivo de ultrafiltración en PBS, pH 7,6 (ver paso 1.4).
4. Para la fijación posterior de ChAcNLS, siga los pasos 1.2-1.6.
5. Reaccionan NOTA-A14-ChAcNLS (lotes de 250 μg) con 100 megabecquerel (MBq) de ⁶⁴CuCl₂ en bicarbonato de sodio de 0.1 M, pH 5,5 por 1 h a 37 ° C ≤ 0,1 mL. ⁶⁴ Cu es producido en el ciclotrón de TR-PET en el CIMS ⁴².
6. Concentran ⁶⁴Cu-A14-ChAcNLS pH PBS 7.4 usando un dispositivo de ultrafiltración para la concentración deseada (vea el paso 1.4).
7. Determinar la eficiencia radiolabeling de ⁶⁴Cu-A14-ChAcNLS por cromatografía en capa fina instantánea (objetivo) mediante cromatografía y 0.1 M, citrato de sodio pH 5.5 (objetivo eluyente) como solvente. Aplicar alícuota 0,5 de μL de la solución de reacción a la franja de objetivo. Realizar un autoradiograph de la tira y obtener una imagen digital.
   1. Realizar densitometría ósea para obtener la proporción del límite y libre ⁶⁴Cu. Si libre ⁶⁴contenido Cu > 5%, volver al paso anterior y realizar la purificación adicional.
   2. Además, realizar SDS-PAGE con Coomassie tinción para evaluar las adiciones. Realizar un segundo de SDS-PAGE que seguido de un autoradiograph del gel para determinar si existen especies totales radiomarcadas.
8. Afinidad de Unión punto de control de calidad: incubar ⁶⁴Cu-A14 conjugados en concentraciones crecientes (0-100 nM) por duplicado con las células de blanco de 1 x 10⁶ / mL. Para estimar el atascamiento no específico, mezclar muestras duplicadas de ⁶⁴Cu-A14 conjugados con las células en presencia de 100-fold exceso molar de A14 sin etiquetar.
   1. Después de 1 h de incubación en hielo, lavar las células y contar muestras de anticuerpo unido total y total no específico anticuerpo unido en un contador gamma. Gráfica unión específica (anticuerpo unido total - no específica límite anticuerpo) contra reactivo libre ⁶⁴Cu-A14 (nM) utilizado en el ensayo. Determinar la constante de disociación (K_d) por regresión no lineal utilizando el software de gráfica.
9. Estudios de acumulación celular Cu ⁶⁴: tratar las células con 100 nM de ⁶⁴A14 Cu-labeled conjugados para 1 h, 6 h, y 24 h a 37 ° C como se ha descrito³³. Incluir parámetros adicionales tales como el tratamiento en presencia de A14 sin modificar para bloquear IL-5Rα los sitios y a 4 ° C para bloquear la internalización mediada por receptor.
10. En el momento definido puntos, como anteriormente se describe en paso 2.3 - 2.3.2, Añadir 0,5 mL de tripsina de 0,25% que contiene PBS y EDTA a 37 ° C seguido de neutralización y lavado.
11. Incubar las células en tampón de lisis de membrana plasmática que contiene 1% NP-40, 10 mM de Tris de pH 7.5, NaCl 10 mM, 3 mM MgCl₂ buffer en hielo durante 10 minutos centrifugar las células lisis de membrana plasmática 90 x g durante 5 minutos.
12. Eliminar el sobrenadante y colocar en tubo fresco. Esto representa la fracción citoplasmática. Lavar los núcleos 3 x en PBS helada y agregar los lavados a la fracción citoplasmática.
13. Asegúrese de que se sellan los frascos que contienen las fracciones citoplasmáticas y nucleares. Luego colóquelos en una gamma contador calibrada para ⁶⁴Cu para convertir cuentas crudas de MBq.
14. Determinar la calidad del aislamiento de los núcleos mediante la realización de análisis de Western blot para Lamin A/C, una proteína nuclear restringida y Rab7, una proteína citoplasmática abundante en toda célula fracciones lisados, nucleares y citoplásmicas.
    1. Tratar 5 x 10⁶ células con 500 μL de tampón de ensayo (RIPA) radio inmunoprecipitación y el buffer de lisis de membrana plasmática en paso 3,12 que contiene 1%, 2% y 4% NP-40. Además, tratar los núcleos aislados en 500 μL de tampón RIPA para obtener aisladas proteínas nucleares.
    2. Precipitar las proteínas aisladas células nucleares, citoplasmáticos y todo utilizando 4 x el volumen de muestra de acetona fría durante 60 min a-20 ° C. Centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos y decantar el sobrenadante teniendo cuidado de no desalojar el precipitado de proteína. Añada 100 μL de PBS para disolver las proteínas.
    3. Carga de 10 μg de proteína en cada pozo del gel de SDS-PAGE 10%. Realizar la electroforesis como se describe en 1.7-1.9. Realizar a transferencia de Western Blot como previamente se describió en refeference ⁴³.
    4. Identificar la escala de marcadores que mejor corresponden a un MW de 40 kDa. Corta la membrana a la mitad en este marcador. Probe el blot que contiene las proteínas mayor de MW con anticuerpos específicos Lamin A/C. Sondeo la membrana con las proteínas MW inferiores con los anticuerpos específicos de la 7 de Rab. Western blot es una técnica bien conocida y no descrito en el presente Protocolo.

4. animal doméstico proyección de imagen de evaluación del Tumor Targeting

Nota: Las técnicas de implantación de células tumorales en ratones para generar heterotopic xenoinjertos son bien conocidas y mayoría de los laboratorios tiene protocolos internos a medida para su sistema de tumor. Por lo tanto, esto no está cubierto en el protocolo. El modelo de xenoinjerto será nonobese diabético grave combinada (NOD/SCID) ratones inmunodeficientes con tumores de vejiga invasivo IL-5Rα-positive 1376 HT y HT-B9. Las células del tumor de vejiga invasivo IL-5Rα-positivos constituyen > 66% de células totales en los xenoinjertos. En cambio, sólo ~ 11% de las células IL-5Rα-positive HT-B9 figuran en xenoinjertos desarrollados⁴¹. Así este modelo es un excelente ejemplo para evaluar la AC tumor targeting en dos tumores que representan la heterogeneidad tumoral paciente previsible.

1. En grupos que contienen ≥ 4 ratones (NOD/SCID), inyecte 20-30 μg (6-9 MBq) de ⁶⁴Cu-A14-ChAcNLS, ⁶⁴Cu-A14-NLS y ⁶⁴Cu-A14 en la vena de la cola.
2. El mismo día Coloque un fantasma cilíndrico (24,8 mL) que contiene 5 MBq de ⁶⁴Cu para convertir las cuentas radiactivas por segundo en dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g).
3. Espere 48 h y luego anestesiar ratones colocándolos en una cámara de inducción con 1.5 L/min de flujo de oxígeno con 2% de isoflurano. Aplique ungüento oftálmico estéril a los ojos del ratón después de la inducción y antes de la colocación en el tomógrafo PET.
4. Transfiera rápidamente el ratón a una mesa del tomógrafo PET en la cabeza posición propensa con un cono de nariz para isoflurano. Posición de la respiración y las sondas rectales y monitor temperatura y respiración la tasa para asegurar que se mantengan las condiciones fisiológicas durante el experimento anteriormente describen ⁴⁴.
5. Iniciar la adquisición de datos de la PET utilizando una configuración de modo de muestreo regular y una ventana de energía de 250-650 keV. Por lo general, una exploración estática de 45 minutos por ratón es suficiente para proporcionar suficientes eventos coincidentes para la reconstrucción y producción de imágenes PET de alta calidad.
6. Después de la exploración de ⁶⁴Cu-CA, quite el ratón desde el escáner y colocar en la jaula. Permiten el ratón para recuperar lo suficiente antes de volver al centro de animales.
7. Obtener imágenes reconstruidas usando 20 iteraciones de un algoritmo de máxima verosimilitud expectativa maximización tridimensional.
8. Realizar la región de análisis de interés (ROI) del tumor y órganos visualmente evaluables mediante el software de amida.
   1. ROIs para obtener datos cuantitativos %ID/g manualmente utilizando el ajuste de la herramienta Freehand 3D de dibujar y delinear cuidadosamente los tumores o el músculo del muslo adyacente. Las cuentas por pixel en la ROI se convertirán en %ID/g del paso anterior 4.2.
9. Comparar ⁶⁴Cu-A14, ⁶⁴Cu-A14-ChAcNLS, ⁶⁴Cu-A14-NLS imágenes para contraste del tumor y cuantitativo ROI % ID/g y ratios de tumor a fondo.

Resultados

Para el procedimiento 1, la construcción de 7 3 modificado con ChAcNLS uso de sulfo-SMCC como un crosslinker es muy confiable. Por lo general, cuando se cargan en un gel de 12% y analizadas por SDS-PAGE, esto se traduce en aumentos progresivo distinguibles en MW proporcional al aumento de ratios de sulfo-SMCC-a - 7 3 usa y permite para que las cadenas pesadas y ligeras para evaluarse individualmente para ChAcNLS verbal (figura 3). 7G 3 reaccionaron en 10, 20, 25-y ratios ...

Discusión

Objetivos principales de la entrega sistémica de agentes contra el cáncer son aumentar la acumulación en el sitio del tumor y la absorción dentro de las células cancerosas y reducir los efectos secundarios no deseados en los tejidos sanos. Entrega de AC dirigido de cargas moleculares a las células tumorales es un enfoque muy prometedor para tratar y detectar tumores. Sin embargo, la falta de eficacia causada por atrapamiento del endosome y por degradación lisosomal de corriente sigue siendo un reto importante. Si bien es...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	Hay muchos reticulantes de maleimida homo y heterobifuncionales entre los que elegir.
Filtros centrífugos Amicon Ultra-0.5 mL EMD	Millipore	UFC505096	Hay tamaños de paquete de 8, 24 y 96. Elige según tus necesidades.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Proteínas recombinantes Mulicolor de 10 a 250 kDa.
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenol,	Thermo Scientific 25200056		volúmenes de 100 o 500 mL a elegir.
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Alexa Fluor 647	Thermo Scientific	A-21235	1 - 10 μ g/mL recomendado
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C anticuerpo (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 anticuerpo	Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Tampón de muestra (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2- Mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
Celdas TF-1a	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medio	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA tampón de lisis y extracción	Thermo Scientific	89900
AMIDE software de imágenes médicas	disponible en amide.sourceforge.net		Descarga
completamente gratuitaMicroscopio confocal FluoView FV1000	Olympus
Software Fluoview	Olympus		www.olympus-lifescience.com
Tiras ITLC Biodex		150-771