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Las especies de oxígeno reactivo (ROS) regulan los procesos celulares esenciales incluyendo la expresión génica, la migración, la diferenciación y la proliferación. Sin embargo, los niveles excesivos de ROS inducen un estado de estrés oxidativo, que se acompaña de daño oxidativo irreversible al ADN, lípidos y proteínas. Por lo tanto, la cuantificación de ROS proporciona un proxy directo para la condición de salud celular. Dado que las mitocondrias están entre las principales fuentes celulares y objetivos de ROS, el análisis conjunto de la función mitocondrial y la producción de ROS en las mismas células es crucial para comprender mejor la interconexión en condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto, se desarrolló una estrategia basada en la microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS, el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) y la morfología mitocondrial. Se basa en microscopía de fluorescencia de campo ancho automatizada y análisis de imágenes de células adherentes vivas, crecidas en placas de pocillos múltiples, y staineD con las moléculas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (ΔΨm y morfología mitocondrial) permeables a las células. En contraste con la fluorimetría o la citometría de flujo, esta estrategia permite cuantificar los parámetros subcelulares a nivel de la célula individual con alta resolución espacio-temporal, tanto antes como después de la estimulación experimental. Es importante destacar que la naturaleza basada en imágenes del método permite extraer parámetros morfológicos además de intensidades de señal. El conjunto combinado de características se utiliza para el análisis exploratorio y estadístico de datos multivariados para detectar diferencias entre subpoblaciones, tipos de células y / o tratamientos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo, junto con un ejemplo de experimento que demuestra su potencial para la discriminación inequívoca entre los estados celulares después de la perturbación química.