Aquí nos presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40), apto para la formación de oligómeros. El amiloide beta es un péptido altamente propensos agregación, hidrófoba implicada en la enfermedad de Alzheimer. La naturaleza del péptido amiloidogénico hace su purificación un desafío.
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Artículo de método
Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros
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Resumen
Resumen
Los péptidos amiloidogénicos, como la beta amiloide (Aβ) implicada en la enfermedad de Alzheimer, pueden presentar un desafío significativo cuando se trata de obtener material de alta pureza. Aquí presentamos un protocolo de purificación de HPLC personalizado para producir péptidos beta amiloide 42 (Aβ42) y beta amiloide 40 (Aβ40) de alta pureza. Hemos descubierto que la combinación de la fase estacionaria hidrofóbica poli(estireno/divinilbenceno) disponible comercialmente, la fase inversa de laboratorio de polímeros - estirenidilbenceno (PLRP-S) en condiciones de pH alto, permite el logro de Aβ42 de alta pureza (>95%) en una sola corrida cromatográfica. La purificación es altamente reproducible y puede modificarse tanto a condiciones semi-preparativas como analíticas, dependiendo de la cantidad de material que se desee purificar. El protocolo también se puede aplicar al péptido Aβ40 con idéntico éxito y sin necesidad de alterar el método.
Introducción
La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo que los efectos más de 35 millones de personas en todo el mundo. 1 Implicado fuertemente en la aparición y desarrollo de la enfermedad, es la agregación altamente propensa, péptido amiloide beta hidrófobo (Aß). 2 Aß se extiende de 36 a 43 aminoácidos de longitud, sin embargo, se cree que la variante de ácido 42-amino, amiloide beta 42 (Aß42), es la forma más tóxica de la proteína. 3 Esto se debe en su mayor parte a la capacidad de Aß42 para formar fácilmente difusibles, especies oligoméricas que se cree que son entidades particularmente....
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Protocolo
1. La HPLC preparativa purificación del Aß40 o Aß42 Péptido
- Preparar los siguientes tampones para la purificación por HPLC.
- Preparar el tampón A (20 mM NH 4 OH) mediante la adición de 1,3 ml de NH4OH (solución al 28%) a 1000 ml de agua ultrapura.
- Preparar el tampón B (80% de acetonitrilo con 20 mM NH 4 OH) mediante la adición de 1,3 ml de NH 4 OH (solución al 28%) a una solución de 800 ml de acetonitrilo de grado HPLC y 200 ml de agua ultrapura.
- Preparar tampón de disolución de la muestra (0,1% NH 4 OH) mediante la adición de 100 l de NH 4 OH (so....
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Resultados
La purificación del péptido Aß42 usando una combinación de la fase estacionaria PLRP-S y un pH alto resultados de fase móvil en la formación de un pico agudo, resuelto para el péptido Aß en un tiempo de retención entre 72 y 74 min (Figura 2C). La confirmación de la identidad del pico se realiza a través de inyección directa de espectrometría de masas del eluyente recogido. El eluyente se puede almacenar a -20 ° C en solución para un máximo de 12 h. Períodos más largos de.......
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Discusión
La purificación por HPLC del péptido Aß es altamente dependiente de la elección tanto de la fase estacionaria empleada en la purificación y la fase móvil elegido para eluir el péptido. El punto isoeléctrico bajo del péptido y la alta propensión a la agregación render condiciones cromatográficas tradicionales para la separación de proteínas hidrófobas (C4 o fase estacionaria C8 junto con un eluyente móvil ácida) un reto, con el péptido Aß eluyendo como un prolongado amplio, no resuelta pico (Figura 2A). .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Agilent para su asistencia técnica. Kate Markham y Rafael Palomino se acreditan por su ayuda inicial para la síntesis y purificación del péptido Aß y el Dr. Hsiau-Wei Lee se dio las gracias por su ayuda en la preparación de la Figura 1 del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bomba cuatrimestral Agilent 1260 Infinity II | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Detector de longitud de onda variable dual | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Inyector manual Agilent 1260 Infinity II equipado con un bucle de muestra de acero inoxidable de 10 mL | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Inyector manual equipado con 20 µ L bucle de muestra de acero inoxidable | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| montaje de soporte de anillo | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 å 5 y micro; m 4,6 x 250 mm (Analítico) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ 42 o Aβ 40 péptidos | Sintetizado internamente utilizando un sintetizador de péptidos automatizado CEM liberty. | ||
| Hidróxido de amonio (NH4OH, solución al 28%) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrilo | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Agua de grado HPLC | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 mL tubo de centrífuga cónico | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Ajuste de una sola pieza, paquete de 5 unidades | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 cc jeringa estéril | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS | Needle Rheodyne | 3725-086 |
Referencias
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer's disease....
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Reimpresiones y permisos
