el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.
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Artículo de método
En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los puntos fuertes genéticos y técnicos han hecho los vertebrados pez cebra un organismo modelo clave en el que las consecuencias de las manipulaciones genéticas pueden ser rastreados en vivo durante todo el periodo de desarrollo rápido. Múltiples procesos pueden ser estudiados incluyendo la proliferación celular, la expresión génica, la migración celular y morfogénesis. Es importante destacar que la generación de quimeras a través de trasplantes puede realizarse fácilmente, lo que permite el etiquetado de mosaico y el seguimiento de las células individuales bajo la influencia del medio ambiente host. Por ejemplo, mediante la combinación de manipulaciones de genes funcionales del embrión de acogida (por ejemplo, mediante microinyección morfolino) y las imágenes en vivo, los efectos de la extrínseca, señales celulares no autónomas (proporcionados por el entorno modificado genéticamente) en las células del donante trasplantadas individuales pueden evaluarse. Aquí se demuestra cómo se utiliza este método para comparar la aparición de la expresión transgénica fluorescente como un proxy para la sincronización de deter destino de la célulaación en diferentes entornos host genética.
En este artículo, proporcionamos el protocolo para la microinyección de embriones de pez cebra para marcar las células del donante y para provocar la precipitación de genes en embriones de acogida, una descripción de la técnica de trasplante usado para generar embriones quiméricos, y el protocolo para la preparación y administración in vivo confocal de lapso de tiempo obtención de imágenes de múltiples embriones. En particular, la realización de imágenes de varias posiciones es crucial cuando la comparación de tiempo de los eventos tales como la aparición de la expresión génica. Esto requiere la recopilación de datos de control múltiple y embriones experimentales procesados simultáneamente. Este enfoque se puede ampliar fácilmente para los estudios de las influencias extrínsecas en cualquier órgano o tejido de elección accesible a imágenes en directo, siempre que los trasplantes pueden ser dirigidos fácilmente de acuerdo con los mapas de destino embrionarias establecidas.
Introducción
La capacidad de visualizar los procesos de desarrollo importantes en un vertebrado in vivo ha contribuido a que el pez cebra un modelo clave para el estudio de las condiciones normales y de enfermedad (revisado en 1, 2). En particular, la retina neural es una parte accesible del sistema nervioso central. La retina se presta a realizar fácilmente estudios de la neurogénesis debido a su muy organizado, sin embargo, la estructura relativamente simple, y sus tipos de neuronas altamente conservadas a través de especies de vertebrados 3. Dinámica de comportamientos celulares t....
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Protocolo
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las disposiciones del Código de Australia Consejo de Investigación Médica Nacional de Salud y de la práctica para el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por los comités de ética institucionales.
1. Preparación de Pez cebra
- apareamiento de los peces adultos
- Creó los peces adultos en forma de pares (o dos pares) en los tanques de cría de tamaño adecuado la noche antes de su uso.
- Para mantener la hembra separada del macho, utilice un divisor para permitir a los peces para ver, pero no se tocan entre sí.
- Por la mañana, después de encend....
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Resultados
Este trabajo presenta un protocolo experimental para evaluar los cambios en el gen de expresión cuando la sincronización de tipo salvaje retina progenitores desarrollan dentro de un embrión de acogida morphant. Los embriones de acogida experimentales son morphants Ptf1a, que carecen de las interneuronas horizontales y amacrinas nacidos intermedios de la retina 7, 26. Éstos se han comparado con el control de los embriones de acogi.......
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Discusión
La comprensión de la medida en que las células vecinas influencia de sincronización de la expresión de factores que determinan el destino celular crucial es esencial cuando el objetivo de instruir eficazmente células madre multipotentes embrionarias o inducidas a diferenciarse en un tipo de célula post-mitótico específico o incluso tejido patrón. Además, el examen de estos eventos moleculares en las células en desarrollo del animal vivo, además, proporciona dinámica relevante información (temporal y espacial) en los con.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por un arco DECRA a PRJ (DE120101311) y por una beca de investigación Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) a LP (PO 1440 / 1-1). El australiano Instituto de Medicina Regenerativa es apoyado por fondos del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno Federal de Australia. Reconocemos el Dr. Jeremy Ng Chi Kei, que llevó a cabo los experimentos descritos aquí como se publicó en Kei et al. , 2016. Agradecemos disposiciones de peces transgénicos desde el Prof. Higashijima y gracias a los profesores. Turner y Rupp para la prestación del pCS2 + plásmido y el Dr. Wilkinson para generar H2B-RFP y H2A-GFP construcciones. Agradecemos a person....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Los platos recubiertos de agarosa se pueden preparar unos días antes, sellar con parafilm para evitar el secado y almacenar a 4 ° C |
| Agarosa de bajo punto fundido | Sigma | A9414-100G | Se puede preparar en un volumen más grande, calentar en el microondas para licuar y luego mantener fundido en un 40 ° C Baño de agua. Se pueden preparar alícuotas de 1 mL (una por cada grupo de embriones montados). |
| tubo capilar de vidrio de borosilicato sin filamento | SDR Scientfic | 30-0035 | se pueden utilizar alternativas con diámetro similar |
| tubo capilar de vidrio de borosilicato con filamento | SDR Scientfic | 30-0038 | se pueden utilizar alternativas con diámetro similar |
| placas de Petri de vidrio (60 mm de diámetro) | Science Supply | 1070506 | cualquier alternativa de vidrio de cualquier tamaño |
| Tubo de inyección (2 m) | Eppendorf | 524616004 | Esto conecta el soporte de la aguja a la jeringa durante el trasplante |
| Molde de microinyección (molde de plástico con protuberancias en forma de cuña) | Herramientas de ciencia adaptativa | PT-1 | con forma similar |
| soporte | Narishige | M-152 | cualquier alternativa que se ajuste al diámetro exterior de las agujas de inyección se puede utilizar |
| microinyector | Narishige o Eppendorf Femtojet | Inyector neumático mediante | |
| micromanipulador | Coherent Scientific | M330IR | alternativas similares se pueden utilizar |
| punta de microcargador | Eppendorf | 5242956003 | |
| Extractor | Sigma | M5904-500ML | |
| Sutter Instruments | Modelo P-2000 | Los ajustes utilizados para este extractor son: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Se puede utilizar cualquier extractor de agujas si resulta en una dimensión de punta adecuada | |
| Parafilm | Interpath | PM996 | cualquier película de parafina |
| Pipeta Pasteur de plástico | Samco | Scientific 202 | |
| Pasteur pipeta de vidrio | Hirschmann Laborgeraete | 9260101 | |
| Pronase | Sigma | P5942-25MG | La proteasa tipo XIV |
| N-feniltiourea | Sigma | P7629-25G | PTU es tóxica y se puede preparar como una solución madre para evitar la exposición frecuente al polvo, consulte la MSDS antes de comprar / usar. |
| Extracción de gel Qiaquick | Qiagen | 28704 | se pueden usar cualquier alternativa para purificar el ADN |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | se pueden usar cualquier alternativa para purificar el ARN |
| SP6 mMessage kit | Qiagen | AM1340 | cualquier alternativa para transcribir el ADN usando SP6 |
Referencias
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO pra....
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Reimpresiones y permisos
