Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Christiane Grimm; Johannes Vierock; Peter Hegemann; Jonas Wietek

doi:10.3791/55497

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

17.3K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/55497

⸱

22 de mayo de 2017

Christiane Grimm^*¹ , Johannes Vierock^*¹ , Peter Hegemann¹ , Jonas Wietek¹

¹Experimental Biophysics, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo describe cómo se determina la selectividad iónica de la canalrodopsina con registros electrofisiológicos de patch-clamp de células completas utilizando células HEK293. Aquí, se demuestra el procedimiento experimental para investigar la selectividad del cloruro de una canalrodopsina selectiva de aniones. Sin embargo, el procedimiento es transferible a otras rodopsinas de clara selectividad.

Resumen

Durante la última década, los channelrhodopsins se hicieron indispensables en la investigación neurocientífica donde se utilizan como herramientas para manipular de manera no invasiva procesos eléctricos en células diana. En este contexto, la selectividad iónica de una canalrhodopsina es de particular importancia. En este artículo se describe la investigación de la selectividad del cloruro para una canalrhodopsina de Proteomonas sulcata conductora de aniones recientemente identificada mediante grabaciones electrofisiológicas de la placa de sujeción en células HEK293. El procedimiento experimental para la medición de fotocorrientes de luz-gated requiere una fuente de luz conmutable rápida - idealmente monocromática - acoplada en el microscopio de una instalación de parche-abrazadera de otro modo convencional. Se describen los procedimientos preparativos previos al experimento que incluyen la preparación de soluciones tamponadas, consideraciones sobre los potenciales de unión de lıquidos, siembra y transfección de células y extracción de las pipetas de parche. La grabación real de la relación tensión-corrienteS para determinar los potenciales de inversión para diferentes concentraciones de cloruro se produce 24 h a 48 h después de la transfección. Por último, los datos electrofisiológicos se analizan con respecto a las consideraciones teóricas de la conducción de cloruro.

Introducción

Channelrhodopsins (ChR) son canales de iones ligeros que se producen en el ojo de las algas verdes móviles, y sirven como fotosensores primarios para fototaxis y respuestas fóbicas [ ^1] . Desde su primera descripción en 2002 [ ^2] , ChRs han allanado el camino para el campo emergente de la optogenética y se puede aplicar en una variedad de células excitables, por ejemplo, dentro de los músculos esqueléticos, el corazón o el cerebro [ ³ ^, ⁴ ^, ^5] . La expresión de ChRs en células diana da como resultado la permeabilidad i....