Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.
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Artículo de método
Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteínas quinasas son capaces de gobernar a gran escala los cambios celulares en respuesta a complejas matrices de estímulos, y mucho esfuerzo se ha dirigido a descubrir los detalles alostéricos de su regulación. Las quinasas comprenden redes de señalización cuyos defectos son a menudo características de múltiples formas de cáncer y enfermedades relacionadas, haciendo que una plataforma de ensayo sea susceptible de manipulación de factores reguladores aguas arriba y validación de requerimientos de reacción críticos en la búsqueda de terapias mejoradas. Aquí, describimos un ensayo de quinasa básico que se puede adaptar fácilmente para adaptarse a preguntas experimentales específicas incluyendo, pero sin limitarse a, ensayar los efectos de agentes bioquímicos y farmacológicos, manipulaciones genéticas tales como mutación y deleción, así como condiciones de cultivo celular y tratamientos para investigar Mecanismos de señalización celular. Este ensayo utiliza [γ-32P] ATP radiomarcado, que permite comparaciones cuantitativas y visualización clara de los resultados, y puede ser modPara uso con quinasa inmunoprecipitada o recombinante, sustratos específicos o tipificados, en una amplia gama de condiciones de reacción.
Introducción
Las proteínas quinasas son sofisticadas enzimas críticas para la transmisión de señales celulares en respuestas apropiadas 1 . Dado su papel en el mantenimiento de la homeostasis y la prevención o promoción de estados de enfermedad [ 2] , los métodos bioquímicos para evaluar la actividad quinasa siguen siendo herramientas poderosas para delinear los detalles de la señalización eucariótica [ 3] . Aunque las estrategias que utilizan anticuerpos fosfo-específicos han sido altamente informativas en términos de medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento en el estado de señalización cel....
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Protocolo
1. Recursos de purificación de quinasa y tubería general de inmunoprecipitación
NOTA: Las quinasas para uso con este ensayo pueden obtenerse a partir de inmunoprecipitados de células cultivadas o por medios recombinantes tales como la purificación marcada por afinidad 6 . A continuación se muestra un protocolo general para la inmunoprecipitación marcada con bandera que puede tener que ser modificada dependiendo de la quinasa de interés. Todo debe mantenerse en hielo cuando sea posible.
- Añadir 2 μl de anticuerpo de 1 mg / ml a 200 μl de lisados celulares (generalmente ~ 1 mg / ml de concentración de pro....
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Resultados
WNK1 IP quinasa ensayos
La WNK1 marcada con Myc se transfectó en células HEK293 y se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-Myc [ 11] . El inmunoprecipitado mostró actividad quinasa hacia el sustrato modelo MBP así como hacia sí mismo ( Figura 1A ). WNK1 mutantes fueron luego probados para la actividad quinasa hacia MBP por el mismo método, esta vez empleando GST marcado construcciones ( <.......
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Discusión
Las quinasas son una familia diversa de proteínas que han desarrollado una amplia funcionalidad en numerosos contextos, y los ensayos de quinasa han sido increíblemente útiles en el estudio de varias proteínas de señalización y han contribuido en gran medida a nuestra comprensión actual de la comunicación celular. En particular, se utilizó el mismo ensayo básico para caracterizar dos cinasas dispares a pesar de diferencias importantes en estructura y actividad. WNK1 contiene una bolsa catalítica atípica donde la lisina .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a todos los miembros actuales y antiguos del laboratorio de Cobb por trabajos valiosos y discusiones, y Dionne Ware por asistencia administrativa. Estos estudios fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud Grant R37 DK34128 y Welch Foundation Grant I1243 a MHC
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Proteína A Sefarorosa CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| Radiomarcado [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 | |
| Blindaje radiactivo | Research Products International | BR-006 | |
| R-250 colorante (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 | |
| Whatman Papel de filtro cualitativo de grado 3 | Whatman | 1003-917 | |
| Secador de vacío de gel | Slab Bio-Rad | Modelo 583 Secador de gel #1651745 | |
| Marcador de radiofrecuencia | Agilent Technologies | 420201 | |
| Regla fosforescente | Sigma Aldrich | R8133 | |
| Puntos fosforescentes | Sigma Aldrich | L5149 | |
| Contador Geiger | Ludlum | Model 3 con detector | |
| BioMax Cassette 8 x 10" | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax Película MS 8" x 10" | Carestream Health | 829 4985 | |
| BioMax MS Pantalla intensificadora 8" x 10" | Carestream Health | 851 8706 | |
| Procesador de película médica/de rayos X | Konica Minolta | SRX-101A | |
| Viales de centelleo | Research Products International | 125500 | |
| Fluido de centelleo | MP Biomedicals | 188245305 | |
| Beckman LS 6500 Contador de centelleo | Beckman | LS 6500 |
Referencias
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4....
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Reimpresiones y permisos
