El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Resumen

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

Resumen

El pez cebra, introducido por primera vez como un modelo de desarrollo, han ganado popularidad en muchos otros campos. La facilidad de la cría de un gran número de organismos que se desarrollan rápidamente, combinada con la claridad óptica embrionario, sirvió como atributos de peso iniciales de este modelo. Durante las últimas dos décadas, el éxito de este modelo ha sido impulsado además por su susceptibilidad a las pantallas de mutagénesis a gran escala y por la facilidad de transgénesis. Más recientemente, los enfoques de edición gen haber aumentado la potencia del modelo.

Para los estudios del desarrollo neurológico, el embrión de pez cebra y larva proporcionan un modelo al que se pueden aplicar varios métodos. Aquí, nos centramos en los métodos que permiten el estudio de una propiedad esencial de las neuronas, excitabilidad eléctrica. Nuestra preparación para el estudio electrofisiológico de neuronas de la médula de pez cebra implica el uso de pegamento veterinario de sutura para asegurar la preparación de una cámara de registro. Los métodos alternativos para la grabacióna partir de embriones de pez cebra y larvas implicar la unión de la preparación a la cámara utilizando un alfiler fino de tungsteno ^{1, 2, 3, 4, 5.} Un pasador de tungsteno es la más utilizada para montar la preparación en una orientación lateral, aunque se ha usado para montar larvas dorsal del lado hasta ^4. El pegamento de sutura se ha usado para montar embriones y larvas en ambas orientaciones. Usando el pegamento, una disección mínima se puede realizar, permitiendo el acceso a las neuronas espinales sin el uso de un tratamiento enzimático, evitando así cualquier daño resultante. Sin embargo, para las larvas, es necesario aplicar un tratamiento enzimático breve para eliminar el tejido muscular que rodea la médula espinal. Los métodos descritos aquí se han utilizado para estudiar las propiedades eléctricas intrínsecas de las neuronas motoras, interneuronas, y las neuronas sensoriales en varios developmental etapas ^{6, 7, 8, 9.}

Introducción

George Streisinger fue pionera en el uso de Danio rerio, conocido comúnmente como el pez cebra, como un sistema modelo para el análisis genético de desarrollo de los vertebrados ^10. El modelo ofrece varias ventajas, incluyendo: (1) relativamente simple y barato cría de animales; (2) fertilización externa, lo que permite un fácil acceso a los embriones de las etapas de desarrollo más tempranas; y (3) un embrión transparente, permitiendo la observación directa y repetidas de células, tejidos y órganos, ya que forman.

En las décadas siguientes, varios avances aumentaron aún más el poder del modelo de pe....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso (IACUC; Oficina de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus).

1. El pez cebra Cría

1. Elevar y mantener adultos de pez cebra (Danio rerio) a 28,5 ° C en un ciclo de luz h 10 h de oscuridad / 14 y con el tratamiento de agua adecuado y el intercambio ^52.
2. Elevar el pez cebra embriones / larvas a 28,5 ° C en medio de embrión hasta que alcanzan la etapa deseada (por ejemplo, 2 dpf).

2. Preparación de la d....

Resultados

Hemos registrado con éxito de las neuronas Rohon-barba en 17 hpf embriones a través de 7 dpf larvas (Figura 5A y 5B). Cuando se registraron células Rohon-barba, la preparación se monta en el lado dorsal hacia arriba. Dicho montaje permite la identificación inequívoca de células Rohon-Barba sobre la base de sus posiciones dorsal superficial y grandes tamaños soma. La identificación se confirmó adicionalmente por el potencial de membrana en reposo hiperpol.......

Discusión

Los métodos descritos aquí permiten la caracterización eléctrica y morfológica de las neuronas sensoriales y motoras de embriones de pez cebra después de la disección mínima de la médula espinal. Las neuronas permanecen sanos durante al menos 1 h, el límite de tiempo impuesto en estas grabaciones. Las neuronas han sido registrados utilizando la configuración de célula completa estándar, así como de parches nucleadas; el último método minimiza los problemas de espacio-clamp que se opone a que un estudio biofísico detalla.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de vacío/Botella de almacenamiento, 0,22 mm poro	Corning	431096
Filtro de jeringa 0,2 mm	Whatman	6780-2502
Tricaine	Sigma	A-5040	Etilo 3-aminobenzoato sal de metanosulfonato
α-bugarotoxina	Tocris	11032-79-4
Tetrodotoxina	Tocris	4368-28-9
Alexa-549 sal de hidracina	Sondas moleculares	A-10438	colorante fluorescente
Spin-X filtro de tubo de centrífuga	Corning	8161
Portaobjetos de vidrio Fisher		12-550C
Sylgard silicona kit de elastómero	Dow Corning	184	elastómero de silicona
Placas de Petri	Falcon	351029
Capilares de vidrio de borosilicato	Harvard Apparatus	30-0038	diámetros interior y exterior de 0,78 y 1,0 mm (capilares de vidrio de pared delgada)Capilares de
vidrio de borosilicato	Drummond Scientific	1-000-1000-100	diámetros interior y exterior de 1,13 y 1,55 mm (capilares de vidrio de pared gruesa)
Accesorio de polipropileno de púas en miniatura	Cole-Palmer	6365-90
Vetbond adhesivo tisular	3M	1469SB
Collagenase XI	Sigma	C7657
Extractor de microelectrodos	Sutter Instruments	Modelo P-97
Amplificador	Molecular Devices	Axopatch 200B
Head	stage Molecular Devices	CV203BU
Micromanipulador motorizado	Sutter Instruments	MP-285
Tygon tubing	Fisher	14-169-1B	ID 1/16 IN, OD 1/8 IN y WALL 1/32 IN (tubo de laboratorio flexible)
Portaelectrodos	Molecular Devices	1-HC-U
Pharmaseal Llaves de paso de tres vías	Baxter	K75
Digitalizador	Axon Instruments	Digidata 1440A
Microscopio invertido	Zeiss	Axioskop2 FS plus
40X/0.80W Achroplan objetivo	Zeiss Software de
adquisición y análisis de datos	Axon Instruments		PClamp 10 - Clampex y Clampfit
Extractor de micropipetas	Sutter Instruments	Modelo P-97
Nombre	Compañía	Número de catálogo	Comments
Soluciones de disección y grabación (en mM)
Todas las soluciones, excepto la intracelular, son estables durante ~2-3 meses cuando se filtran (tazas de filtro de 0,22 mm) y se almacenan a temperatura ambiente (RT).
La solución intracelular se filtra (filtros de jeringa de 0,2 mm) y se almacena congelada (-20 ° C) en pequeñas alícuotas que se descongelan individualmente el día de su uso.
Disección/Timbre' s solución			145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (con NaOH)
Pipeta (intracelular) solución			135 KCl, 10 EGTA-ácido, 10 HEPES; pH 7,4 (con KOH).
Baño (extracelular) de solución de registro/voltaje y pinza amperimétrica			125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (con NaOH).
Alexa-594 solución de stock de sal de hidracina.			Prepare un stock de 13,2 mM en ddH2O, alícuota (~100 µ l) y almacenar a -20 °C. Para su uso, diluya la solución madre 132 veces con la solución de pipeta hasta una concentración final de 100 mM. Después de la dilución, filtre la solución de pipeta que contiene Alexa-594   con un filtro de tubo de centrífuga.
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Agentes inmovilizadores
0.4% de etil, 3-aminobenzoato, sal de metanosulfonato (Tricaine)			Prepare una solución madre al 0,4% en 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Tricaína/100 mL 0,2 M Tris
Ajuste el pH a 7 con NaOH y almacene a -20 °C.
Para su uso, diluya la solución madre ~25 veces en medios embrionarios
250 mM α-bungarotoxina			Prepare un caldo de 250 mM en ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µ L alícuotas, y sotre a -20 °C.
Para su uso, diluir 2.500 veces con solución extracelular hasta una concentración final de 100 nM.
1 mM Tetrodotoxina			Prepare un caldo de 1 mM en ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µ L alícuotas, y sotre a -20 °C.
Para su uso, diluir 2.000 veces con solución extracelular hasta una concentración final de 500 nM.

de registro