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Artículo de método

In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

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DOI:

10.3791/55510

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12 de agosto de 2017

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1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.

Resumen

La principal preocupación en el trasplante es lograr tolerancia específica a través de la inducción de células reguladoras. La comprensión de los mecanismos de tolerancia requiere modelos confiables. Aquí, describimos los modelos de la tolerancia al aloinjerto cardiaco de rata, inducido por el bloqueo de señales de coestimulación o upregulation de moléculas inmunorreguladoras a través de la transferencia de genes. Cada uno de estos modelos permite en vivo la generación de células reguladoras como las células T reguladoras (Tregs), las células B reguladoras (Bregs) o células mieloides reglamentarias (RegMCs). En este manuscrito, Describimos dos protocolos complementarios que se han utilizado para identificar y definir la actividad reguladora celular in vitro e in vivo para determinar su responsabilidad en la inducción de la tolerancia y mantenimiento. En primer lugar, un ensayo represivo en vitro permite la identificación rápida de las células con capacidad supresora de la respuesta inmune efectora una manera dosis dependiente y puede ser utilizado para otros análisis como medición de citocinas o citotoxicidad. En segundo lugar, la transferencia adoptiva de células desde un recipiente tratado tolerante a un destinatario injertado recién irradiado, destacó las propiedades tolerogénicas de estas células en el control de las respuestas inmunes del injerto dirigida o conversión (nuevo) las células reguladoras había llamado tolerancia infecciosa). Estos métodos no están restringidos a las células con marcadores fenotípicos conocidos y pueden ser extendidos a cualquier población de la célula. Además, donante dirigido allospecificity de células reguladoras (una meta importante en el campo) puede evaluarse mediante el uso de células de donante tercero o injerto in vitro o en vivo. Finalmente, para determinar la capacidad de tolerogénicas específicos de estas células reguladoras, le ofrecemos protocolos para evaluar las respuestas de anticuerpos humorales de anti- donantes y la capacidad del destinatario para desarrollar la respuesta humoral contra antígenos conocidos nuevo o antiguo. Los modelos de tolerancia descrito pueden ser utilizados para caracterizar las células reguladoras, para identificar nuevos biomarcadores y moléculas inmunoreguladoras y son adaptables a otros modelos de trasplante o enfermedades autoinmunes en roedores o humanos.

Introducción

Aloinjerto cardiaco de rata es un modelo de trasplante de órgano confiable para evaluar tratamientos de inducción de tolerancia, para descifrar los mecanismos de inducción de la tolerancia y el mantenimiento y tiene el potencial para inducir las células reguladoras funcionalmente competentes y dominantes. Los protocolos a continuación describen un completamente desajuste heterotópico cardíaco injerto de una rata de donantes de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) en una rata de receptores 1A de Lewis (LEW.1A, RT1una). En esta combinación de injerto, el rechazo agudo se produce rápidamente (en cerca de 7 días) y puede evaluarse fácilmente por injerto a medida a través de la palpación del abdomen. Aquí proponemos tres protocolos para inducir la tolerancia para el aloinjerto cardiaco de rata. En estos modelos, tolerancia es inducida o mantenida por tipos de células reguladoras diferentes. En primer lugar, el bloqueo de la interacción CD40-CD40L con un adenovirus codificación CD40Ig (AdCD40Ig) inducida por la generación de CD8+ Tregs capaces de inducir tolerancia cuando eventualmente transferido a recipientes injertada secundaria1. Además, el agotamiento de CD8 células+ (con anticuerpos anti-CD8α) en los receptores tratados con AdCD40Ig generados Bregs y RegMCs2. Análisis profundo de CD8+ Tregs propiedades destacan el papel clave de varias moléculas inmunoreguladoras definidas como interleucina-34 (IL-34) y Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Mientras que la sobreexpresión de IL-34 (con un vector AAV) inducida por Tregs a través de la generación de RegMCs, la sobreexpresión de FGL-2 inducida por Bregs, subyacente a la compleja red de células reguladoras.

Porque rechazo crónico se desarrolla lentamente y es a largo plazo, un análisis en profundidad es necesaria para distinguir la tolerancia frente a rechazo crónico. Injerto generalmente se evalúa por la infiltración celular, fibrosis, engrosamiento de la deposición de C4d vascular de la pared y complemento por immunohistology7. Mientras que la histología métodos requieren el sacrificio de animales o biopsia de injerto, aquí describimos un método simple para evaluar diversas características de aloinjerto tolerado: la aparición y función de las células reguladoras y las respuestas de anticuerpos específicos anti-donantes de sangre muestra mediante citometría de flujo (aquí hemos utilizado celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación).

Mantenimiento de la tolerancia a los aloinjertos tras detención del tratamiento es generalmente asociado con la inducción de células reguladoras8. En las últimas décadas, los estudios se centraron en CD4+Tregs caracterizado por unanimidad ellos por los principales marcadores Foxp3+,altade CD25 y CD127–9,10,11. Del mismo modo, varios marcadores fueron atribuidos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28-, CD45RCbaja, PD1+y Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre los años, la expresión de GITR, CTLA4 y citocinas (IL-10, TGFβ, IL-34, 35 IL, FGL-2) se asocian además a un Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. Sin embargo, nuevas poblaciones de células reguladoras, como Bregs, RegMCs, NKTregs, carecen de marcadores específicos pertinentes. De hecho, Bregs divulgan sobre todo como inmaduros CD24+ de las células, con la expresión ambigua de CD27 y a veces la producción de IL-10 y TGFβ granzima B22,23,24. La complejidad del linaje celular mieloide requiere una combinación de varios marcadores para definir su perfil regulatorio o proinflamatorias tales como el CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a o CD16325,26. Por último, se han divulgado algunos marcadores para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, pero más estudios son necesarios más fenotípicamente describirlos27,28,29 ,30,31,32. Por lo tanto, se requieren evidencias de actividad supresora legitimar aún más la descripción fenotípica para la identificación de nuevos biomarcadores, nuevos mediadores inmunoreguladoras y ampliar el alcance a nuevas terapias con células madre.

Proponemos dos métodos complementarios para evaluar la actividad supresora de las células. En primer lugar, el método en vitro consta de prevencion células con células de etiqueta efectoras T estimuladas por antígenos alogénicos de donante que presenta las células (APCs) en diferentes proporciones durante 6 días de cultivo, y analizando el efector proliferación de la célula de T que refleja supresión inmune dirigida por el donante. Las células procedentes de ratas tratadas pueden compararse directamente a las células ingenuas ratas y ratas injertadas no tratadas para la actividad represiva (o a cualquier otra población de células reguladoras), en una gama de cocientes del supresor: efector. Además, este método no requiere ningún trasplante, y se obtienen resultados dentro de 6 días. En segundo lugar, el método en vivo consiste en transferir las células reguladoras previstas de una rata tratada a un destinatario injertado recién irradiado. Mientras que las células B, células mieloides o T las células de las ratas no tratadas ingenuo generalmente no para inhibir el rechazo agudo y prolongar la supervivencia del injerto a transferencia adoptiva, las células con actividad supresora potenciada de receptores tratados tienen estos atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia inducida por la irradiación del destinatario se recomienda permitir eventualmente transferidas células siguen siendo inafectadas por la homeostasis de la sangre y dominar más fácilmente las respuestas inmunes de los donantes. Para ambos métodos, la utilización en vitro de allogeneic de terceros APC o en vivo la transferencia adoptiva de prevencion las células en los receptores injertados con un corazón de terceros permiten análisis de la especificidad de los donante. Considerando que el método en vivo requiere un número considerable de células, poco representado las subpoblaciones de células pueden evaluarse más fácilmente actividad supresora en vitro33.

Respuesta humoral también puede ser medido para evaluar el estado de la tolerancia y el control de las respuestas de anticuerpos dirigidos a los antígenos del donante. De hecho, la tolerancia se caracteriza por la ausencia de la respuesta humoral hacia el donante sino la conservación de la capacidad de los beneficiarios a desarrollar la respuesta humoral a antígenos nuevos y preservación de las respuestas de memoria. En primer lugar, el principio de la detección del aloanticuerpo se basa en el reconocimiento de las células del donante por receptores anticuerpos tras incubación del tipo de la célula donante con el suero del receptor injertado. Segunda respuestas humorales a antígenos exógenos pueden ser evaluados después del estímulo de receptores tolerantes a largo plazo con hemocianina de Lapa de ojo de la cerradura (KLH) emulsionado con completa adyuvante de Freund de. La presencia de anticuerpos IgM e IgG específicos contra los antígenos puede detectarse los días 4 y 13, respectivamente, después de la inmunización, con ensayo de inmunosorbente vinculado enzima (ELISA)34. En tercer lugar, la preservación de la respuesta inmune de memoria puede ser evaluada por la inyección de xenogeneicos de glóbulos rojos (gr) a -7 y + 3 días del trasplante y la tinción con destinatario suero de recolectadas en días + 8 y + 17 después del trasplante de glóbulos rojos. Todos estos métodos permiten la identificación de subtipos de inmunoglobulinas mediante anticuerpos específicos de la secundarios y adquisición rápida de los resultados en menos de 1,5 h por la FACS coloración o unas horas por ELISA.

Finalmente, estos protocolos están diseñados para la caracterización de los modelos de trasplante y pueden ser, en cierta medida, aplicada a los modelos de enfermedad autoinmune. Los principios del método pueden transponerse a todas las especies.

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Protocolo

Nota: Todos los protocolos han sido aprobados por un Comité de ética y deben realizarse de forma estéril.

1 generación de tolerancia en un modelo de aloinjerto cardiaco de rata

  1. Lew.1W LEW.1A procedimiento de aloinjerto
    1. Anestesiar un varón donante LEW.1W rata mediante inhalación isoflurane-O2 , suplida con 1% N2O después de 5 minutos lugar el animal en decúbito dorsal y desinfecta el abdomen con betadine para llevar a cabo una toracotomía (es decir, incisión en el espacio pleural del tórax).
      1. El inferior y superior venas cavas del agujero de la abrazadera, les ligadura y cortarlas. Luego la arteria pulmonar y la aorta y salvar el injerto en frío 0,9% NaCl.
    2. Anestesiar una 250 g masculino LEW.1A receptor rata (de 8 a 12 semanas) con inhalación isoflurane-O2 , suplementada con 1% N2O después de 5 minutos colocar el animal en decúbito dorsal y desinfecta el abdomen con betadine para llevar a cabo una laparotomía xyphopubic (es decir, incisión grande del proceso xifoides a la sínfisis del pubis).
      1. Extraer los intestinos, los vasos sanguíneos abdominales de la abrazadera, realizar una anastomosis termino-lateral (es decir, conexión entre el extremo de un canal y la pared del otro) entre la aorta del injerto y la aorta abdominal y la pulmonar arteria y abdominal de la vena cava y retire las abrazaderas.
    3. Suturar el plano muscular y la piel y desinfectar con betadine.
    4. Inyectar este medicamento (analgésico) 6 mg/kg por vía subcutánea (s.c.) y oxitetraciclina (antibiótico) por vía intramuscular (i.m.) y colocar al animal bajo una lámpara de calor hasta que el animal se despierta. Inyección i.m. (50 μg/kg) de buprenorfina (opioides) y meloxicam (droga antiinflamatoria nonsteroidal) (0,3 mg/kg) s.c. el día del trasplante y un día después.
  2. Inducción de tolerancia por el bloqueo de las interacciones coestimuladoras
    1. Siga los pasos 1.1.1. a 1.1.2.
    2. En una zona clasificada de A2 de la instalación animal, diluir 2 x 1010 partículas infecciosas de AdCD40Ig (un adenovirus codificación CD40Ig, una molécula quimérica que bloquea la interacción CD40-CD40L) en solución de lactato de Ringer para llegar a un volumen final de 150 μL e inyectar en 3 puntos (3 x 50 μL) de la pared ventricular del ápice del injerto.
    3. Siga los pasos de 1.1.3 a 1.1.4.
      Nota: AdCD40Ig tratamiento puede asociarse con anti-CD8α anti-ICOS y anti-CD28 anticuerpo inyecciones2,35,36.
  3. Inducción de tolerancia por la sobreexpresión de una proteína recombinante
    1. Diluir 1 x 1012 viral genoma de rata AAV recombinante IL34 en solución de lactato de Ringer para llegar a un volumen final de 100 μl. anestesiar una rata LEW.1A de 150 g con inhalación isoflurano O2 e inyectar por vía intravenosa (i.v.) en la vena del pene.
    2. Un mes después de la inyección de IL34 AAV, realizar un injerto LEW.1W en el LEW.1A receptor según protocolo 1.1.

2. evaluación in Vitro de actividad supresora de las células por reacciones mixtas de linfocitos (MLRs)

Nota: Actividad supresora de las células de las ratas tolerantes a tratados debe ser comparado con la población equivalente de destinatarios injertados syngeneic o ratas de ingenuo.

  1. Aislamiento de allogeneic APC: células dendríticas de plasmacytoid (PDC)
    1. Anestesiar el macho LEW.1W ingenuo donantes rata mediante inhalación isoflurane-O2 , suplementada con 1% N2O después de 5 minutos colocar el animal en decúbito dorsal y desinfecta el abdomen con betadine para realizar una esplenectomía. Extirpar el bazo por transecting los vasos, excepto el bazo en frío 1 X solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el animal de la sutura.
    2. Transferencia del bazo en un plato, quitar 1 X PBS y perfusión con 5 mL de 0.2% colagenasa D. Para mejorar la digestión de la enzima, corte del bazo en pequeños trozos e incubar 15 min a 37 ° C.
    3. Agregar 500 μl de 0,1 M ácido etilendiaminotetracético (EDTA), transfiera las piezas de bazo en un colador y aplastar el bazo con el émbolo de una jeringa para disociar las células. Transferir a un tubo y las células con 15 mL de 1 X PBS. Centrifugar 10 min a 430 x g. eliminar el sobrenadante.
    4. Para eliminar los glóbulos rojos y plaquetas, Resuspender el precipitado de splenocyte en una solución hipotónica 10 mL e incubar 5 min a temperatura ambiente (RT). Lave con 1 X PBS y centrifugar 10 min a 190 x g. descartar el sobrenadante.
    5. Quitar las fibras de colágeno por filtración en un filtro de tejido 100 μm. Contar las celdas para ajustar la concentración celular de 5 x 107 células/mL en suero de ternera fetal de 1 X PBS/2% (FCS) / 0,5 mM EDTA.
      Nota: El número de esplenocitos debe ser entre 4 x 108 y 7 x 108 células.
    6. Enriquecer las células de interés por selección negativa antes de la clasificación de la célula. Incubar 15 min a 4 ° C con 2 μg/mL purificada anticuerpos específicos contra las células T (anti-TCRαβ, R7/3 clon y anti-TCRγδ, V65 clon), las células de B (anti-CD45RA, clon de OX33) y las células NK (anti CD161, 3.2.3 clon), lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y centrifugar 10 min a 430 x g . Deseche el sobrenadante.
    7. Lave con granos magnéticos 3 veces con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Uso de 3,5 μl granos/106 esplenocitos, lavar añadiendo 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, lugar para 1 minuto en el imán y descarte el sobrenadante. Repetir dos veces. Resuspender los granos en 10 volúmenes de 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA (por ejemplo, 35 granos μl se diluye en 350 μl X PBS/2% FCS/0,5 1 mM EDTA).
    8. Eliminar las células no deseadas por los esplenocitos de mezcla con los granos magnéticos durante 10 min a 4 ° C bajo agitación, coloque el tubo en el imán durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Repetir dos veces. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: El número de esplenocitos enriquecido debe estar comprendida entre 5 x 107 y 9 x 107.
    9. Mancha las células usando anticuerpos marcados para más selección de PDC: excluir las células de T restantes (anti-TCRαβ, clon de R7/3) o las células de B (anti-CD45RA, OX33 clon) y tipo CD4+ (anti-CD4, clon OX35) CD45R+ las células (anti-CD45R, clon de His24). Abalorios de etiqueta con cada Ab a establecer una matriz de compensación en FACS. Incubar 15 min a 4 ° C y lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Resuspender las células a una concentración de 5 x 107 células/mL, filtro en un filtro de tejido 60 μm y las células muertas de la etiqueta mediante la adición de DAPI a una concentración final de 0.1 μg/mL. Ordenar las células con un clasificador de células 70 μm boquilla, por compuerta en DAPI––del TCR CD45RA–CD4+CD45R+ como se muestra en la figura 1.
  2. Aislamiento de células efectoras T de respuesta (CD4 + CD25 células de T de – )
    1. Cosecha el bazo de una rata LEW.1A no tratadas no injertadas ingenuo y guardar en frío 1 X PBS.
    2. Transferencia del bazo en un tamiz que se coloca en un plato y añadir 10 mL de 1 X PBS. Aplastar el bazo con el émbolo de una jeringa para disociar las células. Transferencia de las células en un tubo de 50 mL, lave con 1 X PBS y centrifugar 10 min a x 430 g. descartar el sobrenadante.
    3. Para eliminar los glóbulos rojos y plaquetas, Resuspender el precipitado de splenocyte en 10 mL de solución hipotónica durante 5 min a temperatura ambiente, luego lavar de 1 X PBS y centrifugar a 10 min x 190 g. eliminar el sobrenadante.
    4. Quitar las fibras de colágeno por filtración en un filtro de tejido 100 μm. Contar las celdas para ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: El número de esplenocitos debe ser entre 3 x 108 y 5 x 108 células.
    5. Enriquecer las células de interés antes de la clasificación. Incubar 15 min a 4 ° C con 2 μg/mL purificada anticuerpos específicos a las células CD8 (anti-CD8α, OX8 clon), las células de B (anti-CD45RA, clon de OX33), las células NK (anti CD161, 3.2.3 clon), las células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clon), gamma delta T células (anti-TCRγδ, V65 clon). Luego lavar con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y centrifugar 10 min a 430 x g. eliminar el sobrenadante.
      Nota: Para ordenar los CD8 natural+ Tregs de ingenuo ratas al mismo tiempo como CD4+ células efectoras T, no añadir anti-CD8α Ab durante el agotamiento.
    6. Lavar los granos magnéticos 3 veces con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA como se describe en el paso 2.1.7.
    7. Quitar las células indeseadas por esplenocitos de mezcla con los granos magnéticos durante 10 min a 4 ° C bajo agitación, luego coloque el tubo en el imán durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Repetir dos veces. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: El número de esplenocitos debe estar comprendida entre 5 x 107 y 8 x 107 células.
    8. Añadir anticuerpos etiquetados a tipo CD4+CD25 células de T de– : anti-TCRαβ (R7/3 clon), anti CD4 (OX35 clon), anti-CD25 (OX39 clone) e incubar 15 min a 4 ° C. Al mismo tiempo ordenar CD8+CD45RCbaja Tregs, añadir anti-CD45RC Ab (OX22 clone). Etiqueta de granos con cada Ab para crear una matriz de compensación para su posterior procesamiento por citometría de flujo. Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y descarte el sobrenadante.
    9. Resuspender las células 5 x 107 células/mL, filtro en un filtro de tejido 60 μm y las células muertas de la etiqueta mediante la adición de DAPI a una concentración final de 0.1 μg/mL. Ordenar las células con un clasificador de células 70 μm boquilla por compuerta en el TCR de DAPI –+CD4+CD25– las células como las células de la respuesta (y si es necesario TCR DAPI –+CD4–CD45RCbaja como CD8+ Las represivas células Tregs) como se muestra en la figura 2.
  3. Aislamiento de células PREVENCION
    Nota: Divida el bazo en dos alícuotas: ordenar una de las células B, células mieloides y las células NK y la otra en CD4+ y CD8 células+ CD45RCbaja T, para evaluar su función supresora.
    Nota: Para la transferencia adoptiva de células, guardar 1 x 108 esplenocitos para servir como control positivo de tolerancia por transferencia adoptiva, si es necesario.
    1. Clasificación de las células B, células mieloides y las células NK
      1. Seguir protocolo 2.1.1 a 2.1.5.
      2. Incubar 15 min a 4 ° C con 2 μg/mL de células T específicas sin etiqueta anticuerpos (anti-TCRαβ, R7/3 clon y anti-TCRγδ, V65 clon), lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y centrifugar 10 min a x 430 g. descartar el sobrenadante.
      3. Lave con granos magnéticos 3 veces con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA como se describe en el paso 2.1.7.
      4. Los esplenocitos se mezclan con los granos magnéticos para eliminar las células no deseadas e incubar 10 min a 4 ° C bajo agitación, luego coloque el tubo en el imán durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Repetir dos veces. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Añadir anticuerpos etiquetados a los esplenocitos ordenar celdas con presunta actividad supresora como células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clon), las células de B (anti-CD45RA, OX33 clon) o las células NK (anti-CD161, 3.2.3 clon). Etiqueta las cuentas con cada Ab a establecer una matriz de compensación en FACS. Incubar 15 min a 4 ° C y lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspender las células a una concentración de 5 x 107 células/mL, filtro en un filtro de tejido 60 μm y las células muertas de la etiqueta mediante la adición de DAPI a una concentración final de 0.1 μg/mL. Ordenar las células con un clasificador de células 70 μm boquilla compuerta en CD11b DAPI–/c+ para las células mieloides, CD45RA+ para las células de B y CD161+ para las células NK como se muestra en la figura 3.
    2. Clasificación de CD4 + y CD8 + CD45RC baja T células
      1. Seguir protocolo de 2.2.1 a 2.2.4.
      2. Para la selección negativa en una columna magnética, incubar las células 15 min a 4 ° C con 2 μg/mL purificada anticuerpos específicos contra células B (anti-CD45RA, clon de OX33), las células NK (anti CD161, 3.2.3 clon), las células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clon), gamma () células delta T anti-TCRγδ, V65 clon), lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y centrifugar 10 min a x 430 g. descartar el sobrenadante.
      3. Lavar los granos magnéticos 3 veces con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA como se describe en el paso 2.1.7.
      4. Quitar las células indeseadas por los esplenocitos de mezcla con los granos magnéticos durante 10 min a 4 ° C bajo agitación, luego coloque el tubo en el imán durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Repetir dos veces. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Añadir etiqueta anticuerpos a las células Tregs de ordenar: anti-TCRαβ (R7/3 clon), anti-CD4 (OX35 clon), anti-CD45RC (OX22 clone). Etiqueta las cuentas con cada Ab a establecer una matriz de compensación en FACS. Incubar 15 min a 4 ° C y lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspender las células a una concentración de 5 x 107 células/mL, filtro en un pañuelo de papel 60 μm y las células muertas de la etiqueta mediante la adición de DAPI a una concentración final de 0.1 μg/mL. Ordenar las células con un clasificador de células 70 μm boquilla compuerta en DAPI–TCR+CD4+CD45RCbaja CD4+Tregs y DAPI–TCR+CD4–CD45RC baja como CD8+Tregs ( figura 4).
        Nota: El anti-CD8α Ab (OX8 clon) puede utilizarse en lugar de la Ab anti-CD4 si son discriminadas las células de T de CD4+las células T no por anti-TCR etiquetado. Un exceso de CD4+Tregs debe ordenarse en anticipación de la muerte celular debido a la etiqueta del tinte de proliferación celular (CPD).
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE) etiquetado de células responder para medir proliferación
    1. Después de la clasificación de la célula de responder, Lave dos veces las células con 1 X PBS.
    2. Resuspender las células a una concentración de 1 x 107 células/mL de 1 X PBS e incubar con 0,5 μm CFSE por 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Detener la reacción agregando FCS a 1.5 X el volumen y centrifugar 10 min a 430 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    3. Lavar dos veces las células con el medio completo y contar las células.
      Nota: Espera 30% de la muerte de las células en este paso.
  5. Etiquetado de CPD de CD4 + Tregs para ensayo represivo en CD4 + células efectoras
    Nota: Este paso es necesario para discriminar CFSE–CD4+Tregs de respondedor proliferación CFSE– CD4+las células T en el día 6 de cocultivo de compuerta en las células del CPD– .
    1. Después de CD4+ Tregs célula clasificación, Lave dos veces las células con 1 X PBS.
    2. Resuspender las células a una concentración de 1 x 107 células/mL de 1 X PBS e incubar con 10 μm de CPD V450 por 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    3. Lavar dos veces las células con el medio completo y contar las células.
      Nota: Espera 30% de la muerte de las células en este paso.
  6. Consejo de cocultivo
    1. Utilizar la cultura en medio que comprende: Medio RPMI 1640 suplementado con beta-mercaptoetanol (5 x 10-5 M), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (0.1 mg/mL), piruvato de sodio (1 mM), glutamina (2 mM), buffer HEPES (1 mM), aminoácidos no esenciales (1 X), FCS ( 10%).
    2. Células en cultivo en U de 96 pozos de fondo las placas.
    3. Añadir las células en el orden siguiente: células represivas, respondedor células y células alogénicas.
    4. Mantener constante el número de células de la respuesta T y APC allogeneic y probar un número de rango de Tregs. Por ejemplo, de cociente 4:4:1, 5 x 104 células de prevencion, 5 x 104 células de respondedor y 1.25 x 104 células allogeneic cociente 2:4:1, 2,5 x 104 células de prevencion, 5 x 104 células de respondedor y 1.25 x 104 alogénico células.
    5. Mantener la proporción de 5 x 104 células de responder para 200 medio μL/pocillo.
    6. Para los controles, incluyen unos pocillos con células responder T sin trasplante allogeneic CPA (control negativo) y células de la respuesta T con APC allogeneic sin células reguladoras (control positivo) para CFSE gating en día 6 (ver paso 2.7.6.).
  7. FACS de tinción y análisis después de 6 días de cocultivo
    Nota: La proliferación de las células efectoras puede ser evaluada en varios puntos del tiempo. Tenga en cuenta que la proliferación es exponencial: aumenta la división celular, se observan más diferencias entre las condiciones de prevencion y control negativo.
    1. Transferencia de las células de la U de 96 pocillos las placas inferiores a 96 pocillos V las placas del fondo y centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    2. Guarde el sobrenadante en una nueva placa a-20 ° C para la medición de niveles del cytokine, si es necesario.
    3. Lavar las células con 200 μL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA bien y centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    4. Añadir anticuerpos a las células a más lejos de la puerta en las células de la respuesta T: anti-TCRab (R7/3 clon) y anti-CD4 (OX35 clon). Incubar 15 min a 4 ° C y lavar dos veces con 200 μL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA por pozo. Deseche el sobrenadante.
    5. Añadir 100 μl de DAPI diluido al 0.1 μg/mL de 1 X PBS y leer la placa con un analizador de FACS.
    6. Analizar el perfil de la CFSE mediante compuerta en negativo DAPI (células vivas) CPD negativo (no-CD4+Tregs) TCR+CD4+ las células. Responder sin estimular células tiene brillo CFSE máxima como se muestra en la figura 5 histograma izquierdo de abajo. En presencia de APCs alogénicos, las células de responder tienen proliferación máxima y mínima luminosidad CFSE (abajo, centro). En presencia de allogeneic APCs y células reguladoras, las células efectoras tienen proliferación medio y brillo CFSE (inferior derecha).

3. evaluación in Vivo de la actividad supresora de las células por transferencia celular adoptiva en un corazón injertado destinatario

Nota: La irradiación es necesaria para eliminar las células del huésped y favorecen la proliferación y el engraftment de la célula donante.

  1. Irradiar a los receptores de injerto temprano en el día antes del injerto al requisito del destinatario. Anestesiar ratas con inyección i.m. de xilacina (8 mg/kg)-ketamina (80 mg/kg) e irradiar en una dosis de 4.5 Gy con rayos X.
  2. Seguir protocolo 2.3 para aislar las células de interés.
    Nota: Guardar 1 x 108 esplenocitos para servir como un control positivo de tolerancia por transferencia adoptiva, si es necesario.
  3. 12 h después de la irradiación (el día antes de la prótesis, en la noche), anestesiar las ratas por inhalación de 4% de isoflurano O2 e infunden las células (5.0 x 10 células de7 T, 3.0 x 10 células7 B, 3.0 x 107 de células mieloides o 1.50 x 108 i.v. de esplenocitos como control positivo de tolerancia por transferencia adoptiva) en la vena del pene.
    Nota: El número de células que exija la transferencia adoptiva de la tolerancia depende de la actividad supresora de las células.
  4. Al día siguiente, seguir protocolo 1.1 realizar el aloinjerto. Seguir evolución de injerto por palpación a través del abdomen.

4. detección de anticuerpos específicos de donante

Nota: IgG respuestas dirigidas hacia el donante del injerto se miden por incubación de las células del donante con suero del receptor. Restar el fondo inducido por coloración directa de las células B LEW.1W por incubar las células con el suero LEW.1W syngeneic.

  1. Cosecha de sangre de las ratas y centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. Guardar el suero. Suero se puede almacenar a-20 ° C o utilizar inmediatamente. Inactivar el complemento en los sueros por incubación durante 30 min a 56 ° C.
  2. Cosecha el bazo de una rata LEW.1W del donante y se puede guardar en frío 1 X PBS. Siga los pasos de 2.2.1. a 2.2.4. Añadir 2 x 105 células/pocillo de una placa de 96 pocillos V inferior. Centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
  3. Diluir los sueros en serie de 1/10 a 1/270 de 1 X PBS (4 diluciones/muestra). Incube las células por 1 h a 4 ° C con 25 μl de suero diluido/pozo. Anticipar el número de donantes específicos IgG subtipos (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) las respuestas inmunitarias a analizar por muestra (subtipos de IgG de 1 suero x 4 diluciones x 4). Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y descarte el sobrenadante.
  4. Incubar las células con cada subtipo de IgG de ratón anti-rata Ab marcado con fluorocromo durante 30 min a 4 ° C, un subtipo/pozo.
    Nota: Si marcado con fluorocromo anti-rata Ig Ab está disponible, es posible usar subtipo de IgG purificada sin etiqueta ratón anti-rata Ab y un marcado con fluorocromo secundaria anti-ratón AB dependiendo en los fluorocromos disponibles y configuración del citómetro, varios subtipos de IgG anti-ratas pueden probarse en un pozo con ajustes apropiados.
  5. Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA dos veces y desechar el sobrenadante.
  6. Añadir 100 μl de DAPI diluido al 0.1 μg/mL en PBS y leer la placa con un analizador de FACS.
  7. Leer la intensidad de fluorescencia media (IFM) de subtipo de IgG de anti-rata Ab marcado con fluorocromo en todas las células DAPI– . Restar la IMF obtenida con ingenua LEW.1A suero de las células LEW.1W (tinción de fondo, abajo a la izquierda) de la IMF obtenida con el suero de cada receptor en las células LEW.1W en la dilución correspondiente (abajo media rechaza los destinatarios que pantalla máxima MFI y la parte inferior derecha por tratados destinatarios tolerantes que MFI intermedio) (figura 6).

5. evaluación de la respuesta Humoral a antígenos exógenos (Naive y memoria)

Nota: Puede usarse el suero de las ratas antes del trasplante, el tratamiento y la inmunización como controles negativos de las respuestas humorales. De lo contrario, se pueden utilizar ratas ingenuas no inmunizados. El suero de los receptores inmunocompetentes, es decir, trasplantado los receptores vacunados exoantigen y rechaza, se utilizan como controles positivos de las respuestas humorales.

  1. Capacidad para desarrollar la respuesta humoral a un nuevo antígeno (figura 7)
    Nota: Este método es una cuantificación relativa de las respuestas humorales como no incluye una norma. Una cuantificación absoluta de Ig sería posible mediante la adición de una gama de diluciones de rat IgG o IgM anti-KLH Ab con concentración conocida de paso 5.1.6.
    1. Emulsionar 50 μg de KLH en 200 μL de completa adyuvante de Freund de e inyectar en la cola de largo sobrevivir/tolerantes a destinatarios, destinatarios rechaza sin tratar, o ingenuo ratas de control como control positivo de las respuestas humorales.
    2. Recoger muestras de sangre a los 4 y 13 días después de la inmunización y centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. La fase superior es el suero. El suero de las ratas no inmunizados para un control negativo de la cosecha. Suero puede congelarse a-20 ° C hasta el ensayo de ELISA.
    3. Capa de placas de ELISA (fondo plano) con 50 μL/pocillo KLH diluido a 10 μg/mL de 1 X PBS durante la noche a 4 ° C. Asegúrese de que la solución de capa cubre todos los pozos.
    4. Retirar el exceso sin recubrimiento KLH por lavado. Para lavar, añadir 150 μL/pocillo del tampón de lavado (PBS de X 1 que contiene 0,1% Tween) y flick.
    5. Unión inespecífica de bloque de Ig del destinatario por incubar durante 1 h a 37 ° C con 100 μL/pocillo del tampón de lavado que contiene 10% FCS. Una vez lavado.
    6. Diluir el suero receptor en tampón de lavado a partir de 1/40 a 1/512 en serie, añadir 50 μL/pocillo de duplicados de la dilución serial a la placa de cubierta e incubar por 2 h a 37 ° C. Mantenga algunos pozos libres de suero de control negativo. Lavar dos veces.
    7. Añadir 50 μl de 1 μg/mL de conjugado con biotina anti-rata IgM Ab en los pocillos que contienen el suero cosechado en el día 4 en recipientes, o 50 μl de conjugado con biotina anti-rat IgG en los pocillos que contienen el suero cosechado en el día 13 e incubar 1 h a 37 ° C. Lavar dos veces.
    8. Añadir 50 μL/pocillo del conjugado HRP-estreptavidina en 1 μg/mL durante 45 min a 37 ° C. Lavar 3 veces.
    9. Añadir 50 μl de 3, 3′, 5, 5-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato para < 30 min a temperatura ambiente y detener la reacción con 25 μl de ácido sulfúrico de 2 M cuando están saturados los controles positivos.
    10. Leer la absorbancia a 405 nm. Comparar la densidad óptica obtenida con el suero del receptor al que obtuvo con el suero de control de ratas de ingenuo.
  2. Evaluación de la capacidad de respuesta humoral memoria (figura 8)
    1. 7 días antes del trasplante, inyectar i.v. 109 de xenogeneicos gr diluido en 800 μl de 1 X PBS a las ratas de ingenuo. Los glóbulos rojos pueden ser de oveja, caballo o cualquier otra especie.
    2. Realizar el trasplante y administrar el tratamiento de tolerogénicas.
    3. 3 días después del injerto, inyecte nuevo i.v.109 RBC diluido en 800 μl de 1 X PBS en los receptores de injerto y las ratas no injertado.
    4. Cosecha sangre muestras 5 y 14 días después de la segunda inmunización y centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C para recuperar la fase superior del suero. Suero se puede almacenar a-20 ° C o utilizar inmediatamente. Inactivar el complemento en el suero de rata por Incubar 30 min a 56 ° C antes de usar.
    5. Añadir 2 x 105 RBC/pozo de una placa de 96 pocillos V inferior. Centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C y eliminar cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.
    6. En serie diluir los sueros 2 de 1/10 a 1/1280 de 1 X PBS (8 diluciones/muestra). Incube las células por 1 h a 4 ° C con 25 μl de suero diluido/pozo. Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y descarte el sobrenadante.
    7. Incubar las células con la RBC especies adsorbidas anti-rata IgG o IgM subtipos marcados con fluorocromo durante 30 min a 4 ° C, un subtipo/pozo. Evaluar la rata de IgM e IgG anti-RBC en suero cosechada respectivamente 5 y 14 días después de la inmunización,. Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA dos veces y desechar el sobrenadante.
      Nota: Si marcado con fluorocromo anti-rata Ig Ab está disponible, es posible utilizar subtipo de IgG purificada sin etiqueta ratón anti-rata Ab y un marcado con fluorocromo secundaria anti-ratón Ab.
    8. Añada 100 μl de DAPI diluido al 0.1 μg/mL de 1 X PBS y analizar las células con un analizador de FACS.
    9. Representar a la IMF en función de la dilución para cada grupo.

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Resultados

La evaluación de la actividad represiva tras la clasificación de la APC (figura 1), células de la respuesta y Tregs simultáneamente (figura 2), o individualmente (figura 4), y cualquier otras células reguladoras putativos (figura 3), puede ser hecho en vivo por la inyección directa de células reguladoras y en vitro por la medida del brillo de la CFSE (<...

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Discusión

Transferencia adoptiva de esplenocitos totales en un destinatario recién injertado es una manera eficiente de detectar la presencia de células reguladoras inducidas o potenciada por un tratamiento. Linfopenia transitoria inducida por la irradiación de host promueve supervivencia de la célula después de la transferencia y establecimiento de la tolerancia. Por otra parte, el letal irradiación deja tiempo para las células con propiedades tolerogénicas para convertir a las nuevas células reguladoras durante la reconstitución...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Este trabajo fue realizado en el contexto del proyecto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que es parte del programa de gobierno francés "Investissements Avenir" administrado por la ANR (ANR-11-LABX-0016-01) y por el proyecto IHU-Cesti financiado también por el " Programa de gobierno francés investissements Avenir", gestionado por la Agencia de investigación nacional de francés (ANR) (ANR-10-IBHU-005). El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Métropole y Région Pays de la Loire.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
LEW.1W y LEW.1A ratasJanvier Labs, Francia8 semanas de edad, 
Ratas donantes de terceros BNJanvier Labs, Franciade 8 semanas de edad, 
namecompanynúmero de catálogocomments
>reagents
AdCD40IgViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Franciaplásmidos caseros
IL34-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Franciaplásmidos caseros
FGL2-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Franciaplásmidos caseros
anti-TCRabHibridoma de la Colección Europea de Cultivo Celular, Salisbury, Reino UnidoClon R7/3Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos
anti-CD25Hibridoma de la Colección Europea de Cultivo Celular, Salisbury, Reino UnidoClonOX39Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos
hibridoma anti-CD8de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino UnidoClon OX8Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos
anti-CD45RAHibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino UnidoClon OX33 Cultivocasero, purificación y acoplamiento de fluororóforos
anti-CD161Hibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino UnidoClon 3.2.3 Cultivocasero, purificación y acoplamiento de fluororóforos
hibridoma anti-CD11b/cde la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino UnidoClon OX42Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluoróforos
anti-TCRgdHibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino UnidoClonV65Cultivo, purificación y acoplamiento de fluororóforos
casero anti-CD45RCHibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino UnidoClon OX22Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos
anti-CD4Hibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino UnidoClon OX35 Cultivocasero, purificación y acoplamiento de fluororóforos
anti-CD45RBD Biosciences, Mountain View, CA#554881, clon
IgG-FITC anti-ratasJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, EE. UU.#112-096-071
IgG1 anti-ratasSerotec#MCA 194
IgG2a anti-ratasSerotec#MCA 278
IgG2b anti-ratasSerotec#MCA 195
IgM-FITCanti-ratasJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, EE. UU.# 115-095-164
estreptavidina HRPBD Biosciences, Mountain View, CA# 554066
KLHSigma Aldrich, St. Louis, EE. UU.# 9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher   Scientific Inc, EE. UU. Solución tampón de fosfato sin calcio y magnesio, 
Tween 20Sigma, Saint-Louis, EE. UU.#9005-64-5
Kit de reactivos de sustrato TMBBD Biosciences, Mountain View, CA#555214
CellTraceTM Kit de proliferación celular CFSEThermo Fisher  Scientific Inc, EE. UU
RPMI 1640 medio 1XThermo Fisher  Scientific Inc, EE. UU.# 31870-025
estreptomicina penicilinaThermo Fisher   Scientific Inc, EE. UU.# 15140-122
Tampón HepesThermo Fisher  Scientific Inc, USA#15630-056
aminoácidos no esencialesThermo Fisher  Scientific Inc, EE. UU.# 11140-035
Piruvato de sodioThermo Fisher   Scientific Inc, EE. UU.# 11360-039
2 beta mercaptoetanolSigma, Saint-Louis, EE. UU.
Tinte de proliferación celular eFluor & reg; 450 CellThermo Fisher   Scientific Inc, EE. UU.# 65-0842-85
GlutaminaSigma, Saint-Louis, EE. UU.
DAPIThermo Fisher   Scientific Inc, EE. UU.
Colagenasa DRoche Diagnostics, Alemania#11088882001
EDTASigma, Saint-Louis, EE. UU.
NaCl 0.9%Fresenius Kabi#B230561
Dynabeads magnéticosDynal, Invitrogen#11033Cabra anti-ratón IgG
One Comp eBeadsEbiosciences, San Diego, EE. UU.#01-1111-42
BetadineConsulte las directrices
IsofluranoConsulte las directrices
NaplbuphineConsulte las directrices
TerramicinaConsulte las directrices institucionales
institucionales Directrices
MeloxicamConsultar las directrices
Completar el adyuvante
RompunConsultar las directrices
Ringer lactatoConsultar las directrices institucionales
KetaminaConsultar las directrices institucionales
lisis de glóbulos rojosDiluir 8,29 g de NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, EE. UU. A-9434), 1 g de KHCO3 (Prolabo 26 733.292) y 37,2 mg de EDTA (Sigma, Saint-Louis, EE. UU. E5134) en 800 ml de H2O. Ajuste el pH a 7.2-7.4 y complete a 1L con H2O.
Colagenasa DDiluida 1g colagenasa en 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0,5%)Añadir 5 mL de EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) y 20ml de FCS a 1ml de PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)Diluir 50µ g (=1 vial) de CFDA SE (componente A) en 90μ l Solución DMSO (componente B) para obtener una solución madre de 10 mM. A continuación, diluir la solución madre a 1/20 000 en PBS 1X para obtener un 0,5μ M solución
completa de medio para cocultivo500 ml de medio completo RPMI-1640 con 5 ml de Penicilina (80 unidades/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml de L-Glutamina, 5 ml de Aminoácidos No Esenciales (100X), 5 ml de Piruvato Sódico (100 mM), 5 ml de tampón HEPES (1M), 2,5 ml de mercaptometanol (7 ml de caldo de 2-bmercaptoetanol diluido en 10 ml de RPMI), 10% FCS
strong>namecompanynúmero de catálogocomments
equipments
falcon 50mlBD Biosciences, Mountain View, CA#227261
halcón 15mlBD Biosciences, Mountain View, CA#188271
tamiz
Platos de cultivo de plástico CorningVWR, Pessac#391-0439
100µ m y 60µ m filtros de tejidoSefar NITEX, Heiden, Suiza#03-100/44 y #03-60/35
96 pocillos Placas inferiores en U para cocultivo  Placa de cultivo de tejidos con fondo en U Falcon, estéril, Corning#353077
Placas inferiores en V de 96 pocillos para tinción FACSThermoScientifique, Danemark#249570
Placas ELISA de fondo plano de 96 pocillosSerengue Nunc Maxisorb
para trituración de bazoBD Biosciences, Mountain View, CA#309649
Lector de ELISASPARK 10M, Tecan, SuizaSPARK 10M, Tecan, Suiza
centrífuga
baño maría 
irradiador de rayos XLincolshire, InglaterraFaxitron CP160
agitador
FACS Canto IIBD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria IIBD Biosciences, Mountain View, CA
imánThermo Fisher  Scientific Inc, Estados Unidos12302D
de His24.#C34554 #M3148 #G3126 #D1306 #E5134 institucionalesinstitucionalesinstitucionales Buprenorfina Consulte las directrices institucionalesde FreundinstitucionalesSolución de <solar

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