Se describe un protocolo para la disección, la fijación y la inmunotinción de órganos androgénica en Drosophila larvas y adultos hembras para estudiar la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. Además de los órganos androgénica, visualizamos la inervación de los órganos androgénica, así como células diana androgénica, tales como las células madre de línea germinal.
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Artículo de método
Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta
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Resumen
Resumen
En los organismos multicelulares, un pequeño grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica, la inducción de una respuesta sistémica a crecimiento y reproducción. En los insectos, la glándula larval prothoracic (PG) y las hembras adultas de juego ovario papeles esenciales en la biosíntesis de los principales hormonas esteroides llamados ecdysteroids. Estos órganos ecdysteroidogenic están inervados desde el sistema nervioso, a través del cual la temporización de la biosíntesis se ve afectada por las señales ambientales. Aquí se describe un protocolo para la visualización de órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos en larvas y adultos de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, que proporciona un sistema modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. disección hábil nos permite mantener las posiciones de los órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos, incluyendo el cerebro, el cordón nervioso ventral, y otros tejidos. La inmunotinción con unantibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, junto con las proteínas de fluorescencia transgénicos conducidos por promotores específicos de tejido, están disponibles para marcar las células ecdysteroidogenic. Por otra parte, la inervación de los órganos ecdysteroidogenic también pueden marcarse por anticuerpos específicos o una colección de controladores de GAL4 en diversos tipos de neuronas. Por lo tanto, los órganos ecdysteroidogenic y sus conexiones neuronales pueden ser visualizadas simultáneamente por inmunotinción y técnicas transgénicas. Por último, se describe cómo visualizar las células madre de línea germinal, cuya proliferación y mantenimiento son controlados por ecdysteroids. Este método contribuye a la comprensión global de la biosíntesis de la hormona esteroide y su mecanismo de regulación neuronal.
Introducción
En los organismos multicelulares, un grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica que es esencial para todo el cuerpo. Para cumplir su cometido, cada tejido u órgano expresa una serie de genes relacionados con sus funciones y se comunica con otros tejidos para orquestar sus actividades en el contexto del desarrollo. Para caracterizar este tipo de funciones celulares especializadas y las interacciones entre órganos, tenemos que especificar un grupo de células junto con otros tipos de células que se mantienen intactos en la arquitectura multicelular.
Un ejemplo de tales órganos especializados es un órg....
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Protocolo
NOTA: El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1.
1. La disección de la larval anillo prensaestopas (RG)
NOTA: En D. melanogaster, que pertenece a Diptera cyclorrhaphous, el PG está dentro de un órgano endocrino compuesto llama la glándula anillo (RG, la Figura 2D). Puesto que es inviable que el PG se separa quirúrgicamente de otros tipos de células (discutidos más adelante), un objetivo práctico es aislar un RG intacto, sin daños por disección.
- Preparación de larvas en las etapas de desarrollo apro....
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Resultados
Se utilizaron los protocolos anteriores para visualizar los órganos androgénica y sus órganos interactivos en D. melanogaster larvas y adultos hembras. El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1.
El RG, incluyendo el PG (Figura 2D), es más pequeño y más transparente que el cerebro y se encuentra en el lado anterior-dorsal del cerebro (Figura 2A-C y 3A-E). Para etiquetar las células PG, varios grupos han generado varios tipos de anticuerpos c.......
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Discusión
Se estudió la biosíntesis ecdisteroide y su mecanismo de regulación en D. melanogaster, e ideó un protocolo para la disección y la inmunotinción. El momento de la biosíntesis de ecdiesteroide se ve afectada por las señales ambientales a través de entradas neuronales 33, por lo que es esencial para mantener la inervación de los órganos ecdysteroidogenic junto con el cerebro, VNC, y otros tejidos durante la disección.
Como se describió anteriormente, el D. .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos a Reiko Kise y Tomotsune Ameku por su apoyo técnico a este trabajo. Agradecemos también a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, el Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), y el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de las acciones y los reactivos. Este trabajo fue apoyado por becas a YSN de JSP KAKENHI la subvención Número 16K20945, La Fundación Naito, y el Premio de Investigación de Ciencias Inoue; y con una donación a RN de MEXT KAKENHI la subvención Número 16H04792.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cultivo de huevos | |||
| (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | para platos de agar jugo de uva |
| taza de recolección | HIKARI KAGAKU | ||
| de levadura | Levadura seca oriental, Tokio | ||
| 100% jugo de uva | Welch Food Inc. | ||
| > cría fuerte | |||
| pequeños (12 ml, 40 veces; 23,5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| lazo desechable | AS ONE | 6-488-01 | |
| alimento estándar para | el recepi nosotros en el sitio web del centro de valores de Blooington. | ||
| > | |||
| Carl Zeiss | Stemi 2000-C | ||
| Leica | S8 AP0 | ||
| (35 x 10 mm, sin tratar) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | silicona coarting dentro de placas | |
| Aguja Terumo (27G, 0,40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | Un "cuchillo" para cortar las pinzas de tejido |
| , Inox, #5 | Dumont, Suiza | ||
| alfiler de insectos (0,18 mm de diámetro) | Marca | ||
| micro tijeras de | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fijación | |||
| agua ultrapura | Merck Millipore | ||
| salina tamponada con fosfato (PBS) | |||
| Formaldehído | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehído | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubos (1,5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubación | |||
| Como un mezclador de espinas TM-300 (balancín) | Como un | balancín | TM-300 |
| Albúmina sérica bovina | SIGMA | 9048-46-8 | |
| anticuerpo primario | |||
| anti-Sro (conejillo de indias), 1:1000 | |||
| anti-GFP (conejo), 1:1000 | Sondas moleculares | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mAb de ratón, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (conejo), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (ratón) | Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherina (rata), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (ratón), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secundario | |||
| Cabra anti-conejo IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugado | Life Technologies | A-11008 | |
| Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra IgG (H+L), conjugado con Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11001 | |
| Anticuerpo secundario anti-rata IgG (H+L) de cabra, conjugado con Alexa Fluor 546 Life | Technologies | A-11081 | |
| Anticuerpo secundario anti-cobaya IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 faloidina conjugada con colorante | Life Tecnologías | A-22283 | |
| Reactivos de montaje | |||
| Micro portaobjetos | de vidrio Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Cubierta de cristal de microscopio cuadrado | Matsunami Glass Ind., Ltd. | ||
| Reactivo FluorSave (Reactivo de montaje) | Calbiochem | 345789 | |
| Pipeta de transferencia 1 ml (Gotero desechable) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 sistema de microscopio de barrido láser | Carl Zeiss | invertido Axio Observer. Z1 SP izquierda | |
| procesamiento de imágenes | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | Es una interfaz de usuario especial basada en el sistema operativo Microsoft Windows7 de 64 bits | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | del Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS– GFP; UAS– mCD8::GFP | regalos de K. Ito, Universidad de Tokio. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | ver en Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | del Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | del Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
Referencias
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....
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Reimpresiones y permisos
