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Artículo de método

CAPRRESI: Ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos

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DOI:

10.3791/55526

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25 de junio de 2017

 ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Oncomedic Incorporation, Ciudad de México, 3Laboratorio Internacional de Investigación sobre el Genoma Humano, Universidad Nacional Autónoma de México

En este artículo

Resumen

Aquí, se presenta el ensamblaje de quimeras mediante la recuperación de plásmidos y la inserción en el sitio de enzima de restricción (CAPRRESI), un protocolo basado en la inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias de ADN sinónimas y recuperación funcional de plásmidos. Este protocolo es un método rápido y de bajo costo para fusionar genes codificadores de proteínas.

Resumen

En este caso, presentamos el ensamblaje de la quimera mediante la recuperación del plásmido y la inserción del sitio de la enzima de restricción (CAPRRESI). CAPRRESI se beneficia de muchas fortalezas del método original de recuperación de plásmidos e introduce la digestión con enzimas de restricción para facilitar las reacciones de ligación de ADN (necesarias para el montaje de quimeras). Para este protocolo, los usuarios clonan genes de tipo salvaje en el mismo plásmido (pUC18 o pUC19). Después de la selección in silico de las regiones de secuencia de aminoácidos en las que deberían montarse quimeras, los usuarios obtienen todas las secuencias de ADN sinónimas que las codifican. Los scripts Perl ad hoc permiten a los usuarios determinar todas las secuencias de ADN del sinónimo. Después de este paso, otro script Perl busca sitios de enzimas de restricción en todas las secuencias de ADN sinónimas. Este análisis in silico también se realiza usando el gen de resistencia a ampicilina ( ampR ) encontrado en plásmidos pUC18 / 19. Los usuarios diseñan oligonucleótidos dentro de regiones sinónimas para interrumpir genes de tipo salvaje y ampR por PCR. Después de obtY purificación de fragmentos de ADN complementarios, se lleva a cabo la digestión con enzimas de restricción. El montaje de la quimera se logra mediante ligación de fragmentos de ADN complementarios apropiados. Los vectores pUC18 / 19 se seleccionan para CAPRRESI porque ofrecen ventajas técnicas, tales como tamaño pequeño (2,686 pares de bases), alto número de copias, características de reacción de secuenciación ventajosas y disponibilidad comercial. El uso de enzimas de restricción para el montaje de quimeras elimina la necesidad de polimerasas de ADN que producen productos de extremos romos. CAPRRESI es un método rápido y de bajo costo para fusionar genes codificadores de proteínas.

Introducción

El montaje de genes quiméricos ha sido ampliamente utilizado en biología molecular para elucidar la función de la proteína y / o para propósitos biotecnológicos. Existen diferentes métodos para fusionar genes, tales como la superposición de la amplificación del producto de PCR 1 , la recuperación 2 del plásmido, la recombinación homóloga 3 , los sistemas CRISPR-Cas9 4 , la recombinación dirigida 5 y el conjunto 6 de Gibson. Cada una de ellas ofrece diferentes ventajas técnicas; Por ejemplo, la flexibilidad del diseño de PCR superpuesto, la selección in vivo de construcciones durante la recuperación del plásmido o la alta eficiencia de los sistemas CRISPR-Cas9 y Gibson. Por otro lado, pueden surgir algunas dificultades al realizar algunos de estos métodos; Por ejemplo, los dos primeros enfoques se basan en fragmentos de ADN de extremos romos, y la ligadura de estos tipos de productos podría ser técnicamente difícil en comparación con sticKy-terminó ligadura. La recombinación dirigida puede dejar trazas de secuencias de ADN adicionales (cicatrices) en el original, como en el sistema CreloxP 5 . CRISPR-Cas9 a veces puede modificar otras regiones del genoma, además de la meta de sitio [ 4] .

Aquí, se introduce el conjunto de quimeras mediante la recuperación del plásmido y la inserción del sitio de la enzima de restricción (CAPRRESI), un protocolo para fusionar genes que codifican proteínas que combina el método de recuperación de plásmidos (PRM) con la inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias de ADN sinónimas, . Para asegurar la integridad de la secuencia de aminoácidos, los sitios de enzimas de restricción se insertan en secuencias de secuencia de ADN sinónimo. Entre los beneficios de CAPPRESI cabe destacar que puede realizarse con reactivos / herramientas de laboratorio comunes ( por ejemplo , enzimas, células competentes, soluciones y termociclador) y que puede dar resultados rápidos (cuando se utilizan las enzimas apropiadas). Basándose en la restricciónLos sitios de enzimas que emergen de secuencias de ADN sinónimas pueden limitar la selección de los puntos de fusión exactos dentro de las proteínas de interés. En tales casos, los genes diana deben fusionarse usando oligonucleótidos superpuestos, y los sitios de enzimas de restricción deben insertarse en el gen de resistencia del vector.

CAPRRESI consiste en siete pasos simples ( Figura 1 ): 1) selección del vector de clonación, pUC18 o pUC19 6 ; 2) análisis in silico de las secuencias de tipo salvaje a fusionar; 3) selección de las regiones de rotura para el montaje de la quimera y la interrupción del plásmido; 4) generación in silico de secuencias de ADN sinónimas que contienen sitios de enzimas de restricción; 5) clonación independiente de los genes de tipo salvaje en el plásmido seleccionado; 6) interrupción del plásmido por PCR, seguido de digestión con enzimas de restricción; Y 7) recuperación de plásmido usando ligación de ADN y transformación bacteriana. Los genes quiméricos producidos por esta técnica deben ser verificados wCon la secuenciación.

Los vectores pUC18 / 19 ofrecen ventajas técnicas para la clonación y montaje de quimeras, tales como tamaño pequeño ( es decir, 2,686 pares de bases), alto número de copias, características de reacción de secuenciación ventajosas y disponibilidad comercial 7 . Aquí, un huésped de Escherichia coli se utilizó para ensamblar y manejar las quimeras porque los cultivos bacterianos son baratos y crecen rápidamente. Teniendo en cuenta esto, será necesaria la clonación subsiguiente de los fragmentos de fusión en los plásmidos diana finales ( por ejemplo, vectores de expresión como pRK415 en bacterias o pCMV en células de mamífero).

CAPRRESI se ensayó por fusionar dos genes del factor sigma primario: E. colirpoD y Rhizobium etlisigA . Los factores sigma primarios son subunidades de ARN polimerasa responsables de la iniciación de la transcripción, y consisten en cuatro dominios ( es decir, σ1, σ2, σ3 y σ4) 8 . La longitud de la secuencia de aminoácidosH de proteínas codificadas por rpoD y sigA son 613 y 685, respectivamente. RpoD y SigA comparten 48% de identidad (98% de cobertura). Estos factores sigma primaria se dividieron en dos fragmentos complementarios entre las regiones σ2 y σ3. Se montaron dos genes quiméricos según este diseño: quimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) y quimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Los productos de fusión de ADN se verificaron por secuenciación.

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Protocolo

1. Protocolo CAPRRESI

NOTA: La figura 1 representa el protocolo CAPRRESI general. Esta técnica se basa en un diseño in silico y la posterior construcción de las quimeras deseadas.

  1. Selección del plásmido de clonación, pUC18 o pUC19.
    1. Seleccione el vector pUC que mejor se adapte a las demandas técnicas.
      NOTA: Ambos vectores tienen la misma secuencia, excepto la orientación del sitio de clonación múltiple. Esto es importante para el diseño de oligonucleótidos y la ruptura del plásmido de PCR.
  2. Análisis in silico de los genes de tipo salvaje y secuencias pUC18 / 19.
    1. Obtener las secuencias de ADN de los genes de tipo salvaje y guardarlos en un archivo en formato FASTA ( por ejemplo, genes.fas).
      NOTA: Las secuencias de vectores pUC18 / 19 están contenidas en el archivo pUC.fas ( Figura 1 , etapa 1).
    2. Determinar qué enzima de restricciónYmes no cortan los genes wildtype y las secuencias pUC18 / 19 ejecutando el script REsearch.pl. Alternativamente, realice una búsqueda de sitios de enzimas de restricción con una herramienta en línea ( Figura 1 , paso 2).
      1. Escriba lo siguiente en un terminal:
        Perl REsearch.pl genes.fas
        Perl REsearch.pl pUC.fas
        NOTA: Estos comandos crearán los siguientes archivos de salida: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas y pUC_re.fas.
      2. Seleccione las enzimas de restricción apropiadas para clonar los genes de tipo salvaje en el sitio de clonación múltiple del vector pUC18 / 19 elegido comparando los archivos genes_re.fas y pUC.fas. Elija la orientación del inserto relativo al gen de resistencia a ampicilina ( ampR ) del vector pUC18 / 19.
    3. Diseñar oligonucleótidos directos e inversos para amplificar la región codificante de los genes de tipo salvaje (oligonucleótidos externos). Incluir el sitio de enzima de restricción adecuado en cada extremo 5 'De los oligonucleótidos; Esto definirá la orientación del inserto.
      1. Incluir un sitio funcional de unión al ribosoma en los oligonucleótidos directos.
      2. Insertar ambos genes de tipo salvaje en la misma orientación dentro del vector.
  3. Selección de las regiones de ruptura para el ensamblaje de la quimera y la disrupción del plásmido.
    1. Obtenga la secuencia de aminoácidos de los genes wildtype y ampR ejecutando el script translate.pl ( Figura 1 , paso 3).
      1. Escriba lo siguiente en un terminal:
        Perl translate.pl genes.fas
        Perl translate.pl ampR.fas
        NOTA: Este script creará los siguientes archivos de salida: genes_aa.fas y ampR_aa.fas.
    2. Alinear globalmente las dos secuencias de aminoácidos de tipo salvaje con un software apropiado ( por ejemplo, MUSCULO) 9 .
    3. Seleccione las regiones de rotura deseadas (3-6 aminoácidos) para chimera asseEn función de la alineación de la secuencia. Guárdelos en un archivo en formato FASTA ( por ejemplo , regions.fas).
    4. Localice las secuencias de ADN que codifican los tramos de aminoácidos seleccionados en ambos genes de tipo salvaje.
  4. Generación in silico de secuencias de ADN sinónimas que contienen sitios de enzimas de restricción.
    1. Obtener todas las secuencias de ADN sinónimas que codifican para cada segmento de secuencia de aminoácidos seleccionado como regiones de ruptura ( Figura 1 , etapa 4); Estas secuencias se almacenaron en el archivo regions.fas.
      1. Escriba lo siguiente en un terminal:
        Perl synonym.pl regions.fas
        NOTA: Este script creará el archivo de salida regions_syn.fas.
    2. Búsqueda de sitios de enzimas de restricción encontrados en secuencias de ADN sinónimo.
      1. Escriba lo siguiente en un terminal: perl REsynonym.pl regions_syn.fas
        NOTA: Este script creará el archivo de salida regions_syn-re.fas.
    3. Elija una enzima de restricción que se comparta entre las secuencias sinónimas de ambos genes de tipo salvaje; Este sitio será utilizado para ensamblar quimeras a través de la digestión con enzimas de restricción. Verificar que la enzima de restricción escogida no corta ni los genes de tipo salvaje ni las secuencias de vectores pUC18 / 19.
      1. Compare las enzimas de restricción encontradas en los archivos genes_re.fas, pUC_re.fas y regions_syn-re.fas.
    4. In silico sustituye los originales por sus secuencias de ADN sinónimo en los loci correspondientes en ambos genes de tipo salvaje. Añadir secuencias de ADN sinónimo en el archivo de secuencia de tipo salvaje (genes.fas).
    5. Obtenga la secuencia de aminoácidos de los genes contenidos en el archivo genes.fas ( perl translate.pl genes.fas ).
    6. Alinear las secuencias de aminoácidos traducidas a partir de secuencias de ADN de tipo salvaje y sinónimas. Compruebe que ambas secuencias son iguales.
    7. Repita todos los pasos de esta sección con el gen ampR presente en la pUC18 / 19 vector.
      NOTA: El objetivo es interrumpir el gen ampR (archivo ampR.fas) en dos partes complementarias. La enzima de restricción seleccionada para interrumpir el gen ampR debe ser diferente de la utilizada para el ensamblaje de la quimera.
  5. La clonación independiente de los dos genes de tipo salvaje en el vector pUC18 / 19 seleccionado (Figura 1, etapa 3).
    1. Purificar el ADN de plásmido pUC18 / 19 elegido usando un kit de purificación de ADN de plásmido.
      1. Por ejemplo, transformar E. coli DH5α con el plásmido pUC18 y cultivar los transformantes durante la noche a 37 ° C sobre LB sólido-0,3 mg / ml de ampicilina (Amp). Elija una colonia transformante, inocule una nueva placa Amp de LB-0,3 mg / mL, y cultive la noche a la mañana a 37 ° C.
      2. Tomar parte del cultivo anterior y cultivarlo en líquido LB-0.3 mg / mL Amp durante 6-8 h a 37 ° C. Extraer el ADN del plásmido usando un kit.
    2. PCR amplificar los genes de tipo salvaje del ADN genómico total utilizando el appropOligonucleótidos externos externos. Utilice una ADN polimerasa de alta fidelidad, si es posible. Seleccione la DNA polimerasa que maximiza el rendimiento. Realizar la PCR de acuerdo con las directrices del fabricante y la temperatura de fusión de los oligonucleótidos.
      1. Ejecutar ciclos de PCR, dependiendo de la ADN polimerasa, tamaño del amplicón, molde y oligonucleótidos usados. Por ejemplo, para amplificar el ADN de rpoD , preparar una reacción de 50 μl: 5 μl de tampón 10x, 2 μl de MgSO4 50 mM, 1 μl de mezcla dNTP 10 mM, 2 μl de cada oligonucleótido 10 μM (Tabla 2), 2 Μl de ADN molde (ADN total de E. coli DH5α), 35,8 μl de agua ultrapura y 0,2 μl de ADN polimerasa de alta fidelidad. Se realizan los siguientes ciclos de PCR: 1 min a 94ºC para la desnaturalización inicial seguido de 30 ciclos de amplificación (30 s a 94ºC para desnaturalizar, 30 s a 60ºC para recocer los oligonucleótidos y 2 min a 68ºC extender).
      2. Disolver 1,2 g deAgarosa en 100 ml de agua doblemente destilada calentándolos en el microondas. Ensamble una bandeja de gel y un peine y póngalos en el gel horizontal. Llenar la bandeja de gel con la solución de agarosa fundida y dejar que se solidifique. Quite el peine.
      3. Coloque el gel en la cámara de electroforesis. Rellene la cámara con 1x tampón Tris-acetato-EDTA. Cargar 50 μL de productos de PCR en los pocillos de gel. Se electroforan las muestras ( por ejemplo , a 110 V durante 1 h).
      4. Después de la electroforesis, colorear el gel en 100 ml de agua doblemente destilada que contiene 100 μl de solución de bromuro de etidio a 1 mg / ml durante 10 minutos con agitación lenta. Lavar el gel en agua doblemente destilada durante otros 10 min en agitación lenta; Utilice un agitador horizontal.
        Precaución: El bromuro de etidio es un compuesto tóxico; Use guantes protectores y una capa de laboratorio de algodón.
      5. Purificar el ADN del gen de tipo salvaje de las bandas correspondientes del gel usando un kit. Visualice las bandas colocando el gel manchado en una cámara UV (Longitud de onda recomendada: 300 nm). Mantenga la exposición del gel a un mínimo. Utilice un kit de purificación de ADN y siga las instrucciones del fabricante.
        Precaución: La radiación UV es peligrosa; Use un escudo protector, gafas y una capa de laboratorio de algodón.
    3. Digest purificaron genes de tipo salvaje y pUC18 / 19 plásmido de ADN con las enzimas de restricción de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Use enzimas de digestión rápida cuando sea posible. Por ejemplo, digerir 6 μL de ADN de pUC18 (300 ng / μl) en 10 μl de agua ultrapura, 2 μl de tampón 10X, 1 μl de enzima de restricción Kpn I y 1 μl de enzima de restricción Xba I. Dejar la reacción a 37 ° C durante 30 min.
      1. Inactivar las enzimas de restricción de acuerdo con las directrices del fabricante. Por ejemplo, inactivar la reacción de doble digestión Kpn I - Xba I a 80 ° C durante 5 min.
    4. Mezcla de inserto: vector de ADN a una velocidad volumétricaO de 3: 1. Siga las instrucciones del fabricante para una reacción de ligadura. Utilice enzimas de ligación rápida cuando sea posible (deje la reacción a 25 ° C durante 10 min).
      NOTA: Típicamente, la concentración de ADN después de la purificación utilizando los kits es lo suficientemente buena para las reacciones de digestión y ligadura. Por ejemplo, añadir 6 μl de ADN rpoD ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μl), 3 μl de ADN pUC18 ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μl), 10 μl de tampón 2x, 1 μl de ultrapuro Agua, y 1 μl de T4 ADN ligasa. Dejar la reacción de ligadura a 25 ° C durante 10 min.
    5. Transformar el E. coli DH5α con 2-4 μl de la reacción de ligación, como se describe en los Materiales Complementarios. Placa de las células transformadas en sólido LB / Amp / X-gal / IPTG placas. Dejar las placas durante una noche a 37ºC.
    6. Seleccione las colonias de E. coli transformantes de color blanco y pétalas en una nueva placa LB / Amp. Dejar las placas durante la noche a 37 ° C.
    7. Realizar una PCR de colonias para elegir candidatos para secuenciar la reacción, como se describe en los Materiales Complementarios. Extraer el ADN del plásmido de los candidatos. Alternativamente, digerir el ADN del plásmido candidato con las mismas enzimas de restricción usadas para clonar los insertos.
    8. Secuencia de construcciones candidatas con un proveedor de servicios de secuenciación 10 . Ensamble la secuencia en silico usando un ensamblador de ADN 11 ( Figura 1 , paso 5).
  6. Interrupción del plásmido por PCR seguida por digestión con enzimas de restricción.
    1. Diseñar en silico oligonucleótidos directos e inversos en regiones de rotura para genes de tipo salvaje y ampR , respectivamente. Sustituir in silico el fragmento de tipo salvaje para su correspondiente secuencia de ADN sinónimo (obtenida en el paso 1.4).
      NOTA: Esta secuencia de ADN sinónimo contiene un sitio de enzima de restricción. Los oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás se solapan en tSitio de la enzima de restricción. Los oligonucleótidos deben oscilar entre 21-27 nucleótidos, terminar con una citosina o guanina, y contener un sitio de enzima de restricción. Un oligonucleótido directo tiene la misma secuencia que su región diana sobre el ADN molde. Un oligonucleótido inverso es la secuencia complementaria inversa de la región diana sobre el ADN molde.
    2. Utilizar las dos construcciones de genes de tipo salvaje como la plantilla de ADN para reacciones de PCR ( por ejemplo, pUC18 rpoD y pUC18 sigA ). Obtener dos partes complementarias de cada construcción (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2, y pUC18 sigA σ3-σ4) ( Figura 1 , etapa 6).
    3. Cargar muestras de ADN en un gel de agarosa 1-1,2% [p / v]. Separar los productos de PCR de la plantilla de ADN mediante electroforesis ( por ejemplo, 110 V durante 1 h). Alternativamente, digerir las reacciones de PCR con Dpn I para romper la plantilla de ADN.
      NOTA: DpnI sólo reconoce secuencias de ADN metiladas (5'-GATC-3 ').
      1. Purificar las muestras utilizando un kit de purificación de ADN. Siga las instrucciones del fabricante.
    4. Doble digerir todos los fragmentos de ADN complementarios con las enzimas de restricción apropiadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Use enzimas de restricción de digestión rápida cuando sea posible. Por ejemplo, digerir doblemente el fragmento de ADN pUC18rpoDσ1-σ2 con Afl II y Spe I usando el protocolo del fabricante. Dejar la reacción de digestión a 37 ° C durante 15 min.
    5. Inactivar las enzimas de restricción de acuerdo con las directrices del fabricante. Por ejemplo, inactivar Afl II- Spe I a 80 ° C durante 20 min.
  7. Recuperación de plásmido utilizando ligación de ADN y transformación bacteriana.
    1. Mezclar los fragmentos de ADN adecuados en una proporción volumétrica de 1: 1 para ensamblar el gen quimérico deseado ( Figura1, etapa 7).
      NOTA: De este modo, se restaura la integridad del gen ampR , produciendo una proteína funcional.
      1. Por ejemplo, mezclar 4 μL de ADN pUC18 rpoD σ1-σ2 (digerido con Afl II- Spe I, 150 ng / μl), 4 μl de ADN pUC18 sigA σ3-σ4 ( Afl II- Spe I, 150 ng / μl) 10 μl de 2x tampón, 2 μL de agua ultrapura y 1 μl de T4 DNA ligasa; La concentración de ADN después de la purificación del kit es suficiente para la digestión y posterior ligadura. Dejar la reacción de ligadura a 25 ° C durante 10 min.
    2. Transformar E. coli DH5α con 3-5 μL de la reacción de ligación del conjunto quimérico (Materiales Complementarios). Cultivar las células transformantes en LB / Amp / X-gal / IPTG placas durante la noche a 37 ° C durante la noche.
    3. Seleccione las colonias de E. coli transformantes de color blanco y pétalas en una nueva placa LB / Amp. Dejar las placas durante la noche a 37ºC.DO.
    4. Realice una PCR de colonia para elegir candidatos para una reacción de secuenciación, como se describe en los Materiales Complementarios. Visualizar las bandas en un gel de agarosa al 1-1,2% (p / v) realizando electroforesis (descrita en el paso 2.3.2.1).
    5. Cultivar culturas de candidatos positivos. Extraer ADN de plásmido de ellos utilizando un kit de purificación de ADN plasmídico.

2. Construcciones Quiméricas de Candidatos de Secuencia

  1. Asegúrese de que la calidad del ADN plasmídico es lo suficientemente buena para la reacción de secuenciación siguiendo las directrices de la secuencia del proveedor de servicios. Extraer el ADN utilizando kits de purificación. Por ejemplo, en la página de Internet de la secuencia del proveedor de servicios, preste especial atención a la concentración de ADN recomendada para las muestras. Obtener la concentración de muestras utilizando un instrumento de cuantificación de ADN.
  2. Secuencia de construcciones quiméricas candidatas con un proveedor de servicios de secuenciación 10 .
  3. Ensamblar Quencing lee con un ensamblador de ADN in silico 11 .
  4. Alinear secuencias quiméricas diseñadas ensambladas en silico usando herramientas de alineación de secuencias 9 , 12 . Verificar que el gen quimérico se fusionó satisfactoriamente.

3. Hacer Preparaciones

NOTA: Todos los pasos que involucran células vivas deben realizarse en una campana de flujo laminar limpio con el quemador Bunsen encendido.

  1. Producción de células competentes de E. coli DH5α.
    1. Para producir células compatibles con E. coli , siga los protocolos publicados 13 o vea los Materiales Complementarios . Alternativamente, utilice células competentes comercialmente disponibles.
  2. Transformación de células competentes de DH5α de E. coli .
    1. Para la transformación química de cultivos de E. coli , siga los protocolos publicadosClass = "xref"> 13 o vea los Materiales Complementarios . Alternativamente, use la electroporación para la transformación bacteriana. Si se utilizan células competentes comercialmente disponibles, siga las directrices del fabricante.
  3. Purificación de ADN genómico y plásmido de E. coli DH5α.
    1. Realizar la extracción de ácido nucleico, como se indica en los Materiales Complementarios , utilizando kits comercialmente disponibles o siguiendo protocolos publicados 13 .
  4. Realizar PCR de colonias.
    1. Utilice esta técnica para identificar las colonias transformantes candidatas para la posterior reacción de secuenciación.
      NOTA: Este método no representa una verificación final de la integridad de las secuencias. Una descripción detallada de esta técnica está disponible en los Materiales Complementarios .
  5. Preparación de las soluciones.
    1. Ver Tabla 1 para más información sobre la preparación de la solución.
  6. Descargue los scripts y archivos de secuencia necesarios para el protocolo CAPRRESI.
    1. Descargue archivos de banco de genes que contengan la secuencia completa del genoma de la especie deseada, extraiga la secuencia de ADN del gen elegido usando un navegador genómico y guárdelo en formato de archivo fasta. Descargue los scripts Perl necesarios para el protocolo CAPRRESI. Guarde los scripts y los archivos de secuencia en el mismo directorio.

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Resultados

La figura 1 representa CAPRRESI. Usando este método, se montaron dos genes quiméricos intercambiando los dominios de dos factores sigma bacterianos primarios ( es decir, E. coli RpoD y R. etli SigA). Las secuencias de ADN de los genes rpoD y sigA se obtuvieron utilizando el Artemis Genome Browser 14 de GenBank genoma ficheros NC_000913 y NC_007761, respectivamente. La secuencia de ADN del vector pUC18 se obtuvo ...

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Discusión

CAPRRESI fue diseñado como una alternativa al PRM 2 . El PRM original es una técnica poderosa; Permite la fusión de secuencias de ADN a lo largo de cualquier parte de los genes seleccionados. Para PRM, los genes de tipo salvaje deben ser clonados en el mismo plásmido. Después de eso, los oligonucleótidos están diseñados dentro de genes de resistencia a antibióticos y de tipo salvaje encontrados en el plásmido. La ruptura del plásmido se consigue por PCR usando polimerasas de ADN de alta fidelidad...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (otorgamiento número 154833) y la Universidad Nacional Autónoma de México. Los autores desean agradecer a Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos y Soledad Juárez por su asesoramiento administrativo y técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Platinum Taq DNA Polymerasa de alta fidelidadThermo Fisher11304011Produce una mezcla de productos de PCR con saliente romo/3'-A Kit de aislamiento de
plásmidos de alta purezaRoche11754785001Se utiliza para todas las reacciones de purificación de plásmidos
Kit de purificación de productos de PCR de alta purezaRoche11732676001Se utiliza para todas las reacciones de purificación de PCR a partir de geles de
agarosaEnzima de restricción AflIINew England BiolabsR0520LReconoce la secuencia 5'-CTTAAG-3' y corta a 37 ° C
KpnI-HF enzima de restricciónNew England BiolabsR3142LReconoce la secuencia 5'-GGTACC-3' y corta a 37 ° C
SpeI-HF enzima de restricciónNew England BiolabsR3133LReconoce la secuencia 5'-ACTAGT-3' y corta a 37 ° Enzima
de restricción C XbaINew England BiolabsR0145LReconoce la secuencia 5'-TCTAGA-3' y corta a 37 ° C
Ampicilina sal sódicaSigma AldrichA0166-5GAntibióticos
Ácido nalidíxicoSigma AldrichN8878-5GAntibióticos
Extracto de levaduraSigma AldrichY1625-1KGCultivo de células bacterianas
Peptona de caseínaSigma Aldrich70171-500GCultivo de células bacterianas
NaClSigma AldrichS9888-1KGcloruro de sodio
AgarSigma Aldrich05040-1KG Cultivo decélulas bacterianas
XbaI enzima de restricciónThermo FisherFD0684Digestión rápida XbaI enzima
KpnI enzima de restricciónThermo FisherFD0524Kit de ligadura rápida de digestión rápida KpnI enzyme
New England BiolabsM2200SKit de ligadura rápida de ADN
AflII enzima de restricciónThermo FisherFD0834Digestión rápida AflII enzyme
SpeI enzima de restricciónThermo FisherFD1253Enzima de digestión rápida SpeI enzyme

Referencias

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  2. Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
  3. Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
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