Este protocolo describe la comparación in vitro de dos características funcionales clave del rituximab: la unión al diana y la inducción de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Los métodos se emplearon para una comparación lado a lado entre el rituximab de referencia y un biosimilar de rituximab. Estos ensayos se pueden emplear durante el desarrollo biosimilar o como un control de calidad en su producción.
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Artículo de método
Métodos in vitro para comparar la unión de diana y la inducción de CDC entre anticuerpos terapéuticos: Aplicaciones en análisis de biosimilitud
En este artículo
Resumen
Resumen
anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs) son relevantes para el tratamiento de diferentes patologías, incluyendo los cánceres. El desarrollo de anticuerpos monoclonales biosimilares por las compañías farmacéuticas es una oportunidad de mercado, pero también es una estrategia para aumentar la accesibilidad de drogas y reducir los costes asociados a la terapia. Los protocolos detallados aquí describen la evaluación de unión a la diana y la inducción CDC por rituximab en células Daudi. Estas dos funciones requieren diferentes regiones estructurales del anticuerpo y son relevantes para el efecto clínico inducida por rituximab. Los protocolos permiten la comparación de lado a lado de un rituximab referencia y un biosimilar rituximab comercializado. Los productos evaluados mostraron diferencias tanto en unión a la diana y la inducción CDC, lo que sugiere que hay diferencias fisicoquímicas subyacentes y poner de relieve la necesidad de analizar el impacto de esas diferencias en el entorno clínico. Los métodos aquí presentados constituyen simple y barato in vitro </ Em> para la evaluación de la actividad de rituximab biosimilares. Por lo tanto, pueden ser útiles durante el desarrollo biosimilar, así como para el control de calidad en la producción biosimilar. Además, los métodos presentados pueden extrapolarse a otros mAbs terapéuticos.
Introducción
Los anticuerpos terapéuticos son anticuerpos monoclonales recombinantes (mAbs) desarrollados para el tratamiento de diferentes patologías, incluyendo cánceres, enfermedades autoinmunes y crónicas, trastornos neurológicos y otros 1 . Actualmente, la FDA ha concedido la aprobación a más de 40 mAb terapéuticos, y se espera que lleguen más al mercado en los años siguientes.
Rituximab es un anticuerpo IgG1 monoclonal quimérico de alta afinidad aprobado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin de células B CD20 + , LNH folicular CD20 + , leucemia linfocítica crónica y artritis reumatoide
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Protocolo
1. Evaluación de la unión de diana por citometría de flujo
- Preparación de materiales biológicos y reactivos
- Hacer 500 mL de medio de cultivo RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (H-IFBS).
- Cultivo de linfoma Daudi Burkitt (Daudi) y células Daudi GFP + usando RPMI y frascos de cultivo de 75 cm2. Mantener los cultivos a 37 ° C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 hasta que alcancen 6 - 9 x 105 células / ml.
- Hacer 50 ml de tampón de tinción diluyendo 1/100 H-IFBS en PBS; Este tampón es estable a 2-8 ° C durante al menos un mes.
- Preparar las soluciones de pr....
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Resultados
Usando los protocolos descritos anteriormente, se comparó la unión de diana y la inducción de CDC de rituximab de referencia en paralelo con las de un rituximab biosimilar producido y comercialmente disponible en Asia.
En las células de Daudi, ambos mAbs se unieron a CD20 de una manera dependiente de la concentración ( Figura 1D ). Las regresiones no lineales de datos de unión mostró un r 2 de 0,978.......
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Discusión
La expiración de la patente de un mAb terapéutico está promoviendo el desarrollo de los biosimilares. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos simples que pueden identificar diferencias en las actividades de relevancia clínica de estos productos. Se emplearon células CD20 + cultivadas para la evaluación de dos características funcionales clave de rituximab: unión a la diana y la inducción CDC. La actividad anterior requiere el reconocimiento de CD20 por la región Fab del mAb, mientras que el último depen.......
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Divulgaciones
N. Salinas-Jazmín, E. González-González, y SM-Pérez Tapia son empleados de UDIBI, que realiza estudios biosimilitud para varias compañías farmacéuticas.
Agradecimientos
Los autores no tienen reconocimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 medio | ATCC | 30-2001 | Modificar el cultivo en función de la línea celular |
| Solución de Azul de Tripano | Sigma | T8154 | 0,4%, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular |
| Células de linfoma de Daudi Burkitt | ATCC CCL-213 | Puede modificar la línea celular en función del anticuerpo de interés | |
| Suero fetal bovino (FBS) | GIBCO | 16000-044 | Puede modificar la fuente de suero en función de los requisitos de la línea celular |
| Suero Humano Normal Complemento | Quidel | A113 | Por lo tanto, es apropiado para su uso en experimentos de biocompatibilidad, incluido el desarrollo de fármacos, pruebas de biomateriales y otras aplicaciones |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | Puede utilizar una amplia gama de opciones de color, compatibles con la mayoría de las configuraciones de instrumentos para analizar la viabilidad. |
| Ratón PECy5 IgG antihumana | BDPharmigen | 551497 | Cambie el fluorocromo en función del filtro y el láser de su citómetro de flujo Control de |
| isotipos de IgG humana | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Cambio en función de mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Tampón de fijación de citometría de flujo (1 - 4% de formaldehído o paraformaldehído) |
| PBS pH 7.4 10x (Tampón de fosfato solución salina) | GIBCO | 70011-044 | Tampón de fosfato sin Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] y libre de endotoxinas. |
| Placas de cultivo celular de 96 pocillos, fondo en V | Corning | 29442-068 | tubos de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm o placas de microtitulación de fondo en V o U de 96 pocillos |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Producto de referencia |
| Rituximab | Indio | — | Producto biosimilar |
| Tubos de centrífuga cónicos de 15 o 50 ml | Corning | 430290 o 430052 | — |
| Puntas de pipeta | Eppendorf | — | Son necesarias varias configuraciones de volumen |
| Pipetas | Eppendorf | — | Son necesarias pipetas de volumen ajustable |
| Centrífuga 5430 / 5430R modelo | Eppendorf | — | Centrífuga refrigerada de velocidad variable (4 a 25 ° C) con velocidades que van de 10 a 30.130 y veces; g |
| Citómetro de flujo | BD Dickinson | — | BD FACSAria III u otro citómetro de flujo |
| Microscopio óptico y óptico Olympus | Olympus | — | Para cuantificar y evaluar el crecimiento celular |
| Incubadora | SANYO | — | Incubadorapara el control de temperatura y CO2 para células de cultivo |
| Cabina de seguridad biológica | CHC BIOLUS | — | Cabina de seguridad biológica que se utiliza para proteger al investigador, el producto y el medio ambiente. |
Referencias
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a P....
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Reimpresiones y permisos
