Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Summary

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Abstract

Cultivo de células en monocapa no modela adecuadamente el comportamiento in vivo de los tejidos, que implica interacciones célula-célula y célula-matriz complejos. Tridimensionales técnicas de cultivo celular (3D) son una innovación reciente desarrollado para hacer frente a las deficiencias de cultivo de células adherentes. Aunque se han desarrollado varias técnicas para la generación de análogos de tejidos in vitro, estos métodos son frecuentemente complejos, caros de establecer, requieren un equipo especializado, y en general están limitados por la compatibilidad con sólo ciertos tipos de células. Aquí, se describe un protocolo rápido y flexible para la agregación de células en esferoides multicelulares 3D de tamaño consistente, que es compatible con el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales y normales. Utilizamos concentraciones variables de suero y metilcelulosa (MC) para promover la generación esferoide independiente de anclaje y evitar la formación de monocapas de células de una manera altamente reproducible. Las condiciones óptimas para Indivlíneas celulares idual se pueden lograr mediante el ajuste de las concentraciones séricas de MC o en el medio de la formación de esferoides. Los esferoides 3D generados pueden ser recogidos para su uso en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la señalización celular o estudios de expresión génica, la detección de drogas candidato, o en el estudio de los procesos celulares, tales como la invasión de células tumorales y la migración. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides clonales de células individuales, y se puede adaptar para evaluar el crecimiento independiente de anclaje y anoikis resistencia. En general, el protocolo proporciona un método fácilmente modificable para la generación y utilización de esferoides de células en 3D con el fin de recapitular el microambiente 3D de los tejidos y modelar el crecimiento in vivo de las células normales y tumorales.

Introduction

Evaluación biológicamente relevantes del comportamiento de las células tumorales es un reto utilizando metodologías tradicionales de cultivo de células de dos dimensiones (2D), en parte debido a que estos no reflejan adecuadamente el microambiente celular encontrado in vivo. Los enfoques alternativos que incorporan componentes de la matriz extracelular en la cultura (por ejemplo, ensayos de cámara de Boyden) son fisiológicamente más representativa de las condiciones del tejido in vivo. Sin embargo, pueden estar limitados a la evaluación de comportamiento de la célula individual, y no recapitulan el complejo en combinaciones in ....

Protocol

NOTA: Todos los reactivos y consumibles se enumeran en la Lista de materiales.

1. Producción del esferoide por agregación de células

1. Solución de metilcelulosa: Preparar 100 ml de 100 mg / ml de metilcelulosa.
   1. Calor 50 ml _{de H2O} ultrapura a 80 ° C. Añadir 10 g de polvo de metilcelulosa y agitar hasta que las partículas se dispersan de manera uniforme.
   2. Llevar al volumen final con ultrapura fría _H2O y se agita a 4 ° C hasta que la solución se vuelva clara, de color pajizo, y no contiene sólidos visibles.
   3. Pasar a través de un filtr....

Results

Se describe un método flexible y eficiente para generar esferoides discretos utilizando placas de células repelentes y medios de formación de esferoides suplementado con MC. Bajo las condiciones apropiadas de MC y el suero, las células individuales se depositan y se adhieren juntos en el centro del pozo para formar esferoides con adhesión mínima a la parte inferior también. Usando este protocolo, esferoides se generan a partir de una variedad de líneas de células (Figura 2B).

Discussion

Presentamos un método rápido y flexible para la producción de esferoides de células 3D para modelar la arquitectura de los tejidos in vivo usando reactivos baratos y ampliamente disponibles. Nuestro protocolo explota las propiedades no citotóxicas y promotores de la adhesión de MC ^{8, 9} para mediar en la agregación de células y minimizar la formación de monocapa celular. A diferencia de matrices a base de proteínas aisladas a partir de fuentes animales, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffers
10x Solución salina tamponada con fosfato	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Solución de cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	21114	utilizada para tampón de lavado PBS+; No autoclave el tampón de lavado PBS+ al agregar cloruro de calcio
Solución de cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M1028	utilizado para tampón de lavado PBS+; No autoclave el tampón de lavado PBS+ al agregar cloruro de magnesio
Nombre	Empresa	>Número de catálogo	Comentarios
>Para la formación de esferoides
96 pocillos Placa repelente de células con fondo en U	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Sigma-Aldrich	D5546	Para el cultivo de las líneas celulares SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1
Medio F12K	Thermo Fisher Scientific 2112722		para el cultivo de la línea celular TT
Suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	F1051	Filtrar antes de usar para eliminar las partículas contaminantes
Metilcelulosa	Sigma-Aldrich	M7027	Preparar en agua a 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medio	Sigma-Aldrich	R8758	Para el cultivo de líneas celulares HCT-116, BxPC-3
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Tampón de disociación
Name	Company	Número de catálogo	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1 mg/mL; Mantener en hielo cuando está en uso
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Menos fluorescencia de fondo en comparación con el medio suplementado con rojo de fenol
Factor neurotrófico derivado de la línea celular glial	Peprotech	450-10	Quimioatrayente
Nombre	Empresa	>Número de catálogo	Comentarios
Para microscopía de inmunofluorescencia
#1.5 Coverglass	Electrónica Microscopy Sciences	72225-01	Para el montaje de esferoides extirpados
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Se utiliza para teñir la actina a 1:200
Albúmina sérica bovina	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Utilizado en tampón de bloqueo BSA
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	antidecoloración
	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Utilizado en el medio de montaje MOWIOL
ImageJ Software	Freeware, NIH-Utilizado		para el análisis de imágenes
Microportaobjetos	VWR International	48312-024	Para el montaje de esferoides extirpados
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Utilizado en el medio de montaje MOWIOL
Paraformaldehído	EMD-Millipore	PX0055-3	Utilizado en tampón de fijación
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Utilizado en tampón de permeabilización