Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Summary

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Abstract

Cultivo de células en monocapa no modela adecuadamente el comportamiento in vivo de los tejidos, que implica interacciones célula-célula y célula-matriz complejos. Tridimensionales técnicas de cultivo celular (3D) son una innovación reciente desarrollado para hacer frente a las deficiencias de cultivo de células adherentes. Aunque se han desarrollado varias técnicas para la generación de análogos de tejidos in vitro, estos métodos son frecuentemente complejos, caros de establecer, requieren un equipo especializado, y en general están limitados por la compatibilidad con sólo ciertos tipos de células. Aquí, se describe un protocolo rápido y flexible para la agregación de células en esferoides multicelulares 3D de tamaño consistente, que es compatible con el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales y normales. Utilizamos concentraciones variables de suero y metilcelulosa (MC) para promover la generación esferoide independiente de anclaje y evitar la formación de monocapas de células de una manera altamente reproducible. Las condiciones óptimas para Indivlíneas celulares idual se pueden lograr mediante el ajuste de las concentraciones séricas de MC o en el medio de la formación de esferoides. Los esferoides 3D generados pueden ser recogidos para su uso en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la señalización celular o estudios de expresión génica, la detección de drogas candidato, o en el estudio de los procesos celulares, tales como la invasión de células tumorales y la migración. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides clonales de células individuales, y se puede adaptar para evaluar el crecimiento independiente de anclaje y anoikis resistencia. En general, el protocolo proporciona un método fácilmente modificable para la generación y utilización de esferoides de células en 3D con el fin de recapitular el microambiente 3D de los tejidos y modelar el crecimiento in vivo de las células normales y tumorales.

Introduction

Evaluación biológicamente relevantes del comportamiento de las células tumorales es un reto utilizando metodologías tradicionales de cultivo de células de dos dimensiones (2D), en parte debido a que estos no reflejan adecuadamente el microambiente celular encontrado in vivo. Los enfoques alternativos que incorporan componentes de la matriz extracelular en la cultura (por ejemplo, ensayos de cámara de Boyden) son fisiológicamente más representativa de las condiciones del tejido in vivo. Sin embargo, pueden estar limitados a la evaluación de comportamiento de la célula individual, y no recapitulan el complejo en combinaciones in vivo de célula-matriz y célula-célula interacciones que contribuyen a tejido o tumor de crecimiento ^{1, 2, 3.}

El uso de esferoides multicelulares es un enfoque reciente que reproduce con mayor precisión la arquitectura compacta de crecimiento in vivo de células ^1,4. Los esferoides se pueden utilizar para investigar las interacciones célula-matriz de las células normales, pero también pueden actuar como análogos tumorales para modelar características de la progresión del tumor, como el crecimiento metastásico o resistencia a los medicamentos ^4.

Los esferoides pueden formarse por la proliferación de células individuales embebidos en una matriz de ^5, o más rápidamente, mediante la promoción de la agregación de múltiples células para formar un clúster sola célula (por ejemplo, gota colgante, métodos de centrifugación) ^{6, 7.} técnicas de agregación de células existentes pueden requerir materiales costosos o equipo especializado. Además, estos esferoides tienen una amplia gama de tamaños y morfologías y pueden ser difíciles de producir en grandes cantidades, haciendo las comparaciones entre las condiciones de crecimiento o tratamientos difíciles. Finalmente, esferoides generados por estos métodos pueden ser difíciles de aislar de la extracel proteináceolular matriz en la que están inmersos para su uso en otras aplicaciones.

A continuación, se describe un método de agregación celular robusto y fácilmente modificable para la rápida formación de esferoides de células de tamaño constantemente utilizando placas disponibles comercialmente de fondo en U de células repelente y una matriz inerte que promueve la adhesión, metil celulosa. Una vez formados, estos esferoides multicelulares son fácilmente aislados para su uso en una amplia gama de aplicaciones. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides a través de la proliferación celular, que puede utilizarse para evaluar otros procesos celulares. Aquí, se muestra ensayos de invasión celular, cuantificados mediante tinción de inmunofluorescencia, y un ensayo de anoikis, como ejemplo, las aplicaciones de estos dos protocolos diferentes de formación de esferoides.

Protocol

NOTA: Todos los reactivos y consumibles se enumeran en la Lista de materiales.

1. Producción del esferoide por agregación de células

1. Solución de metilcelulosa: Preparar 100 ml de 100 mg / ml de metilcelulosa.
   1. Calor 50 ml _{de H2O} ultrapura a 80 ° C. Añadir 10 g de polvo de metilcelulosa y agitar hasta que las partículas se dispersan de manera uniforme.
   2. Llevar al volumen final con ultrapura fría _H2O y se agita a 4 ° C hasta que la solución se vuelva clara, de color pajizo, y no contiene sólidos visibles.
   3. Pasar a través de un filtro de 0,45 micras para eliminar los sólidos no disueltos. solución preparada puede ser alícuotas y se almacenó a 4 ° C durante un máximo de 12 meses.
      NOTA: celulosa de metilo sirve como un no citotóxico,, agente inerte de suspensión para mejorar la adhesión célula-célula y desalentar la formación de una monocapa de células adherentes. Metil celulosa es soluble en agua y se puede lavar siguiente sphergeneración de OID.
2. Medio la formación de esferoides
   NOTA: Preparar medio de la formación de esferoides inmediatamente antes de su uso. No almacene.
   1. Diluir solución de celulosa de metilo a 1-5 mg / ml en el medio de cultivo apropiado.
   2. Pasar a través de un filtro de 0,22 micras para esterilizar y eliminar los sólidos no disueltos.
3. Salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)
   1. Diluir a 1X y pasar a través de un filtro de 0,45 micras antes de su uso. solución preparada puede almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente.
4. La producción de esferoides de células (Figura 1)
   NOTA: Preparar todos los reactivos de antemano. Es importante evitar la contaminación de las soluciones por el polvo, fibras u otras partículas insolubles. La presencia de estos contaminantes afectará negativamente a la formación de esferoides. El medio de cultivo y otras soluciones se deben pasar a través de un filtro de 0,45 micras para eliminar estas partículas cuando possible. Evitar el uso de pipetas filtrada de algodón al transferir soluciones ya que estos pueden introducir fibras adicionales.
   1. monocapas de células de cultivo a 70% de confluencia en el cultivo apropiado medio suplementado con 10% de suero. Aspirar el medio de cultivo y enjuague con 1x PBS para eliminar los residuos. Añadir 3 ml de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina) tampón de disociación a una placa de cultivo celular de 10 cm, e incubar las células a 37 ° C y 5% de _CO2.
   2. Inspeccionar las células bajo el microscopio a 10 aumentos confirmar desprendimiento. Neutralizar tampón de disociación con 7 ml de medio de cultivo suplementado con suero.
   3. suspensión de células Centrifugar a 500 xg durante 10 min a las células suavemente de pellets.
   4. Se retira el sobrenadante. sedimento celular Resuspender en 1 ml de medio de la formación de esferoides utilizando una pipeta p1000 con una punta de filtro.
      NOTA: La suspensión celular debe estar libre de grumos.
      1. Para triturar sedimento celular, presione la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo en un ligero ángulo mientraspipeteado para esquilar sedimento celular. Evitar trituración más de 3 - 5 veces ya que esto puede dañar las células. Pipeta lentamente y no expulsan a todo el contenido de la punta de la pipeta para evitar la creación de burbujas.
   5. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y se diluye la suspensión de células a 1 x 10 ⁴ células / ml.
      NOTA: El número de células puede ser optimizado para generar esferoides de diferentes tamaños. Tinción con azul tripán de las células dañadas se puede usar para confirmar la viabilidad de las células resuspendidas.
   6. suspensión celular traslado a un depósito multicanal pipeta estéril, libre de polvo y utilizar puntas con filtro para dispensar 100 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de células repelente de fondo en U.
      1. Depósito de enjuague con filtrada _H2O ultrapura para eliminar el polvo y las fibras.
      2. Mezclar la suspensión de células periódicamente mientras la siembra para evitar que las células de depositarse en el fondo del depósito. Para evitar la creación de burbujas, utilice una técnica de pipeteado inverso mientras se mezcla y dispensingramo.
   7. Placas de transferencia a la incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C y 5% de _CO2) e inspeccionar todos los días para la formación de esferoides. Las células deben depositarse en el fondo de cada pocillo en las 6 h y, en general agregarse en un esferoide entre las 24-48 h (Figura 2).
   8. Para la confirmación de la formación de esferoides éxito, utilizar una punta de p10 y suavemente la pipeta medio sobre el esferoide mientras se observa bajo un microscopio a un aumento de 10X. Esferoides adecuadamente formados se afloje de la placa y rollo, lo que confirma su estructura 3D.
      NOTA: metilcelulosa y las concentraciones séricas deben ser determinados por titulación para cada línea celular para producir la formación de un solo esferoide por pocillo. Condiciones optimizadas de esta manera para líneas celulares seleccionadas se muestran en la Tabla 1, y ejemplos de los esferoides formados en la Figura 2B. Esferoides pueden ser cultivadas durante más tiempo que el indicado pero a medida que se hacen más grandes que crecen progresivamente más difícilpara manejar sin fragmentación. Si las células forman una monocapa, esferoides satélite, o no se depositan en el fondo del pozo, puede ser necesario ajustar aún más para la formación óptima de esferoides (Figura 3B) la concentración de metilcelulosa y suero. No utilice esferoides que contienen contaminantes, tales como fibras o polvo (Figura 3A). esferoides preformada se pueden tratar con los compuestos de interés, tales como factores de crecimiento, las manchas de células vivas, o inhibidores para el análisis.

2. Esferoide Invasion de ensayo (Figura 4)

1. colágeno neutralizado
   1. Enfriar todos los líquidos a 4 ° C y mantener en hielo cuando se trabaja con colágeno para evitar la polimerización no deseada.
   2. Preparar frescos 0,1 M y 0,01 M de NaOH y soluciones frescas HCl 0,1 M en _H2O ultrapura Pasar todas las soluciones a través de filtros de 0,22 micras.
   3. Mezclar bovino tipo 1 colágeno (3,1 mg / ml de solución madre), M NaOH 0,01 y 10x PBS (8: 1: 1 relación en volumen) y ajustar el pH a 7,4 usando NaOH frío 0,1 M y HCl. La concentración final de colágeno es 2,5 mg / mL.
   4. Preparar suficiente colágeno neutralizado para llenar el recipiente de formación de imágenes a una profundidad de 2-3 mm. Se requiere un mínimo de 100 l de cada pocillo de la diapositiva cámara de cultivo de tejidos de 8 pocillos enumerados en la Lista de Materiales.
2. Incorporación de esferoides en el colágeno (Figura 4)
   1. Cubrir el fondo de cada pocillo de un porta cámara de cultivo de tejidos de 8 pocillos con un mínimo de 50 l de colágeno neutralizado.
      1. Utilice la técnica de pipeteo inverso para evitar la creación de burbujas en el colágeno. Utilice la punta de la pipeta para difundir el colágeno de manera uniforme sobre la superficie del pocillo.
         NOTA: Esta capa base de colágeno se mantenga esferoides en suspensión y es típicamente de 1-2 mm de espesor. La capa de base minimiza la formación de un menisco en la capa de colágeno superior. Si la capa de base es demasiado delgada, esferoides pueden hacer contacto con la parte inferior de la corredera de cámara yformar una monocapa de células.
   2. Colocar el portaobjetos de cámara, y una placa de cultivo de tejido de 35 mm llena de ultrapura H ₂ O, en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos. Incubar a 37 ° C hasta que se polimeriza el colágeno, típicamente 1 h. Almacenar el remanente neutralizada de colágeno en hielo.
      NOTA: El plato lleno de agua 35 mm proporcionará la humedad y evitar que se seque. La cámara de diapositivas debe permanecer en esta cámara de humedad durante todo el ensayo. La capa de base de colágeno se puede dejar para polimerizar durante la noche. incubaciones más largas dan lugar típicamente a un gel más rígido.
   3. El uso de un filtro de boquilla P1,000, recoger esferoides preformadas (paso 1.4.7) de la placa de células repelente de 96 pocillos de fondo en U en 1,5 ml complemento tubos superiores. Pipeta lentamente y evitar repetir o pipeteo vigoroso para reducir al mínimo los fluidos esquila de esferoides. Múltiples esferoides pueden ser agrupados en un único tubo para la transferencia a un pocillo de los 8 pocillos de cultivo de tejidos de diapositivas cámara.
   4. Centrifugar los esferoides recogidos en un tablETOP microcentrífuga a 2.000 xg durante 2-5 s y Aspirar el sobrenadante con una pipeta P200. Evitar centrifugación durante más tiempo de lo necesario, ya que esto puede causar que los esferoides se rompan o se agrupan juntos.
      NOTA: Después de pipetear la mayor parte del sobrenadante, el tubo puede ser invertida con cuidado sobre una toalla de papel limpia para absorber el exceso de líquido. No permita que los esferoides se sequen.
   5. Con una punta de taladro p200 amplia, resuspender suavemente esferoides en 50 l de colágeno neutralizado. Haga esto para cada tubo de esferoides recogidos antes de que los esferoides se transfieren a la cámara de diapositivas. Mantenga esferoides que han sido resuspendidas en el colágeno neutralizado en hielo hasta que esté listo para su transferencia a la cámara de diapositivas.
   6. Retire la diapositiva cámara de la incubadora y la pipeta con cuidado la mezcla esferoide-colágeno en la parte superior de la capa de base de colágeno. Incubar a 37 ° C y 5% de CO ₂ hasta que se polimeriza colágeno.
      1. No inyectar todo el contenido de la pipeta para evitar la creación de burbujas. Dropwise pipeteo reduce las posibilidades de perturbar la capa de base de colágeno.
   7. Añadir lentamente un mínimo de 100 l calentado que contiene medio de cultivo quimioatrayentes deseados, inhibidores, u otros tratamientos a cada pocillo de la diapositiva cámara. Los esferoides que contienen capa de colágeno pueden romperse si el líquido se pipeta en ella con demasiada fuerza. El medio de cultivo se puede prescindir lentamente por el lado de un pozo para evitar perturbar el colágeno.
   8. Incubar diapositiva cámara a 37 ° C y 5% de CO ₂ para permitir la invasión celular. invasión celular en el colágeno circundante puede ser observado por campo claro o fluorescencia de formación de imágenes y se cuantificó mediante una variedad de métodos que utilizan epifluorescencia, microscopía confocal o de lámina de luz.

3. La cuantificación de la invasión: Microscopía de campo claro

1. A intervalos de tiempo establecidos, la imagen esferoides colágeno-incrustado en un aumento de 10X utilizando un microscopio de campo claro (paso 2.2.8).
   NOTA: Paraexperimentos de células en vivo a largo plazo, una platina de microscopio calentado y CO ₂ cámara regulada se pueden utilizar para mantener esferoides a 37 ° C y CO ₂ mientras que las imágenes 5%.
2. Cuantificar la invasividad utilizando software como ImageJ para medir el número de células invasoras en el colágeno circundante y la distancia media invadido en cada punto de tiempo.

4. Cuantificación de la invasión: microscopía de fluorescencia con manchas de células vivas

1. Después de la etapa 2.2.8, complementar el medio en los portaobjetos de cámara con una mancha fluorescente tal como DAPI, calceína AM, u otro compuesto de seguimiento de celda apropiada para la línea celular según las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Para la cuantificación de invasividad, tinción homogénea en todo el esferoide no es esencial. Para aplicaciones que requieren una penetración más profunda de las manchas, las incubaciones más largas (> 3 h) puede ser necesario.
2. Quitar la mancha y reemplazar con 500 l de PBS 1x tibia. EnCubate a 37 ° C durante 10 min para eliminar el exceso de colorante. Repetir un mínimo de dos veces.
3. El uso de un microscopio de fluorescencia, adquirir secciones ópticas a través de los esferoides invasores.
   NOTA: La exposición prolongada a la luz láser debe reducirse al mínimo durante la exposición repetitiva a limitar la fototoxicidad y photobleaching.
4. Utilizar software como ImageJ para generar una Z-proyección, que puede ser utilizado para cuantificar el área total del esferoide, el número de células invasoras, y distancias invadieron en la matriz de colágeno.
5. Como ejemplo, para cuantificar la invasión, ajustar el umbral de la imagen para excluir fondo, destacando sólo el esferoide y células invasoras, y medir su área. El área del esferoide original puede ser restado de este total para cuantificar la invasividad.

5. La cuantificación de la invasión: Inmunofluorescencia

NOTA: Todas las soluciones y tampones deben ser pasados ​​a través de un filtro de 0,45 micras antes de su uso a remocinco restos, que puede afectar negativamente a la tinción.

1. Preparar el tampón de lavado PBS ^+. Preparar 1x PBS y añadir CaCl ₂ y MgCl ₂ a una concentración final de 0,1 mM. No esterilizar en autoclave búfer después se añaden _CaCl2 y _MgCl2. Solución puede ser esterilizada por filtración y se almacena a temperatura ambiente.
2. Prepare el buffer de la fijación en formalina tamponada neutra (NBF). Añadir 5 gotas de NaOH 1 M a 0,6 g de paraformaldehído. Llevar a 20 ml con PBS y se incuba a ⁺ 60 ° C hasta que se disuelve paraformaldehído (aproximadamente 1 h). Enfriar a temperatura ambiente y ajustar el pH a 7,4 con HCl 1 M.
   NOTA: tampón de fijación NBF debe prepararse inmediatamente antes de su uso.
3. Preparar albúmina de suero bovino (BSA) tampón de bloqueo. Disolver BSA en PBS ⁺ a 3% w / v. Solución puede ser esterilizada por filtración y se almacenó a 4 ° C durante varios días, pero se prepara mejor fresco. No caliente.
4. Preparar permeabilización buffer. Diluir Triton X-100a 0,2% v / v en PBS ^+.
   NOTA: La permeabilización de amortiguación debe prepararse inmediatamente antes de su uso.
5. Opcionalmente, preparar el medio de montaje Mowiol. Combinar 2,4 g Mowiol, 6 g de glicerol, y 6 ml ultrapura H ₂ O. mezclar durante 3 h en un rotador a temperatura ambiente. Añadir 12 ml de 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Incubar con agitación a 50 ° C durante 10 min.
   1. Centrifugar a 5000 xg durante 15 min para sedimentar el material insoluble. Añadir agente anti-blanqueo, tales como DABCO 2,5%. Almacenar en 500 alícuotas a -20 ° C.
6. La tinción de inmunofluorescencia de esferoides (Figura 5)
   NOTA: Utilice una pipeta para añadir o eliminar líquidos lentamente a partir de diapositivas cámara. Evitar el uso de un aspirador, ya que esto puede alterar la capa de colágeno.
   1. Preparar esferoides e incrustarlo en la cámara de diapositivas de colágeno llena, como se describe en las secciones 1 a 2.
      NOTA: autofluorescencia El colágeno puede ser minimizado mediante el uso de capas finas o pequeños volúmenes de collagen.
   2. Eliminar la mayor cantidad de medio de cultivo como sea posible de cada diapositiva cámara.
   3. Brevemente enjuague capa de colágeno con 500 l de tampón de lavado PBS ⁺ para eliminar medio residual.
   4. Añadir 500 l de PBS ⁺ tampón de lavado a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 5 min para lavar esferoides. Repetir dos veces.
   5. Reemplazar ⁺ tampón de lavado PBS con 500 l de tampón de fijación NBF. Incubar a temperatura ambiente durante 20-25 min.
   6. Eliminar el tampón de fijación NBF y enjuague con 500 l de tampón de lavado PBS ^+. Lavar durante 5 minutos con PBS fresca ⁺ tampón de lavado de un mínimo de 3 veces.
      NOTA: Se ha corregido esferoides se pueden almacenar a 4 ° C en tampón de lavado ⁺ PBS fresco durante varios días. 0,01% de azida de sodio puede ser añadido a la solución de lavado para inhibir el crecimiento microbiano durante el almacenamiento.
   7. Reemplazar PBS ⁺ tampón de lavado con 500 l de tampón de permeabilización. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 min.
   8. Reemplazar tampón de permeabilización con 500 l de BSA tampón de bloqueo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h.
      1. Opcionalmente, eliminar el tampón de bloqueo BSA. El uso de bisturí o unas tijeras, esferoides especiales y el 3 mm alrededores x 3 mm de la capa de colágeno. Con una punta de taladro p1000 amplia, desalojar el bloque escindido del colágeno de un enjuague suavemente con tampón de bloqueo BSA fresco. Transferir el bloque de colágeno para tubo de 1,5 ml.
      2. Se centrifuga a 2.000 xg durante 2 minutos y retirar el sobrenadante. El tubo se puede invertir cuidadosamente sobre la toalla de papel limpia para absorber el exceso de líquido.
   9. Añadir anticuerpo primario a esferoides y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h. Añadir un volumen suficiente de anticuerpo primario de tal manera que toda la capa de colágeno se sumerge de manera uniforme. Las etapas opcionales anteriores (5.6.8.1-5.6.8.2) típicamente permiten el uso de volúmenes más pequeños de anticuerpo.
   10. Sumergir cámara de diapositivas en un recipiente con al menos 10 ml de PBS ⁺ buf de lavadofer durante 10 min para lavar. Repetir un mínimo de dos veces.
       1. Opcional, en caso esferoides fueron extirpados de capa de colágeno anteriormente (Paso 5.6.8.1), añadir un mínimo de 1 ml de PBS ⁺ tampón de lavado al tubo de 1,5 ml y agitar suavemente. Dejar en remojo durante un mínimo de 10 min.
       2. Eliminar la mayor cantidad ⁺ tampón de lavado PBS como sea posible y repetir el lavado con PBS ⁺ tampón de lavado un mínimo de dos veces. Se centrifuga a 2.000 g durante varios minutos para sedimentar bloque de colágeno.
          NOTA: Limpiar las superficies exteriores de la diapositiva cámara de limpieza con etanol al 70% antes de sumergirse en tampón de lavado.
   11. Repita los pasos 5.6.9-5.6.10 utilizando anticuerpo secundario apropiado.
       NOTA: Si esferoides se tiñeron directamente en el recipiente de formación de imágenes, vaya al paso 5.6.13.
   12. Opcional, en caso esferoides fueron extirpados de capa de colágeno anteriormente (paso 5.6.8.1), portaobjetos de vidrio limpio y compatible con cubreobjetos de microscopía confocal con un 70% de etanol.
       1. Eliminar la mayor cantidad de tampón de lavado como sea posible desde el bloque de colágeno y resuspender en ultrapura H ₂ O. Realizar este paso inmediatamente antes del montaje. No deje bloques manchados remojo en agua.
       2. El uso de pinzas de punta fina, agarre borde de bloque de colágeno y traslado al portaobjetos de vidrio.
       3. Usando los fórceps para sostener el colágeno en el lugar, utilizar un hisopo de algodón limpio para absorber el exceso de líquido desde el bloque de colágeno, asegurándose de no tocar el colágeno directamente.
          NOTA: Si el colágeno se atasca al hisopo de algodón que se puede quitar con cuidado, ya sea usando fórceps, o sumergiendo en agua.
   13. Utilizando una técnica de pipeteo inverso, dispensar 100 l medio de montaje Mowiol sobre el bloque de colágeno y lugar cubreobjetos sobre la muestra.
       1. Use un hisopo de algodón o toalla de papel para absorber el exceso de medio de montaje Mowiol® y agua de debajo del cubreobjetos.
       2. Permitir medio de montaje Mowiol para endurecer durante la noche a 4 °C. Sello bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.
   14. Image esferoides teñidas utilizando confocal o microscopía de fluorescencia para observar la localización de proteínas de interés, la formación de estructuras invasoras, etc. (figuras 5B, 5C).
       NOTA: manchado esferoides deben ser protegidos de la luz para evitar photobleaching.

6. Ensayo Anoikis

NOTA: El protocolo de formación de esferoides se adapta fácilmente para cuantificar el crecimiento independiente de anclaje y resistencia anoikis en una variedad de tipos de células.

1. Siembra de las células para el ensayo de anoikis (Figura 6)
   1. Siga las instrucciones para la producción de esferoides en la sección 1.4 pero el uso de un mínimo de 30 mg / ml de metilcelulosa para preparar el medio la formación de esferoides.
      NOTA: cuando se calienta, 30 mg / ml de metilcelulosa debe producir un gel espeso que mantiene las células en suspensión.
   2. Se incuban las células durante varios días a semanas y enSPECT con regularidad en un aumento de 10X usando un microscopio. Las células que resisten la anoikis deben proliferar y formar colonias.
   3. Cuantificar anoikis midiendo el número y tamaño de las colonias formadas en cada pocillo.
      NOTA: Una vez que se forman colonias, pueden ser lavadas para eliminar la metil celulosa y se usan para ensayos basados ​​en esferoides, como se describe.

Results

Se describe un método flexible y eficiente para generar esferoides discretos utilizando placas de células repelentes y medios de formación de esferoides suplementado con MC. Bajo las condiciones apropiadas de MC y el suero, las células individuales se depositan y se adhieren juntos en el centro del pozo para formar esferoides con adhesión mínima a la parte inferior también. Usando este protocolo, esferoides se generan a partir de una variedad de líneas de células (Figura 2B).

Discussion

Presentamos un método rápido y flexible para la producción de esferoides de células 3D para modelar la arquitectura de los tejidos in vivo usando reactivos baratos y ampliamente disponibles. Nuestro protocolo explota las propiedades no citotóxicas y promotores de la adhesión de MC ^{8, 9} para mediar en la agregación de células y minimizar la formación de monocapa celular. A diferencia de matrices a base de proteínas aisladas a partir de fuentes animales, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffers
10x Solución salina tamponada con fosfato	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Solución de cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	21114	utilizada para tampón de lavado PBS+; No autoclave el tampón de lavado PBS+ al agregar cloruro de calcio
Solución de cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M1028	utilizado para tampón de lavado PBS+; No autoclave el tampón de lavado PBS+ al agregar cloruro de magnesio
Nombre	Empresa	>Número de catálogo	Comentarios
>Para la formación de esferoides
96 pocillos Placa repelente de células con fondo en U	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Sigma-Aldrich	D5546	Para el cultivo de las líneas celulares SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1
Medio F12K	Thermo Fisher Scientific 2112722		para el cultivo de la línea celular TT
Suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	F1051	Filtrar antes de usar para eliminar las partículas contaminantes
Metilcelulosa	Sigma-Aldrich	M7027	Preparar en agua a 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medio	Sigma-Aldrich	R8758	Para el cultivo de líneas celulares HCT-116, BxPC-3
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Tampón de disociación
Name	Company	Número de catálogo	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1 mg/mL; Mantener en hielo cuando está en uso
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Menos fluorescencia de fondo en comparación con el medio suplementado con rojo de fenol
Factor neurotrófico derivado de la línea celular glial	Peprotech	450-10	Quimioatrayente
Nombre	Empresa	>Número de catálogo	Comentarios
Para microscopía de inmunofluorescencia
#1.5 Coverglass	Electrónica Microscopy Sciences	72225-01	Para el montaje de esferoides extirpados
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Se utiliza para teñir la actina a 1:200
Albúmina sérica bovina	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Utilizado en tampón de bloqueo BSA
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	antidecoloración
	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Utilizado en el medio de montaje MOWIOL
ImageJ Software	Freeware, NIH-Utilizado		para el análisis de imágenes
Microportaobjetos	VWR International	48312-024	Para el montaje de esferoides extirpados
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Utilizado en el medio de montaje MOWIOL
Paraformaldehído	EMD-Millipore	PX0055-3	Utilizado en tampón de fijación
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Utilizado en tampón de permeabilización