Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

Resumen

La electroporación de próxima generación es un método eficiente para transfectar células Th17 humanas con ARN pequeños para alterar la expresión génica y el comportamiento celular.

Resumen

Las células T CD4⁺ pueden diferenciarse en varios subconjuntos de células T auxiliares efectoras dependiendo del entorno de citocinas circundante. Las células Th17 se pueden generar a partir de células T CD4⁺ vírgenes vírgenes activándolas en presencia de las citocinas polarizantes IL-1β, IL-6, IL-23 y TGFβ. Las células Th17 orquestan la inmunidad contra bacterias y hongos extracelulares, pero su actividad aberrante también se ha asociado con varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Las células Th17 se identifican por el receptor de quimiocinas CCR6 y se definen por su factor de transcripción maestro, RORγt, y la citocina efectora característica, IL-17A. Las condiciones de cultivo optimizadas para la diferenciación de células Th17 facilitan los estudios mecanicistas de la biología de las células T humanas en un entorno controlado. También proporcionan un entorno para estudiar la importancia de genes específicos y programas de expresión génica a través de la interferencia de ARN o la introducción de imitadores o inhibidores de microARN (miARN). Este protocolo proporciona un método fácil de usar, reproducible y altamente eficiente para la transfección transitoria de células Th17 humanas primarias diferenciadas con ARN pequeños utilizando un dispositivo de electroporación de próxima generación.

Introducción

Células T CD4 ⁺ son orchestrators cruciales de la respuesta inmune adaptativa. Células T CD4 ⁺ vírgenes son capaces de desarrollar en varias células T efectoras diferentes (por ejemplo, Th1, Th2, Th17, etc.), cada uno con su propio conjunto de citocinas características y factores de transcripción, dependiendo de la microentorno local ^1. Las decisiones del linaje que las células T hacen son críticos tanto para la inmunidad protectora y la tolerancia a la libre. Células Th17 son un subconjunto de células T conocidos para combatir bacterias y hongos extracelulares, pero sus respuestas incorrectas también es....

Protocolo

Este protocolo se adhiere a las directrices de la UCSF para la ética de investigación en humanos.

1. Preparación de T cultivo celular, el aislamiento de células T CD4 ⁺ y la polarización Th17

1. En el Día 0, capa placas de cultivo tisular de 6 pocillos con 1,5 ml por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C.
   1. Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm.
2. Preparar las células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) por centrifugación en g....

Resultados

El primer paso para desarrollar un sistema fiable de electroporación con éxito células Th17 humanos era generar robusto en cultivos de células Th17 humanos in vitro diferenciados. Las células T cultivadas en condiciones Th17-polarizantes expresan el receptor de quimiocinas CCR6 y el factor de transcripción RORγt (Figura 1A, izquierda). Estos marcadores no se expresaron cuando se cultivaron las células T en condiciones no polarizante (THN) (Figur.......

Discusión

Este protocolo proporciona un método mejorado para el suministro de pequeños ARN en células Th17 humanos. Aunque se utilizaron células Th17 humanos aquí, este método de electroporación con pequeños ARN se puede utilizar con otros subconjuntos helper humano primario T, tales como Th1, Th2, y Tregs. No ha funcionado bien para las células T CD4 ⁺ vírgenes por lo que las células deben ser activadas en cultivo antes de la transfección. Para este protocolo, primero optimizado el sistema de cultivo in v.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anti-humano IL-17A PE	ebiociencia	12-7179-42	Clon: eBio64DEC17
anti-humano IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clon: 4S. B3
anti-humano CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clon: SK3
ratón anti-humano CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clon: 11A9
anti-humano RORgt AF647	BD biociencias	563620	Clon: Q21-559
anti-humano CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clon: 2D1
Foxp3/Tinción de factor de transcripción Conjunto de tampones	ebioscience	00-5523-00	Para tinción con citometría de flujo de factor de transcripción intracelular
Inhibidor de unión Hu FcR ebioscience purificado		14-9161-71
ImmunoCult-XF Medio de expansión de células T	Stemcell Technologies	10981	"Medios de base sin suero"
MACS CD28 grado funcional puro, humano	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clon: 15E8
anti-humano CD3 Purificado	UCSF monocuerpo	/A	Clon: OKT-3
LEAF purificado anti-humano IL-4	Biolegend	500815	Clon: MP4-25D2
anti-humano IFNg, grado funcional purificado	ebioscience	16-7318-85	Clon: NIB42
IL-23 humano recombinante	Peprotech	200-23
IL-1 humana recombinante y beta;	Peprotech	200-01B
TGF-& beta humano recombinante; 1	Peprotech	100-21C
IL-6 humano recombinante	Peprotech	200-06
Pool de control siGENOME, no objetivo #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool RORC Humano	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool PTPRC humano Dharmacon		M-008067-01
Dynabeads Kit de células T CD4 humanas intactas	ThermoFisher Scientific	11346D	Célula T humana CD4+ Kit de aislamiento
Sistema de tranfectión de neón	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Instrumento de electroporación de última generación
Sistema de tranfectión de neón 10 μ L Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Tampón de resuspensión T	ThermoFisher Scientific	Provisto en kit (MPK1096)	"Tampón de resuspensión de transfección"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Gradiente de densidad Medio costar
Placas tratadas de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Placas de	fondo plano Corning
3516Placas tratadas para cultivo de tejidos de 48 pocillos	Corning	3548	Placas de fondo plano
BD Pharm Tampón de lisado Lyse, 10x	BD biosciences	555899	Debe hacer 1x solución con agua destilada antes de usar

núcleo N