Expresión, purificación y actividad antimicrobiana de S100A12

Resumen

Aquí, se presenta un método para expresar y purificar S100A12 (calgranulina C). Se describe un protocolo para medir su actividad antimicrobiana contra el patógeno humano H. pylori .

Resumen

Las proteínas de la calgranulina son mediadores importantes de la inmunidad innata y son miembros de la clase S100 de la familia EF de proteínas de unión al calcio. Algunas proteínas S100 tienen la capacidad de unirse a los metales de transición con alta afinidad y efectivamente secuestrarlos lejos de patógenos microbianos invasores en un proceso que se denomina "inmunidad nutricional". S100A12 (EN-RAGE) se une tanto al zinc como al cobre y es muy abundante en las células inmunes innatas, como los macrófagos y los neutrófilos. Presentamos un método refinado para la expresión, enriquecimiento y purificación de S100A12 en su configuración activa de unión a metal. La utilización de esta proteína en el crecimiento bacteriano y análisis de viabilidad revela que S100A12 tiene actividad antimicrobiana contra el patógeno bacteriano , Helicobacter pylori . La actividad antimicrobiana se basa en la actividad de unión a zinc de S100A12, que quelates nutrientes de zinc, por lo tanto hambrientos H. pylori que requiere zinc para el crecimiento y pRoliferation.

Introducción

Las proteínas S100 son una clase de la familia EF-mano de proteínas vinculantes de calcio con una amplia gama de funciones [ ^1] . Se expresan de una manera específica de tejidos y células, y regulan un amplio espectro de funciones celulares ^{2 , 3} . Únicas a las proteínas de unión al calcio, las proteínas S100 exhiben funciones intracelulares y extracelulares ^{4 , 5} . Dentro de la célula, Ca ^{2 +} vinculante induce un cambio conformacional que expone una superficie hidrófoba que se dirige específicamente a los socios de ....

Protocolo

1. Expresión de S100A12

1. Transformar células BL21 DE3 competentes con un plásmido pGEMEX-S100a12 usando un protocolo de choque térmico estándar ¹⁸ . Añadir 1 a 5 μL de plásmido a 50 μL de bacterias en un tubo de microcentrífuga sobre hielo. Incubar durante 20 min.
2. Caliente las células a 42 ° C durante 30 s.
3. Incubar las células en hielo durante 2 min.
4. Agregue 500 μl de medio SOC a las células. Incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm en un agitador orbital durante 1 h.
5. Placa 150 μL de la reacción de transformación en medio LB-agar (suplementado con 100 μg / ml de ampicilina). Incubar durante 12-....

Resultados

S100A12 expresión y purificación

Una purificación en tres etapas produjo ~ 40 mg de S100A12 recombinante a partir de 50 ml de cultivo bacteriano. El primer paso fue una precipitación con sulfato de amonio de proteínas endógenas de E. coli . Este paso fue seguido por cromatografía de intercambio aniónico ( Figura 1A ). La proteína es rastreada por una SDS-PAGE teñida con Coomassie Brillia.......

Discusión

Se presenta un protocolo eficaz tanto para la expresión como para la purificación de S100A12 humano. El sistema de expresión de E. coli es la herramienta más común usada para la producción de proteínas recombinantes, particularmente cuando se requieren cantidades de mg para estudios bioquímicos y biofísicos. Una mejora clave del procedimiento descrito aquí es el uso de medios de autoinducción ²⁶ que aumenta el rendimiento de proteína purificada por un factor de casi treinta en comparació.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
S100A12 Expresión
Células de expresión
BL 21 (DE3) células competentes	New England Biolabs	C25271
			medio de autoinducción
Extracto de levadura	Productos de investigación Internacional	Y20020-250.0
NaCl	Productos de Investigación Internacional	S23020-500.0
Investigación	Triptona	Internacional T60060-250.0
FeCl3	Sigma-Aldrich	F2877
MgSO4Productos de	Investigación Internacional	M65240-100.0
Na2HPO4	Research Products International	S23100-500.0
KH2PO4	Research Products International	P41200-500.0
NH4Cl	Research Products International	A20424-500.0
Na2SO4	Research Products International	S25150-500.0
Glycerol	Research Products International	G22020-1.0
D-glucose	Research Products International	G32040-500.0
lactosa	Sigma-Aldrich	L2643
agente de selección
ampicilina	Productos de investigación International	A40040-5.0
S100A12 Purificación
AKTA Sistema de cromatografía de inicio	GE	29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow	GE	17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR	GE	17-1166-01
Espectrofotómetro Nanodrop lite	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE
Tris Base	Research Products International	T60040-1000.0
H. pylori Culture
Placas de agar	Lab Supply Company	BBL221261
Caldo de Brucella	Sigma-Aldrich	B3051
Colesterol (250x)	Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Cloruro de zinc	Sigma-Aldrich	229997

Componentes delProductos de de sangre