Expresión de Proteínas Recombinantes, Cristalización y Estudios Biofísicos de un Bacillus -conservado Nucleótido Pirofosforilasa, BcMazG

Resumen

Bacillus anthracis es el patógeno obligado del ántrax por inhalación fatal, por lo que los estudios de sus genes y proteínas están estrictamente regulados. Un enfoque alternativo es estudiar los genes ortólogos. Se describen los estudios biofísicoquímicos de un B. orthracis ortholog en B. cereus , bc1531, que requiere un mínimo de equipo experimental y la falta de graves preocupaciones de seguridad.

Resumen

Para superar las restricciones de seguridad y las regulaciones al estudiar genes y proteínas de patógenos verdaderos, sus homólogos pueden ser estudiados. Bacillus anthracis es un patógeno obligado que causa el ántrax mortal por inhalación. Bacillus cereus es considerado un modelo útil para estudiar B. anthracis debido a su estrecha relación evolutiva. El grupo de genes ba1554 - ba1558 de B. anthracis está altamente conservado con el grupo bc1531 - bc1535 en B. cereus , así como con el grupo bt1364 - bt1368 en Bacillus thuringiensis, lo que indica el papel crítico de los genes asociados en el género Bacillus . Este manuscrito describe métodos para preparar y caracterizar un producto proteico del primer gen ( ba1554 ) del grupo genético en B. anthracis usando una proteína recombinante de su ortholog en B. cereus , bc1531.

Introducción

La expresión de proteínas recombinantes se utiliza ampliamente para superar problemas asociados con fuentes de proteínas naturales, tales como cantidades limitadas de proteínas y contaminación perjudicial. Además, en estudios de genes y proteínas patógenos, se puede utilizar una cepa alternativa de laboratorio que no requiere precauciones de seguridad adicionales. Por ejemplo, Bacillus cereus es un modelo útil para estudiar Bacillus anthracis debido a su estrecha relación evolutiva ¹ .

B. anthracis es un patógeno obligado que causa el ántrax mortal por inhalación en humanos y ganado y potencialmente puede ser utilizado como bioweapon ² . Por lo tanto, los estudios de laboratorio sobre B. anthracis están estrictamente regulados por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos, que requieren prácticas de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) que obligan a separar el área del laboratorio con presión negativa. En contraste con B. anthracis , B. cereus se clasifica como un agente BSL-1 y por lo tanto tiene preocupaciones mínimas de seguridad. B. cereus es un patógeno oportunista que, tras la infección, causa intoxicación alimentaria que puede ser tratada sin asistencia médica. Sin embargo, debido a que B. cereus comparte muchos genes críticos con B. anthracis , las funciones de las proteínas de B. anthracis se pueden estudiar usando los correspondientes homólogos de B. cereus ¹ .

El grupo de genes ba1554 - ba1558 de B. anthracis se conserva altamente con el grupo bc1531 - bc1535 De B. cereus , así como con el grupo bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis , en términos de organización de genes y secuencia. Además, los primeros genes ( ba1554 , bc1531 y bt1364 ) de los respectivos grupos están absolutamente conservados ( es decir, 100% de identidad de secuencia de nucleótidos), implyiNg un papel crítico del producto génico en las especies de Bacillus . Debido a su ubicación en estos grupos de genes, ba1554 fue mal identificado como un regulador de transcripción putativo [ ^3] . Sin embargo, el análisis de la secuencia de aminoácidos del producto ba1554 indica que pertenece a la familia MazG, que tiene actividad de nucleótido pirofosfohidrolasa y no está asociada con la actividad del factor de transcripción ^{4 , 5} . Aunque las proteínas pertenecientes a la familia MazG son diversas con respecto a la secuencia y longitud totales, comparten un dominio MazG común de ~ 100-residuo caracterizado por un motivo EXXE _12-28 EXXD ("X" representa cualquier residuo de aminoácido, y el número Indica el número de residuos X).

El dominio MazG no siempre explica directamente una cierta actividad catalítica. Un miembro MazG de Escherichia coli (EcMazG) posee dos dominios MazG, pero enLy el dominio C-terminal MazG es enzimáticamente activo [ ^6] . Por otra parte, la especificidad del sustrato de las enzimas MazG varía de nucleoside trifosfatos no específicos (para EcMazG) a dCTP / dATP específicos (para integrinas asociadas a MazG) y dUTP (para dUTPases) ^{6 , 7 , 8 , 9} . Por lo tanto, los análisis biofísicoquímicos de la proteína BA1554 son necesarios para confirmar su actividad NTPasa y para descifrar su especificidad de sustrato.

En este sentido, proporcionamos un protocolo paso a paso que la mayoría de los laboratorios sin un BSL-3 puede seguir para caracterizar el producto proteico del gen B. cereus bc1531 , que es un ortólogo de B. anthracis ba1554 , a nivel molecular. Brevemente, el BC1531 recombinante (rBC1531) se expresó en E. coli y se purificó usando una etiqueta de afinidad. Para los experimentos cristalográficos de rayos X,Zación de la proteína rBC1531 se seleccionaron y optimizaron. Para evaluar la actividad enzimática de rBC1531, la actividad de NTPasa se monitorizó colorimétricamente para evitar nucleótidos radiactivamente marcados que se han usado convencionalmente. Finalmente, los análisis de los datos biofísicoquímicos obtenidos nos permitieron determinar el estado de oligomerización y los parámetros catalíticos de rBC1531, así como obtener datos de difracción de rayos X del cristal rBC1531.

Protocolo

1. Producción y Purificación de Proteínas Recombinantes de rBC1531

1. Preparación de un plásmido de expresión recombinante de la proteína BC1531 (rBC1531)
   1. Preparar el ADN genómico de B. cereus [ ^10] .
   2. Amplificar el gen bc1531 de una plantilla de ADN genómico de B. cereus por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cebadores directos e inversos (véase la Lista de Materiales) para crear sitios de enzimas de restricción Bam HI y Sal I, respectivamente ¹⁰ .
   3. Digerir el producto de PCR y un vector pET49b modificado (pET49bm) usando Bam HI y Sal I, como se describe ¹¹ .
   4. Mezclar el producto de la PCR digerido y el vector (relación 3: 1) de la etapa 1.1.3 usando T4 ADN ligasa en una reacción de 10 μL, tal como se describe en ¹¹ . Incubar a 18 ° C durante 30 min.
   5. Pipetee 3 μL de la reacción de ligadura en 50 μl deLmente células E. coli DH5α competentes en un tubo. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo y colóquelo en hielo durante 30 min. De choque térmico durante 45 s a 42 ° C. Añadir 1 mL de medio Luria-Bertani (LB) y cultivar las células mientras se agita vigorosamente (250 rpm, 37ºC, 45 min).
   6. Tomar 100 μL de las células transformadas de la etapa 1.1.6 y esparcirlas sobre las placas de LB-agar con 100 μg / ml de kanamicina (Kan). Incubar durante ~ 18 ha 37 ° C.
   7. Recoger las colonias utilizando una punta estéril y cultivar las células en 3 ml de medio LB con 100 μg / ml de Kan; Agitar vigorosamente (250 rpm, 37ºC, 18 h).
   8. Preparar ADN plasmídico usando un método de lisis alcalino-SDS, como se describe ¹⁰ .
   9. Confirmar la secuencia de nucleótidos de la expresión rBC1531 construir utilizando el ADN de secuenciación [ ^12] .
2. La sobreexpresión de la proteína rBC1531
   1. Re-transformar la E. coli BL21 (DE3) cepa con rBC1531-expPlásmido ressión, como se describe en los pasos 1.1.5-1.1.6, para sobreexpresión.
   2. Seleccionar una colonia y cultivarla en 10 mL de medio LB que contenga 50 μg / mL de Kan (LB + Kan); Agitar vigorosamente durante 18 h a 37 ° C.
   3. Inocular 10 ml de cultivo durante la noche en 1 L de medio LB + Kan y crecer a 37 ° C hasta que la DO ₆₀₀ (densidad óptica a 600 nm) alcance ~ 0,7.
   4. Sumergir el cultivo en agua helada durante ~ 15 min para enfriar la temperatura a 18 ° C y añadir isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al cultivo a una concentración final de 1 mM para la expresión de proteína recombinante. Cultivar el cultivo a 18 ° C durante un período adicional de ~ 16-18 h.
3. Purificación de rBC1531
   1. Se cosechan las células por centrifugación (5.000 xg, 4ºC, 30 min). Deseche el sobrenadante cuidadosamente para no alterar las células. Re-suspender las células en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene imidazol 10 mM.
   2. Lyse las células dos veces por sonicación en hielo para evitar el sobrecalentamiento de los lisados ​​celulares (tiempo: 2 min 30 s, ciclo en: 5 s, ciclo off: 10 s, amplitud: 38%).
   3. Limpiar el lisado celular por centrifugación (~ 25.000 xg, 4 ° C, 30 min).
   4. Se mezclan 3 ml de perlas de níquel y 60 ml de PBS que contiene imidazol 10 mM y se somete a flujo por gravedad el tampón extra para depositar las perlas de níquel equilibradas en una columna de cromatografía de vidrio de 2,5 x 10 cm.
   5. Pipetear para transferir el sobrenadante del paso 1.3.3 a la columna con perlas de níquel pre-equilibradas e incubar a 4 ° C durante 2 h en una rueda giratoria a una velocidad baja (~ 20 rpm).
   6. Dejar que el sobrenadante se drene por gravedad y lavar las perlas de níquel en la columna tres veces con 100 ml de PBS que contiene imidazol 10 mM.
   7. Eluir la proteína rBC1531 aplicando 4 x 5 ml de PBS que contiene imidazol 250 mM.
   8. Tomar 15 μL de la elución de la etapa 1.3.7 y ejecutarla en SDS-PAGE al 15%. Visualice las bandas de proteínas enEl gel usando tinción azul de Coomassie ¹⁰ .
4. Eliminación de los marcadores de afinidad de la proteína rBC1531 por proteólisis de trombina
   1. Pipetar las fracciones en un tubo de diálisis (peso molecular cortado: 3 kDa) y colocar el tubo en un vaso de precipitados que contenga 4 l de tampón compatible con la escisión de trombina (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM y β-mercaptoetanol 1,5 mM) A 4ºC durante la noche.
   2. Pipetear las fracciones y transferirlas a un tubo cónico.
   3. Medir la absorbancia a 280 nm y estimar la concentración de proteína rBC1531, como se describe [ ^13] .
   4. Tomar 50 μg de rBC1531 en un tubo de 0,5 ml y agregar varias cantidades de trombina ( es decir, 2, 1, 0,6 y 0,3 unidades). Incubar las reacciones rBC1531 y trombina a 20 ° C durante ~ 3 h para determinar la menor cantidad de trombina necesaria para escindir la etiqueta de afinidad N-terminal.
   5. Ejecutar las reacciones rBC1531 y trombina en un 15%SDS-PAGE y determinar la cantidad más baja de trombina ( por ejemplo, 0,3 unidades de trombina por 50 μg de rBC1531) que digiere completamente la etiqueta de afinidad N-terminal y produce un rBC1531 libre de marcadores.
   6. Añadir 10 mg de proteína rBC1531 y 60 unidades de trombina a un tubo de 15 ml e incubar a 20 ° C durante ~ 3 h para la reacción de proteolisis de trombina.
   7. Aplicar las normas de filtración en gel a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para preparar una curva estándar de pesos moleculares y volúmenes de elución, como se describe ¹³ .
   8. Colocar la proteína rBC1531 digerida con trombina de la etapa 1.4.6 en un tubo de filtro centrífugo (peso molecular cortado: 3 kDa) y centrifugar a 3.000 g a 4 ° C para reducir a un volumen de menos de 5 ml.
   9. Aplicar la proteína concentrada rBC1531 a la columna SEC y recoger 60 fracciones eluidas en 0,5 ml por tubo [ ^13] .
   10. Tomar 15 μL de cada fracción, ejecutarlos en un 15% SDS-PAGE, y staiEn el gel usando una solución de tinción Coomassie (0.15% (p / v) de azul brillante Coomassie, metanol al 40% (v / v) y ácido acético glacial al 10% (v / v) como se describe ¹⁰ .
   11. Pipetear las fracciones que contienen rBC1531 y recogerlos en un tubo.

2. Cristalización Tamizaje y Optimización de rBC1531

1. Condiciones de cribado para la cristalización de la proteína rBC1531
   1. Concentrar el rBC1531 de la etapa 1.4.11 hasta ~ 18,5 mg / mL usando un tubo de filtro centrífugo, como se describe en el paso 1.4.8.
   2. Añadir 50 μl de cada solución de cribado de cristalización (ver sección 2.2) ¹⁴ a los pocillos de placas de cristalización de 96 pocillos. Coloque 0,5 μl de la solución de 18,5 mg / ml de proteína rBC1531 sobre una cama sentada. Mezclar la solución de proteína con 0,5 μL de la solución del pocillo, repitiendo el proceso para toda la placa.
   3. Cubra la placa con una película adhesiva transparente.Colocar las placas de 96 pocillos a 18 ° C y permitir la difusión de vapor.
   4. Escanee las gotas a una ampliación de 20-40X usando un microscopio de luz para monitorear la formación de cristales diariamente durante 2-3 semanas.
   5. Recoger datos de difracción de rayos X ¹² usando los cristales de proteína rBC1531 obtenidos.
2. Optimización de las condiciones de cristalización de rBC1531
   1. Preparar 500 μl de la solución de la condición de cristalización inicial seleccionada ( p. Ej., Cacodilato sódico 0,1 M, pH 6,5 y citrato sódico 1,0 M) y rellenar una placa de cristalización de 24 pocillos para la gota sentada.
   2. Añadir 0,5 μL de la solución de 18,5 mg / ml de proteína rBC1531 a un lecho sentado, mezclar con 0,5 μL de la solución del pocillo y cubrir la placa inmediatamente con una película adhesiva transparente. Coloque la placa a 18 ° C.
   3. Observe el crecimiento del cristal bajo un microscopio de luz durante una semana.
   4. Optimizar varias condiciones de cristalización variando el pH ( es decir,, PH 5,5-6,8) de cacodilato 0,1 M y alterando la concentración de sal ( es decir, 0,9-1,2 M) de citrato sódico para obtener cristales singulares. Monitor de crecimiento de cristales durante ~ 1 semana y recoger datos de difracción de rayos X ¹² .

3. Caracterización de la actividad Nucleósido Trifosfatasa (NTPasa) de rBC1531

1. Validación del estudio colorimétrico inorgánico dependiente de fosfato
   1. Preparar una reserva de pirofosfato (100 mM) y diluir a concentraciones finales de 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 y 250 μM en 200 μl de tampón de reacción (HEPES 20 mM, pH 7,4; 150 MM de NaCl y 2 mM de MgCl2) en placas de 96 pocillos duplicadas. Utilice la primera placa como control (esto no contiene pirofosfatasa). Asegúrese de que la segunda placa contiene pirofosfatasa como placa de trabajo, como se indica en el paso 3.1.2.
   2. Añadir 0,01 unidad de Saccharomyces cerevisiae p inorgánicoYrophosphatase (1 μl) a los pocillos de la placa de trabajo e incubar a 20 ° C durante 30-60 min.
   3. Preparar solución de ácido molibdato mezclando soluciones de molibdato de amonio (0,86% v / v) y ácido ascórbico (14% v / v) en una proporción de 7: 3. Añada 16 μl de solución de ácido molibdato a los pocillos de trabajo y de control y espere 15 min.
   4. Leer la densidad óptica a 690 nm (OD _690nm ).
2. Ensayo colorimétrico de NTPasa
   1. Preparar una reserva de sustrato de nucleósido trifosfato (NTP) 100 mM y diluir a la concentración deseada ( por ejemplo, 0, 0,2, 4,4, 11, 22, 44, 88 o 132 μM) en 180 μl de tampón de ensayo (HEPES 20 mM, PH 7,4, NaCl 150 mM y MgCl2 ₂ mM).
   2. Añadir 20 μg de rBC1531 (1,5 mM) y los sustratos NTP desde el paso 3.2.1 hasta 200 μL por reacción en una placa de 96 pocillos y pipetear arriba y abajo para mezclar bien. Cubrir la placa con su tapa y colocarla en una incubadora a 37 ° C durante 30 minPara realizar la reacción de hidrólisis del sustrato.
   3. Transferir la placa a un baño de agua a 70 ° C y dejar reposar durante 15 minutos para detener las reacciones catalíticas mediadas por rBC1531.
   4. Añadir 0,01 unidades de pirofosfatasa inorgánica de S. cerevisiae (1 μl) a cada pocillo de la placa de reacción (de la etapa 3.2.3) e incubar a 20 ° C durante 30 min. Añadir 16 μL de solución de ácido molibdato a la placa de reacción para desarrollar el color (~ 15 min). Leer a DO _690nm .
   5. Analizar utilizando la ecuación de Michaelis-Menten, como se describe ¹² .

Resultados

La caracterización de la proteína de interés en este estudio comenzó preparando una cantidad suficiente de proteína B.cereus recombinante bc1531 (rBC1531), preferiblemente más de varios miligramos. El fragmento de ADN que codifica la proteína BC1531 se preparó por PCR utilizando el ADN genómico de B. cereus como plantilla, ya que contiene genes ortólogos idénticos a ba1554 . RBC1531 se sobreexpresó como una proteína soluble en células de E. coli . La p...

Discusión

Los estudios de patógenos verdaderos son limitados debido a restricciones y regulaciones de seguridad. Alternativamente, los patógenos se pueden estudiar utilizando especies no patógenas o menos patógenas relacionadas evolutivamente. El gen ba1554 se considera un gen crítico en B. anthracis. Afortunadamente, un gen idéntico está presente en B. cereus no clínico.Por lo tanto, sin graves problemas de seguridad, la proteína BC1531 recombinante se puede utilizar para la caracterización biofísica y...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bacillus cereus ATCC14579	Colección coreana para cultivo de tejidos	3624
Kit de preparación de ADN genómico	GeneAll	106-101 Preparación de	ADN genómico
Imprimación directa	Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAAA CGATGAAAGATATGCA	em>BamHI se subraya
El cebador inverso	Macrogen	CTTGTCGACTTATTTTCTCTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI sitio está subrayado
nPfu-Forte	Enzynomics	P410	PCR polymerase
BamHI	Enzynomics	R003S
SalI	Enzynomics	R009S
pET49b vector de expresión	Novagen	71463	El vector de expresión se modificó para agregar etiquetas de afinidad y sitios BamHI/SalI10
T4 ADN ligasa	Enzinomía	M001S
Memebrana de diálisis	Thermofisher	18265017
Calentador de bloque seco	JSR JSBL-02T
Caldo LB (Luria-Bertani)	Solución LPS	LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton, Dickinson y compañía
Solución de Kanamicina	LPS	KAN025
Mini-kit de preparación	Favorgen	FAPDE300	Preparación de ADN plasmídico
BL21(DE3) Célula competente	Novagen	69450-3CN
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	Fisher BioReagents	50-213-378
Cloruro de sodio	Daejung	7548-4100	Material PBS
Cloruro de potasio	Daejung	6566-4405	Material PBS
Fosfato de potasio	Bio Basic Inc	PB0445	Material PBS
Fosfato de sodio	Bio Basic Inc	S0404	Material PBS
Imidazol	Bio Basic Inc	IB0277
Sonicator	Sonics	VCX 130
Ni-NTA agaros	Qiagen	30210	Rotador de perlas de níquel
	Finepcr	AG
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-rad	1610374	SDS-PAGE estándar de proteínas
Coonmassie Brilliant Blue R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	Solución de tinción de Coomassie
Alcohol metílico	Samchun químico	M0585	Solución de tinción de Coomassie
Ácido acético	Daejung	1002-4105	Solución de tinción de Coomassie
Memebrane de diálisis	Thermofisher	68035
2-Mercaptoetanol	Sigma-aldrich	M6250
Trombina	Merckmillipore	605157-1KUCN	Preparar alícuotas de 20 μ L (1 unidad por μ L) y almacenar a 70 ° C y descongelación antes de usar
Superdex 200 16/600	General Electric	28989335	Cromatografía de exclusión por tamaño
Estándar de filtración en gel	Bio-rad	151-1901
Filtro centrífugo	Amicon	UFC800396
Placas de cristralización Hampton	research	HR3-083	Placa de caída de asiento de 96 pocillos
El conjunto básico JCSG I-IV	Qiagen	130924-130927	Solución de secreción de cristalización
Microscopio	Nikon	SMZ745T
Placas Cryschem	Hampton research	HR3-158	Placa de caída de 24 pocillos
Pirofosfatasa inorgánica	Sigma	10108987001
solución de molibdato de amonio	Sigma	13106-76-8
Ácido L-ascórbico	Sigma	50-81-7
Sustrato NTP	Startagene	200415-51
Espectrofotómetro	Biotek	SynergyH1	microplacas
GraphPad Prisma 5	GraphPad	Prisma 5 para ventana