La técnica de determinación del genotipo se describe aquí, que las parejas de reacción en cadena de la polimerasa fluorescente (PCR) para electroforesis capilar en gel, permite para el genotipado de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Se evita limitaciones que enfrentan las otras técnicas de genotipificación y es más rentable que los métodos de secuenciación.
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Artículo de método
Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo de herramientas de edición de genoma programables ha facilitado el uso de genética inversa para entender los papeles secuencias genómicas específicas juegan en el funcionamiento de células y organismos enteros. Esta causa ha sido enormemente ayudado por la reciente introducción de la CRISPR / sistema de un Cas9 herramienta versátil que permite a los investigadores manipular el genoma y transcriptoma con el fin de, entre otras cosas, knock out, derribar, o golpeen en los genes de forma focalizada manera. A los efectos de la anulación de un gen, CRISPR / Cas9 mediada por roturas de la doble hebra reclutan la vía de reparación del DNA unión de los extremos no homóloga para introducir la inserción o deleción que causan desplazamiento del marco de los nucleótidos en el sitio de ruptura. Sin embargo, un ARN guía individual puede causar indeseables efectos fuera de objetivo, y para descartar éstos hacia fuera, el uso de múltiples guía RNAs es necesaria. Esta multiplicidad de objetivos también significa que se requiere una selección de alto volumen de clones, que a su vez plantea la utilización de un efciente técnica de alto rendimiento para determinar el genotipo de los clones de final. técnicas de genotipificación actuales o bien sufren de limitaciones inherentes o incurren en altos costos, por lo tanto haciéndolos inadecuados para fines de alto rendimiento. Aquí, nos detalle el protocolo para el uso de fluorescente PCR, que utiliza ADN genómico a partir de lisado celular bruto como una plantilla y, a continuación, la solución de los fragmentos de PCR a través de electroforesis en gel capilar. Esta técnica es lo suficientemente precisa para diferenciar diferencia de un par de bases entre los fragmentos y por lo tanto es adecuada para indicar la presencia o ausencia de un desplazamiento de marco en la secuencia codificadora del gen diana. Este conocimiento preciso impide de hecho la necesidad de una etapa de secuenciación confirmatoria y permite a los usuarios ahorrar tiempo y costes en el proceso. Además, esta técnica ha demostrado ser versátil en el genotipado de diversas células de mamíferos de diversos orígenes tisulares dirigidas por ARN de guía contra numerosos genes, como se muestra aquí y en otros lugares.
Introducción
enfoques de genética inversa han permitido a los científicos para dilucidar los efectos de alteraciones específicas en el genoma de la célula u organismo completo. Por ejemplo, la expresión de un gen particular puede ser atenuada por el gen knockdown 1, 2 (reducción parcial) o knockout del gen 3, 4 (ablación completa) con el fin de determinar el efecto que esto tiene sobre la función de la célula o en el desarrollo del organismo.
experimentos de eliminación de genes se han convertido en más fácil desde la introducción de n....
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Protocolo
1. La obtención de CRISPR / clones de una sola célula orientados Cas9
- células HepG2 Seed en una placa de 6 pocillos a 500.000 células por pocillo en 2 ml de de antibiótico-libre de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Incubar durante 24 h a 37 ° C y 5% de CO2.
- transfectar células con el plásmido co-expresión de Cas9 y sgRNA específica contra el gen de interés usando un reactivo de transfección apropiado según las instrucciones del fabricante.
NOTA: Por ejemplo, sgRNA se puede clonar en el 2A-GFP vector pSpCas9 (BB), como se describió previamente 4.
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Resultados
La técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente descrito aquí se anticipa que sea aplicable a cualquier región objeto de orientación en el genoma en prácticamente cualquier línea celular que es susceptible de suministro de ADN extraño. Hemos demostrado anteriormente su aplicación por la orientación tres genes en una línea celular de cáncer colorrectal 12. Aquí, se muestra su eficacia en el genotipado de una línea celular de carcinoma hepatocelular,.......
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Discusión
La anulación de un gen específico en una línea celular modelo de elección se ha convertido en rutina para dilucidar el papel que desempeña el gen en ese contexto celular particular. De hecho, varias pantallas de todo el genoma están actualmente disponibles que utilizan el sistema CRISPR / Cas9 para apuntar genes humanos prácticamente todos los conocidos en el genoma de 14, 15, 16. Con estas pantallas de gran escala (o incluso a.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Sra. Tan Shi Min, Sra. Helen Ong, y el Dr. Zhao Yi para ayudar con los experimentos de electroforesis capilar en gel. Este trabajo fue apoyado por NMRC / IRG conceder NMRC / 1314/2011 y el Ministerio de Educación ACRF Nivel 2 subvención del Fondo MOE2011-T2-1-051.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células HEPG2 | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plásmido | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Tripsina-EDTA (0,25 %), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Tripsina-EDTA (0,5 %), sin rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, grado de biología molecular | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| Oligonucleótido de inserción de sgRNA CRISPR (sentido) | AITbiotech | Ninguno | Secuencia: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR |
| sgRNA inserto oligonucleótido (antisentido) | AITbiotech | Ninguno | Secuencia: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'Imprimación |
| directa de amplificación de PCR sin etiquetar | AITbiotech | Ninguno | Secuencia: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; este cebador también se utiliza para secuenciar alelos amplificados por PCR |
| marcados con 6-FAM cebador fluorescente hacia adelante | AITbiotech | Ninguno | Secuencia: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTCTC-3'Imprimador |
| adelante de PCR fluorescente marcado con HEX | AITbiotech | Ninguno | Secuencia: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'Imprimación |
| inversa de PCR sin etiquetar | AITbiotech | Ninguno | Secuencia: 5'-CCTCTTCCAAGTGTGCTTATGT-3'Taq |
| PCR | QIAGEN 201223 | ||
| formamida de alta dividencia | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Tamaño de tinte estándar | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Óptico Placa de reacción de 96 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genético Analizador | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Serie 2 Programa | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Sistema de limpieza de gel y PCR | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Anticuerpo ( N-término) | Abgent | AP1920b | |
| Anticuerpo p84 de la proteína de matriz nuclear [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidasa AffiniCabra pura Anti-Conejo IgG Jackson | ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidasa AffiniOveja Pura Anti-Ratón IgG Jackson | ImmunoResearch | 515-035-003 |
Referencias
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312(2016).
- O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014). ....
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Reimpresiones y permisos
