La inmunohistoquímica de fluorescencia multiparamétrica puede usarse para evaluar el número, la distribución relativa y la localización de las poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral. Este manuscrito describe el uso de esta técnica para analizar las subpoblaciones de células T en el cáncer orofaríngeo.
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Artículo de método
Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina
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Resumen
Resumen
La técnica de inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores (IHC) es un método para cuantificar las poblaciones de células de interés, teniendo en cuenta su distribución relativa y su localización en el tejido. Esta técnica ha sido ampliamente aplicada para estudiar el infiltrado inmune en diversos tipos de tumores. El microambiente tumoral está infiltrado por las células inmunitarias que son atraídas hacia el sitio del tumor. Se ha descubierto que diferentes poblaciones de células inmunes juegan diferentes papeles en el microambiente tumoral y tienen un impacto diferente en el resultado de la enfermedad. Este manuscrito describe el uso de la fluorescencia multiparamétrica IHC en carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) como ejemplo. Esta técnica puede extenderse a otras muestras de tejidos y tipos de células de interés. En el estudio presentado, se analizó el compartimento intraepitelial y estromal de una cohorte OPSCC grande (n = 162). Nos centramos en los linfocitos T totales (CD3 + ), inmunodepresores(TREGs, es decir, FoxP3 + ), y células T auxiliar 17 (Th17) ( es decir, IL-17 + CD3 + ) utilizando un contraste nuclear para distinguir el epitelio tumoral del estroma. Se encontró que un alto número de células T estaba correlacionado con una supervivencia libre de enfermedad mejorada en pacientes con un número bajo de células IL-17 + no-T intratumoral. Esto sugiere que las células no-T de IL-17 + pueden estar correlacionadas con una respuesta inmune pobre en OPSCC, lo que está de acuerdo con la correlación descrita entre IL-17 y la mala supervivencia en pacientes con cáncer. Actualmente, se están desarrollando nuevas técnicas de IHC de fluorescencia multiparámetro que utilizan hasta 7 fluorocromos diferentes y permitirán la caracterización y localización más precisas de las células inmunitarias en el microambiente tumoral.
Introducción
Los carcinomas de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) son un grupo heterogéneo de cánceres de células escamosas que se originan en la orofaringe. Los factores de riesgo para OPSCC incluyen la infección por el virus del papiloma humano (VPH) y el consumo de alcohol y tabaco 1 , 2 . El papel de la respuesta inmune y cómo usar esto en un entorno clínico está empezando a ser explorado. El microambiente tumoral está infiltrado por las células inmunes que son atraídas al sitio del cáncer. Aunque una alta frecuencia de células T citotóxicas CD8 + se ha correlacionado con la supervivencia mejorada en pa....
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Protocolo
Las muestras de pacientes se manejaron de acuerdo con las directrices éticas médicas descritas en el Código de Conducta para el Uso Secundario Adecuado del Tejido Humano de la Federación Holandesa de Sociedades Científicas Biomédicas (www.federa.org).
1. Prepare diapositivas
- Obtenga material de tejido resecado (cualquier tipo de tejido) de un departamento de patología después de obtener permiso del comité médico ético para usar material resecado.
NOTA: Para el experimento actual, se obtuvieron muestras de tumor pretratamiento de tumores orofaríngeos primarios diagnosticados en el Centro Médico de Leiden University, Leide....
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Resultados
Se tiñó una serie de muestras tumorales de pretratamiento de FFPE obtenidas a partir de tumores orofaríngeos primarios diagnosticados en el Leiden University Medical Center de Leiden, Países Bajos entre 1970 y 2011, seleccionadas como se describió anteriormente (n = 162), usando el protocolo descrito 13 . Se analizaron de una a cuatro imágenes aleatorias de cada diapositiva ( Figura 1 ). Se indican algunas células autofluorescentes, q.......
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Discusión
Para el protocolo descrito, una de las etapas más críticas es determinar la dilución correcta de los anticuerpos primarios utilizados. La dilución de los anticuerpos secundarios marcados fue de 1: 200, según lo recomendado por el fabricante de estos anticuerpos específicos marcados con Alexa. La dilución de los anticuerpos primarios debe determinarse entonces mediante una dilución en serie, preferiblemente utilizando dos muestras diferentes del tipo de tejido deseado (en este caso, OPSCC). La dilución óptima de trabajo .......
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Divulgaciones
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses comercial o financiero.
Agradecimientos
Simone Punt recibió el apoyo de la subvención UL2010-4801 de la Sociedad Holandesa contra el Cáncer. Agradecemos a todos los coautores del documento original que este protocolo JoVE esté basado en: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter y Sjoerd van Der Burg.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone e Histostar | Procesador de tisú automatizado | |
| Histostar | Thermo Scientific | Máquina de inclusión de bloques de tejidos | |
| Formaldehído | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Etanol | Merck | ||
| milliQ agua | Elaga Purelab Chorus | ||
| Cera de parafina/Paraclean | Klinipath | 5079A Soporte de | |
| pañuelo para micrótomo | Leica | RM225 | |
| Flex IHC lado | Dako | Portaobjetos de tejido | |
| Tris | Merk-Milipore | 1.083.821.000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Conejo anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titulación necesaria dilución de anticuerpos |
| Ratón IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titulación necesaria dilución de anticuerpos |
| Cabra IgG anti-IL-17 | R& D Systems | AF-317-NA | Titulación requerida dilución de anticuerpos |
| Anticuerpo de control de isotipo Ig de conejo | Abcam | ab27472 | Úselo a la misma concentración final que anti-CD3 |
| Anticuerpos de control de isotipo IgG1 de ratón | Abcam | ab91353 | Uso a la misma concentración final que anticuerpo de control de isotipo IgG de cabra anti-FoxP3 |
| ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Úselo a la misma concentración final que anti-IL-17 | |
| Burro anti-conejo IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS |
| Burro anti-ratón-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS |
| Burro anticabra IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS |
| VectaShield que contiene DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Microscopio de barrido láser confocal LSM700 | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objetivo | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | versión 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | versión 4.2.0.121 | Disponible para descargar en www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | versión 20.0 | |
| ImageJ | versión 1.50i | Disponible para descargar en http://rsb.info.nih.gov/ij. |
Referencias
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
