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Artículo de método

Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina

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DOI:

10.3791/55589

⸱

29 de julio de 2017

 ,  , 
1Department of Pathology, Leiden University Medical Center, 2Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Erasmus University Medical Center, 3Center for Gynecological Oncology Amsterdam, VU Medical Center

En este artículo

Resumen

La inmunohistoquímica de fluorescencia multiparamétrica puede usarse para evaluar el número, la distribución relativa y la localización de las poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral. Este manuscrito describe el uso de esta técnica para analizar las subpoblaciones de células T en el cáncer orofaríngeo.

Resumen

La técnica de inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores (IHC) es un método para cuantificar las poblaciones de células de interés, teniendo en cuenta su distribución relativa y su localización en el tejido. Esta técnica ha sido ampliamente aplicada para estudiar el infiltrado inmune en diversos tipos de tumores. El microambiente tumoral está infiltrado por las células inmunitarias que son atraídas hacia el sitio del tumor. Se ha descubierto que diferentes poblaciones de células inmunes juegan diferentes papeles en el microambiente tumoral y tienen un impacto diferente en el resultado de la enfermedad. Este manuscrito describe el uso de la fluorescencia multiparamétrica IHC en carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) como ejemplo. Esta técnica puede extenderse a otras muestras de tejidos y tipos de células de interés. En el estudio presentado, se analizó el compartimento intraepitelial y estromal de una cohorte OPSCC grande (n = 162). Nos centramos en los linfocitos T totales (CD3 + ), inmunodepresores(TREGs, es decir, FoxP3 + ), y células T auxiliar 17 (Th17) ( es decir, IL-17 + CD3 + ) utilizando un contraste nuclear para distinguir el epitelio tumoral del estroma. Se encontró que un alto número de células T estaba correlacionado con una supervivencia libre de enfermedad mejorada en pacientes con un número bajo de células IL-17 + no-T intratumoral. Esto sugiere que las células no-T de IL-17 + pueden estar correlacionadas con una respuesta inmune pobre en OPSCC, lo que está de acuerdo con la correlación descrita entre IL-17 y la mala supervivencia en pacientes con cáncer. Actualmente, se están desarrollando nuevas técnicas de IHC de fluorescencia multiparámetro que utilizan hasta 7 fluorocromos diferentes y permitirán la caracterización y localización más precisas de las células inmunitarias en el microambiente tumoral.

Introducción

Los carcinomas de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) son un grupo heterogéneo de cánceres de células escamosas que se originan en la orofaringe. Los factores de riesgo para OPSCC incluyen la infección por el virus del papiloma humano (VPH) y el consumo de alcohol y tabaco 1 , 2 . El papel de la respuesta inmune y cómo usar esto en un entorno clínico está empezando a ser explorado. El microambiente tumoral está infiltrado por las células inmunes que son atraídas al sitio del cáncer. Aunque una alta frecuencia de células T citotóxicas CD8 + se ha correlacionado con la supervivencia mejorada en pacientes OPSCC 3 , el papel de otros subconjuntos de células T, incluyendo Tregs y células Th17, todavía no está claro 4 . Mientras que las células Th1 y Th17 se supone para ayudar en la respuesta inmune dirigida a las células tumorales, Tregs son bien conocidos por sus capacidades para suprimir la actividad de otras células T [ 5] . Sin embargo, la presencia de TRegs ha demostrado que se correlaciona con respuestas favorables y desfavorables en diferentes tipos de tumores [ 6] . Dado que no todas las células inmunitarias presentes en la sangre se infiltran en el tumor en la misma medida, el estudio del microambiente local del tumor proporciona la medida más fiable de la respuesta inmune dirigida contra el tumor. El objetivo de este estudio es determinar la correlación entre los números y tipos de células inmunes y el resultado clínico. Se utilizó cuatro colores de fluorescencia IHC de imágenes para analizar el número y la localización de varias subpoblaciones de células T en humanos OPSCC.

Nos centramos en el total de linfocitos T (CD3 + ), Th17 células, y inmunosupresores FoxP3 + Tregs, cuya diferenciación vía está estrechamente relacionado con Th17 células. Las células Th17 se caracterizan por la combinación de CD3 e IL-17. La citocina IL-17 también puede ser producida por células no T 7 . Se determinó la distribución de intra-epitCélulas T heliales y estromales, Tregs, Th17, e IL-17 + células no T en una gran serie de casos OPSCC y analizaron las correlaciones con la supervivencia del paciente. Se usó fluorescencia multicolor IHC para identificar la expresión de CD3, Foxp3 e IL-17, en combinación con un contraste de DAPI. Este ensayo permitió la identificación fácil y clara de ambas células tumorales (usando tinción nuclear DAPI) y las poblaciones de células T infiltrantes (usando una combinación de diferentes marcadores). Después de la preparación de la muestra y la tinción, un microscopio fluorescente y software de imágenes se utilizaron para separar los diferentes colores fluorescentes utilizados y para determinar el número y el tipo de células presentes tanto en el epitelio tumoral y el estroma asociado al tumor.

Un análisis alternativo para cuantificar y fenotipo de poblaciones de células inmunitarias es el análisis de citometría de flujo, o análisis de citometría por tiempo de vuelo (CyTOF), de muestras tumorales o periféricas ( es decir, sangre o ascitis). Usando esto, Se pierde toda la información sobre localización y distribución relativa de los diferentes tipos de células. El uso y análisis de muestras periféricas tampoco proporciona información sobre qué células son capaces de infiltrarse en el microambiente tumoral. Los análisis de sangre y ascitis de células inmunes se han demostrado no para reflejar el fenotipo y la frecuencia de infiltración de células inmunes del tejido tumoral 8, 9.

Otra alternativa es el uso de microscopía de campo brillante. Una ventaja de esta técnica sobre la formación de imágenes de fluorescencia es la ausencia de autofluorescencia del tejido. Aunque algunas muestras contienen más autofluorescencia, particularmente eritrocitos, pero también otros tipos de células, incluyendo granulocitos neutrófilos, estas áreas pueden ser fácilmente eliminadas en el análisis de casi todas las muestras. La inmunofluorescencia ofrece la ventaja de analizar marcadores múltiples en una muestra usando un panel de fluoresce dirigidoNt longitudes de onda. Esto es actualmente imposible en la misma medida para la microscopía de campo brillante debido a la falta de un número suficiente de marcadores y de isotipos de anticuerpos comercialmente disponibles para un antígeno particular.

La técnica de fluorescencia multicolor IHC descrita aquí se ha usado en muchos tipos diferentes de cáncer y combinaciones de anticuerpos para estudiar diferentes poblaciones de células inmunitarias, así como moléculas de células tumorales expresadas, tales como antígenos de leucocitos humanos (HLA) y PD-L1 10 , 11 , 12 . El protocolo se ha establecido y validado utilizando muchos tipos diferentes de muestras y anticuerpos.

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Protocolo

Las muestras de pacientes se manejaron de acuerdo con las directrices éticas médicas descritas en el Código de Conducta para el Uso Secundario Adecuado del Tejido Humano de la Federación Holandesa de Sociedades Científicas Biomédicas (www.federa.org).

1. Prepare diapositivas

  1. Obtenga material de tejido resecado (cualquier tipo de tejido) de un departamento de patología después de obtener permiso del comité médico ético para usar material resecado.
    NOTA: Para el experimento actual, se obtuvieron muestras de tumor pretratamiento de tumores orofaríngeos primarios diagnosticados en el Centro Médico de Leiden University, Leiden, Holanda entre 1970 y 2011, seleccionados como se describió anteriormente (n = 162) 13 . El tamaño del tejido sólo estaba limitado por el requisito de una cantidad suficiente de tejido tumoral para tomar de forma fiable 4 imágenes microscópicas dentro del tumor.
  2. Fijar el tejido en formalina tamponada al 4% durante un mínimo de 12 h. Deshidratar el tejido en agRadicado serie de etanol. Lavar en xileno e incrustar en cera de parafina con un procesador de tejido automatizado.
  3. Corte secciones de tejido de 4 μm de espesor, fijadas con formalina, embebidas en parafina (FFPE) sobre placas de vidrio usando un microtomo. Coloque el bloque de tejido en el soporte de tejido de microtona utilizando procedimientos estándar.
    1. Corte las cintas de tejido y colóquelas en la superficie de un baño de agua que contenga agua desionizada a 45 ºC. Utilice una diapositiva adecuada para la tinción inmunohistoquímica para pescar una sección colocando la diapositiva en el agua directamente debajo de la sección. Mueva con cuidado la corredera hacia arriba en un ángulo, sacando la sección del agua y pegándola en la corredera.
  4. Deje que los portaobjetos se sequen durante una noche a 37ºC.
  5. Desparafinar los portaobjetos de FFPE sumergiéndolos completamente en 100% de xileno fresco, tres veces durante 5 min cada uno. Rehidratar los portaobjetos sumergiéndolos dos veces en etanol 100% fresco, etanol al 70% y etanol al 50% durante 5 minutos cada uno.

2. Realizar la recuperación de antígeno

  1. Lavar los portaobjetos en agua desionizada durante 5 min.
  2. Precalentar el tampón de ácido tris-etilendiaminotetraacético (EDTA) (Tris 10 mM más EDTA 1 mM, pH 9,0) hasta la temperatura de ebullición usando un microondas. Realice la recuperación del antígeno sumergiendo los portaobjetos en el tampón EDTA precalentado y manteniendo el tampón a esta temperatura durante 10 minutos en el microondas.
    NOTA: Se puede utilizar cualquier microondas con una potencia de 900 W.
  3. Deje que los portaobjetos se enfríen en el amortiguador durante 2 h.

3. Mancha las diapositivas del tejido

  1. Lavar las placas dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min cada una.
  2. Dibuje un círculo alrededor del tejido con una pluma hidrófoba para evitar que los anticuerpos diluidos se derrame de la diapositiva. Lavar una vez más con PBS; Esto es opcional.
  3. Incubar el tejido con anticuerpos primarios (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 y anti-IL-17 1:50) diluido en suero bovino al 1% p / v aLbumin (BSA) en PBS a temperatura ambiente durante la noche.
    NOTA: El volumen por diapositiva depende del tamaño del tejido, pero típicamente es de 50-150 μl. Sustituir los anticuerpos primarios con anticuerpos de la misma clase de isotipo con una especificidad desconocida para las diapositivas de control negativo a la misma dilución que los anticuerpos CD3, CD8 y FoxP3 ( es decir, anticuerpo de control del isotipo de Ig de conejo, anticuerpo de control de isotipo de IgG1 de ratón y cabra IgG).
  4. Lavar los portaobjetos tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno.
  5. Incubar el tejido con una combinación de anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente dirigidos a las especies de anticuerpos primarios y / o isotipos ( es decir, 1: 200 burro anti-cabra IgG Alexa 488, burro anti-conejo IgG A546, y burro anti-ratón A647) diluido en 1% de BSA en PBS a temperatura ambiente durante 1 h.
    NOTA: El volumen por diapositiva depende del tamaño del tejido, pero típicamente es de 50-150 μl.
    1. DespuésAñadiendo el anticuerpo secundario, mantenga los portaobjetos protegidos de la luz tanto como sea posible almacenándolos en una caja oscura o envolviendo la caja en papel de aluminio.

4. Montar y ajustar las diapositivas del tejido

  1. Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno.
  2. Montar los portaobjetos utilizando un medio de soporte anti-desvanecimiento acuoso que contenga un contra-tinción nuclear ( por ejemplo, DAPI). Analizar las diapositivas con un microscopio fluorescente lo antes posible (dentro de dos semanas). Guarde los portaobjetos en la oscuridad a 4 ° C hasta su análisis.

5. Analizar las diapositivas de tejidos teñidos

  1. Obtenga cuatro imágenes de cada diapositiva usando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de 20-25X. Tomar imágenes en lugares aleatorios a lo largo del área total del tumor incluida en la diapositiva para capturar una fracción representativa del tumor.
    NOTA: Debe usarse una ampliación estándar de 250X. Cualquier fluorescente oR microscopio de escaneado láser, siempre que tenga los filtros y láser necesarios para visualizar los fluorocromos utilizados.
    1. Para la visualización de Alexa 488, utilice un máximo de excitación de 490 y un máximo de emisión de 525; Para la visualización de Alexa 546, utilice un máximo de excitación de 556 y un máximo de emisión de 573; Para la visualización de Alexa 647, utilice un máximo de excitación de 650 y un máximo de emisión de 665; Y para la visualización de DAPI, utilice un máximo de excitación de 358 y un máximo de emisión de 461.
    2. Guarde las imágenes como archivos de imagen ( es decir, jpeg y tiff) en el software disponible para el usuario.
  2. Discriminar entre epitelio tumoral y áreas de estroma tumoral basadas en las formas nucleares y celulares de las células epiteliales tumorales frente a las células estromales después de consultar a un patólogo.
    1. Para determinar la superficie total del estroma, trace una línea alrededor de todas las áreas ocupadas por células estromales (en lugar de células tumorales) y recorD la superficie utilizando el software de análisis de imágenes proporcionado por el fabricante del microscopio.
      1. Haga clic en la pestaña "Superposición" debajo de la imagen; Elija la forma "Cerrada Poly-line" y haga clic en ella. Demarque la frontera entre los campos epiteliales y estromales del tumor haciendo clic alrededor del área hasta alcanzar el primer punto nuevamente. Esto proporciona una medida para esa área.
        NOTA: Una vez que la forma esté cerrada, aparecerá un número junto a la forma que rodea el área de la superficie de la imagen seleccionada (A = x μm 2 ).
    2. Restar este área de superficie de la superficie total de la imagen (proporcionado en las propiedades de la imagen) para calcular el área de la superficie epitelial. Excluya áreas vasculares, necróticas y autofluorescentes dibujando una línea alrededor de ellas, registrando el tamaño del área proporcionada y restando el área epitelial.
    3. Guarde todos los números de área de superficie en un archivo de hoja de cálculo para calcular lasNúmero de células por diapositiva.
    4. Usando el software de análisis de imágenes, determine si las células son individuales, dobles o triples positivas comprobando la fluorescencia de los cuatro canales.
      1. Contar las células simples, dobles y triples positivas en cada imagen usando ImageJ.
        1. Descargar ImageJ. Abra una imagen haciendo clic en "Archivo" y "Abrir" y seleccionando la imagen a analizar. Haga clic con el botón derecho del ratón en la "Herramienta de punta" (un cuadrado rojo en el centro de cuatro líneas) y seleccione la "Herramienta multipunto". Haga doble clic en "Multi-Point Tool" y cuente el número de tipos de celdas diferentes en la imagen seleccionando un número de contador diferente para cada tipo de celda.
          NOTA: Cuente todas las celdas de cada tipo de célula diferente, tal como se identifica por la presencia de uno, dos o los tres colores fluorescentes. Excluir DAPI, ya que este counterstain nuclear está presente en todas las células y se utiliza para discriminar las células tumorales de las células inmunes. Cada tipo de célula se cuentaUtilizando un número de contador diferente. Cuente el número de células de cada tipo de célula por separado en las áreas epiteliales y estromales tumorales eligiendo un número de contador diferente cada vez. No cuente las células dentro de los vasos sanguíneos y áreas en gran parte autofluorescentes.
        2. Registre el número de celdas analizadas en cada compartimiento para cada imagen en un archivo de hoja de cálculo.
        3. Divida el número total de células para cada tipo de célula sobre la superficie total del epitelio tumoral y el estroma tumoral analizado.

6. Análisis estadístico

NOTA: Todos los análisis estadísticos deben ser discutidos con un estadístico para asegurar la calidad de los datos. Para estadísticas generales, use cualquier guía de estadísticas médicas 14 .

  1. Prueba de las correlaciones entre las frecuencias celulares utilizando una correlación de Spearman rho test de correlación.
  2. Pruebe las diferencias estadísticas en el número de células positivasLs entre los grupos de pacientes que utilizan la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney.
  3. Pruebe las correlaciones entre el número de células y la supervivencia libre de enfermedad ( es decir, tiempo desde el diagnóstico hasta la recidiva local o distante de la muerte o enfermedad) dividiendo a los pacientes en grupos basados ​​en un número de corte de células usando la generación de curva Kaplan-Meier y log Análisis de rango 15 .
  4. Realizar análisis multivariante utilizando análisis de regresión proporcional de riesgo de Cox.

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Resultados

Se tiñó una serie de muestras tumorales de pretratamiento de FFPE obtenidas a partir de tumores orofaríngeos primarios diagnosticados en el Leiden University Medical Center de Leiden, Países Bajos entre 1970 y 2011, seleccionadas como se describió anteriormente (n = 162), usando el protocolo descrito 13 . Se analizaron de una a cuatro imágenes aleatorias de cada diapositiva ( Figura 1 ). Se indican algunas células autofluorescentes, q...

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Discusión

Para el protocolo descrito, una de las etapas más críticas es determinar la dilución correcta de los anticuerpos primarios utilizados. La dilución de los anticuerpos secundarios marcados fue de 1: 200, según lo recomendado por el fabricante de estos anticuerpos específicos marcados con Alexa. La dilución de los anticuerpos primarios debe determinarse entonces mediante una dilución en serie, preferiblemente utilizando dos muestras diferentes del tipo de tejido deseado (en este caso, OPSCC). La dilución óptima de trabajo ...

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Divulgaciones

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses comercial o financiero.

Agradecimientos

Simone Punt recibió el apoyo de la subvención UL2010-4801 de la Sociedad Holandesa contra el Cáncer. Agradecemos a todos los coautores del documento original que este protocolo JoVE esté basado en: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter y Sjoerd van Der Burg.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pathos Delta Ultra Rapid Tissue ProcessorMilestone e HistostarProcesador de tisú automatizado
HistostarThermo ScientificMáquina de inclusión de bloques de tejidos
FormaldehídoBaker
XylolMerck
EtanolMerck
milliQ aguaElaga Purelab Chorus
Cera de parafina/ParacleanKlinipath5079A Soporte de
pañuelo para micrótomoLeicaRM225
Flex IHC ladoDakoPortaobjetos de tejido
TrisMerk-Milipore1.083.821.000
EDTABaker1073
PBSBio-RadBUF036A
BSASigmaA9647
Conejo anti-CD3Abcamab828Titulación necesaria dilución de anticuerpos
Ratón IgG1 anti-FoxP3Abcamab20034Titulación necesaria dilución de anticuerpos
Cabra IgG anti-IL-17R& D SystemsAF-317-NATitulación requerida dilución de anticuerpos
Anticuerpo de control de isotipo Ig de conejoAbcamab27472Úselo a la misma concentración final que anti-CD3
Anticuerpos de control de isotipo IgG1 de ratónAbcamab91353Uso a la misma concentración final que anticuerpo de control de isotipo IgG de cabra anti-FoxP3
ThermoFisher Scientific02-6202Úselo a la misma concentración final que anti-IL-17
Burro anti-conejo IgG A546ThermoFisher ScientificA10040Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS
Burro anti-ratón-A647ThermoFisher ScientificA31571Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS
Burro anticabra IgG A488ThermoFisher ScientificA11055Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS
VectaShield que contiene DAPIVector LaboratoriesH-1200
Microscopio de barrido láser confocal LSM700 Zeiss
LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objetivoZeiss420852-9972-720
LSM Zen SoftwareZeissversión 2009
LSM Image BrowserZeissversión 4.2.0.121Disponible para descargar en www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.
SPSSIBM Corp.versión 20.0
ImageJversión 1.50iDisponible para descargar en http://rsb.info.nih.gov/ij.

Referencias

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