Artículo de método

Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular

DOI:

10.3791/55592

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7 de junio de 2017

 ,  ,  , 
1Singapore Eye Research Insitute, A Member of SingHealth, 2DUKE-National University of Singapore Medical School, 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 4Singapore National Eye Center, 5Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este informe describe un método para inducir ojo seco autoinmune crónico en ratas Lewis mediante inmunización con una emulsión de extracto de glándula lacrimal de rata, ovoalbúmina y adyuvante completo de Freund, seguido de la inyección de extracto de glándula lagrimal y ovoalbúmina en la subconjuntiva forniceal y glándulas lacrimales Seis semanas después.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad de los ojos secos es una condición muy común que causa morbilidad y carga de salud y disminuye la calidad de vida. Existe la necesidad de un modelo de animal de ojo seco adecuado para ensayar terapias nuevas para tratar condiciones de ojo seco autoinmunes. Este protocolo describe un modelo de rata de ojo seco autoinmune crónico. Las ratas Lewis se inmunizaron con una emulsión que contenía extracto de glándula lagrimal, ovoalbúmina y adyuvante completo de Freund. Una segunda inmunización con los mismos antígenos en adyuvante incompleto de Freund se administró dos semanas más tarde. Estas inmunizaciones se administraron subcutáneamente en la base de la cola. Para aumentar la respuesta inmunológica en la superficie ocular y las glándulas lacrimales, se inyectaron extracto de glándula lagrimal y ovoalbúmina en las glándulas subconjuntivas y lagrimal forniceal 6 semanas después de la primera inmunización. Las ratas desarrollaron características de ojo seco, incluyendo producción de lágrima reducida, menor estabilidad al desgarro y mayor daño corneal. Inmune proLa presentación por citometría de flujo mostró una preponderancia de células T de memoria efectoras CD3 + en el globo ocular.

Introducción

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La enfermedad ocular seca (DED) es una enfermedad multifactorial de las lágrimas y la superficie ocular que resulta en síntomas de malestar, alteración visual y la inestabilidad de la película lagrimal, que puede causar daño a la superficie ocular. Se acompaña de una mayor osmolaridad de la película lagrimal y de inflamación de la superficie ocular 1 . Los síntomas asociados con DED son ardor, picadura, ronquera, sensación de cuerpo extraño, desgarro, fatiga ocular y sequedad 2 , 3 . Las dos principales causas de DED son la reducción de la producción de lágrimas por la glándula de secreción lagrimal y la evaporación excesiva de la película lagrimal 4 . En pacientes con enfermedades autoinmunes, como el síndrome de Sjögren, el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide, el daño inmune a las glándulas meibomianas reduce la expresión de lípidos esenciales para la estabilidad del desgarro. Además, el daño inmunológico a la superficie ocularDe las mucinas importantes para la humectabilidad superficial. Juntos, estos procesos acumulativamente causan el ojo seco crónico 5 , 6 , 7 .

El reemplazo de lágrimas y la terapia anti-inflamatoria son los pilares de la terapia. Sin embargo, las actuales terapias anti-inflamatorias para DED ( es decir, corticosteroides y ciclosporina) son ampliamente inmunosupresoras, lo que conduce a graves efectos adversos [ 8 , 9 , 10] . Existe la necesidad de un modelo animal adecuado para ensayar nuevos agentes inmunomoduladores para tratar el ojo seco autoinmune.

Los ratones con defectos genéticos específicos 11 , 12 , 13 , ratones que carecen de genes específicos 14 , 15 , y ratones transgénicos sobreexpresar inmunorreguladorOry genes se han utilizado como modelos de ojo seco autoinmune 16 , 17 . También se han descrito modelos animales autoinmunes inducidos por antígeno en ratones 18 , conejos 19 y ratas 20 , 21 . Aquí, describimos un modelo inducido por antígeno de ojo seco autoinmune crónica. Este modelo es una modificación de dos modelos anteriores; Uno usó extractos de glándula lagrimal y el segundo usó un autoantígeno ( es decir, klk1b22) de las glándulas lagrimales 20 , 21 .

La enfermedad se indujo por inmunización subcutánea de ratas Lewis hembra de 6 a 8 semanas de edad con ovoalbúmina, adyuvante completo de Freund, y una emulsión que contenía extractos de glándula lagrimal de ratas Sprague-Dawley ( Figura 1 ). Una segunda inmunización con el mismo antígeno en adyuvante incompleto de Freund fueAdministrado dos semanas más tarde. Para reclutar células inmunitarias específicas de antígenos a la glándula lagrimal y la superficie ocular, se inyectó una mezcla de extracto de glándula lagrimal y ovoalbúmina (1 mg / ml) en la subconjuntiva forniceal y en las glándulas lacrimales de la 6ª a la 7ª semana ( Figura 1 ). Más del 85% de las ratas desarrollaron rasgos característicos del ojo seco 70 días después de la primera inmunización. Estas características incluyen la reducción de la producción de lágrimas ( Figura 2 ], el aumento de coloración de la fluoresceína corneal ( Figura 3 ], y la disminución de la estabilidad al desgarro ( Figura 4 ]. El perfil inmune de las células T en los globos oculares de ratas normales mediante citometría de flujo revela una preponderancia de células T de memoria efectora CD3 + ( Figuras 5 y 6 ). Las ratas con DED autoinmune muestran un aumento en las células T de memoria efectoras CD3 + y una disminución correspondiente en las células T naïve y de memoria central ( Figura 6 ).

Protocolo

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Los animales fueron manejados de acuerdo a las pautas institucionales y la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth.

1. Preparación del extracto de glándula lacrimal

NOTA: Las ratas se anestesiaron con la inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). La anestesia adecuada fue confirmada por el pinzamiento de la punta y el pellizco de la cola. Se aplicó gel oftálmico a los ojos de rata para prevenir la sequedad después de cada procedimiento. Las ratas anestesiadas se colocaron bajo luces infrarrojas lejanas para mantener a los animales calientes hasta que se recuperaron completamente. Durante los procedimientos y el tiempo de recuperación, los animales fueron vigilados de cerca por los investigadores. Todos los materiales y herramientas quirúrgicas estaban estériles antes de su uso. Al final del experimento, las ratas fueron eutanasiadas por la inyección intraperitoneal de pentobarbital (80 mg / kg).La eutanasia completa se verificó por falta de pulso cardiaco y ningún reflejo parpadeante al tocar el globo ocular. Las ratas se alojaron en condiciones estándar: temperatura ambiente, 21-23ºC; Humedad relativa, 30-70%; Ciclo luz-oscuridad, alternando 12 h (7 AM a 7 PM).

  1. Coloque las ratas Sprague-Dawley hembra eutanasia (rango de edades de 8 semanas a 16 semanas) de forma plana, con un oído contra la mesa y el otro hacia arriba. Haga una incisión de 10 mm superior-inferiormente bajo el oído expuesto con un par de tijeras de resorte. Retire la glándula lagrimal diseccionándola del tejido conectivo circundante y del conducto de drenaje.
    1. Guarde las glándulas a -80 ° C hasta que se requiera. Descongele las glándulas en hielo. Triture tan finamente como sea posible en hielo con tijeras. Añadir 150 μL de PBS con 1x inhibidor de proteasa por glándula lagrimal.
  2. Sonicar las muestras en hielo durante 5 min a 20 kHz con el sonicador establecido a 10 s on, 10 s off a 30% de amplitud. Centrifugar al hijoDurante 20 minutos a 13.000 xg y 4 ° C.
  3. Pipetar el sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo. Alícuota del sobrenadante a tubos de 1,5 ml y almacénelos a -80 ° C. Mida la concentración de proteína con un ensayo de ácido bicinconínico 22 , según las instrucciones del fabricante.

2. Preparación de la emulsión y toxina de la tos ferina

  1. Emulsión
    1. Añadir 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra, eliminado por calor, en 10 ml de adyuvante de Freund completo que contiene 1 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra y mezclar bien.
      NOTA: El adyuvante completo de Freund contiene 5 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
    2. Pesar la ovoalbúmina, disolverla en PBS y preparar una mezcla de antígenos que contenga 2 mg / ml de ovoalbúmina y 10 mg / ml de extracto de glándula lagrimal. Con el objetivo de obtener un volumen de inyección de 200 μl para cada animal, preparar una mezcla maestra bSobre el número de animales.
    3. Transferir el adyuvante de Freund incompleto o el adyuvante de Freund completo a un tubo de 50 ml, asegurando que el volumen de adyuvante a la mezcla de antígenos esté en una proporción de 1: 1. Añadir la mezcla de antígeno gota a gota al adyuvante mientras se agita con la velocidad más alta que no da lugar a derrames. Continuar vortexing durante 5 min después de todo el antígeno se ha añadido.
    4. Transferir la emulsión a una jeringa de 5 ml y vincularla con otra jeringa de 5 ml a través de un conector de jeringa. Empuje la emulsión de una jeringa a la otra para mezclarla.
      NOTA: La emulsión está lista si una sola gotita permanece como una esfera cuando se coloca en agua. Sólo debe usarse emulsión o emulsión recién preparada almacenada durante la noche a 4ºC.
  2. Toxina pertussis
    1. Reconstituir 50 μg de toxina pertussis en 500 μl de agua para obtener una concentración final de 100 ng / μl. Votex el contenedor durante 30 s para asegurarse de que el tLa oxina se disuelve completamente.
      NOTA: No esterilice por filtración, ya que esto resultará en una pérdida de material. No congelar. Esta solución permanece activa durante al menos 6 meses a 4 ° C.
    2. Diluir 100 ng / μl de toxina pertussis a 3 ng / μl usando PBS. Transferir 100 μL de la toxina de pertussis diluida a una jeringa de inyección Luer-lock de 1 ml con una aguja de 27 G.

3. Inmunización de las ratas Lewis

  1. El día 0, mezcle la emulsión unas cuantas veces. Distribuir 200 μl de la emulsión, que contiene 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en adyuvante completo de Freund, en jeringas de 1 ml de Luer con agujas de 27G. Inyectar la emulsión subcutáneamente en la base de las colas de rata sin anestesia.
    NOTA: La cola no necesita ser precalentada antes de la inyección. Cada rata se inmuniza con 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en adyuvante completo de FreundH 500 μg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
  2. En el día 14, inyectar 200 μl de la emulsión, que contiene 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en adyuvante incompleto de Freund, de la misma manera que el día 0. Inyectar 300 ng de toxina pertussis en 100 μl de PBS intraperitonealmente Por rata en el mismo día.

4. Inyección de la Mezcla de Antígenos en la Subconjuntiva Forniceal y la Glándula Lacrimal para Reclutamiento de las Células Inmunes Específicas del Antigeno y Causa de Inflamación Local

  1. Calcular la cantidad de ovoalbúmina y extracto de glándula lagrimal basándose en el número de ratas en el experimento. Pesar la cantidad requerida de ovoalbúmina y combinarla con el extracto de glándula lacrimal descongelado preparado en el paso 1, haciendo que la solución de antígeno contenga 1 mg / ml de ovoalbúmina y 1 mg / ml de extracto de glándula lagrimal.
  2. Anestesiar las ratas con ketamina (75 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) por inyección intraperitoneal. Pellizcar elDe ratas para asegurar que se ha logrado la anestesia adecuada ( es decir, no se observa movimiento de respuesta después de la pinzadura). Inyectar 5 μl de antígeno en la subconjuntiva forniceal del ojo. Inyectar 20 μl de antígeno en la glándula lagrimal.

5. Evaluación de las características de los ojos secos

NOTA: Para los pasos 5.1-5.3, las ratas anestesiadas deben mantenerse suavemente con una mano enguantada en posición vertical sobre una superficie plana para evitar el movimiento.

  1. Mida el volumen de lágrima con hilo rojo de fenol.
    1. Utilice un par de pinzas para sujetar el hilo y otro para tirar del párpado inferior de la rata. Coloque el hilo en la esquina proximal del fórnix inferior durante 1 minuto y luego retire el hilo.
      NOTA: Las lágrimas hacen que la parte húmeda del hilo sea de color rojo.
    2. Tome una imagen de la longitud de la parte mojada del hilo junto a una regla con marcas milimétricas. Mida la longitud húmeda hasta la décima parteFa milímetro utilizando un software de imagen ( por ejemplo, ImageJ).
  2. Medir la lentitud de la córnea / desgarro.
    1. Coloque la rata bajo un estereomicroscopio equipado con un iluminador de anillo y una cámara. Aplique 5 μL de solución salina a la córnea de la rata. Parpadea pasivamente moviendo los párpados superior e inferior con los dedos enguantados ~ 5 veces para esparcir la solución salina.
    2. Enfoque el iluminador de anillo en el centro de la superficie de la córnea con una ampliación de 1,6x. Adquirir imágenes fotográficas después de 10 s.
      NOTA: El iluminador de anillo proyecta dos filas circulares de imágenes de puntos en las córneas del animal. El espaciamiento regular de los puntos no distorsionados sugiere una capa córnea / lágrima lisa.
  3. Mida el daño corneal con tinción fluoresceína.
    1. Añadir 2 μl de fluoresceína al 0,2% a la córnea de la rata. Abra y cierre los párpados de la rata tres veces con un dedo enguantado para esparcir el colorante de fluoresceína en la superficie del ojo.
    2. Después de 1 min, extraer 1 ml de solución salina con una jeringa de 3 ml (sin ningún accesorio de la aguja), colocar la jeringa unos 2-3 mm antes de la córnea, y propulsar suavemente la solución salina sobre el ojo.
    3. Adquirir imágenes bajo el filtro azul cobalto ( es decir, ~ 400 nm) de un microscopio de imágenes oculares con las luces de fondo apagadas.
      NOTA: Las imágenes fueron posteriormente analizadas por un sistema de clasificación modificado de publicaciones anteriores 23 . Las imágenes se analizaron mediante la clasificación subjetiva del número, área e intensidad de las manchas verdes de 0 a 2, donde 0 indica su ausencia, 1 indica tinción puntiforme de menos de 50 puntos, y 2 indica tinción puntiforme de más de 50 puntos.
  4. Eutanasia de las ratas a través de la inyección intraperitoneal de pentobarbital (80 mg / kg). Quite los párpados superior e inferior usando las tijeras. Fijar y prolapso de los globos oculares empujando hacia abajo en los tejidos perioculares con fórceps. Libera el globo cortando tLos músculos extraoculares, el nervio óptico y la conjuntiva forniceal.
  5. Fije la posición del globo ocular de la rata con fórceps y ábralo con una incisión circunferencial a lo largo del ecuador. Retire la lente y vítreo. Coloque los ojos disecados en tubos de 1,5 mL en hielo.
  6. Recoger las glándulas lacrimales, como se describe en el paso 1.1. Trasladar inmediatamente los tejidos del globo ocular disecados y las glándulas lagrimales al laboratorio para preparar el análisis de citometría de flujo.
  7. Aislado las células inmunes con colagenasa y dispase II métodos de digestión 24 , 25 . Proceder a utilizar la citometría de flujo para perfil de la subpoblación de células T en los tejidos del globo ocular [ 26] .
    Los anticuerpos anti-CD45APC-Cyanine7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22), anti -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50), y el colorante celular de viabilidad 7-AAD. Entre los CD45 + CD3 + 7AAD - células de la memoria de efector (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - ), naïve (CD3 + CD45RC + ) y memoria central (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) .

Resultados

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La figura 1 ilustra el diseño del experimento. Tanto en el día 48 como en el día 70, se evaluaron las características clínicas del ojo seco en las ratas inmunizadas. El volumen de lágrima está representado por la longitud de la parte húmeda del hilo rojo de fenol. La Figura 2 muestra imágenes representativas de hilos de rojo fenol de ratas control y DED. La longitud de los hilos de rojo fenol en el grupo DED es más corta que el grupo de control, indicando un menor volumen de lágrimas.

La fluoresceína se une al epitelio corneal dañado. Por lo tanto, el daño de la córnea se mide mediante tinción con fluoresceína corneal. Las manchas de fluoresceína en la superficie corneal de las ratas DED se clasificaron de 0 a 2 y se compararon con las ratas de control. Las ratas con DED tienen más tinción con fluoresceína que las ratas control ( Figura 3 ), lo que sugiere daño corneal.

La suavidad cornealEn las ratas DED y de control se evaluó mediante el iluminador de anillo. Si la superficie corneal es lisa, con alta estabilidad al desgarro, la imagen del anillo iluminador en la superficie ocular es redonda y perfecta. La distorsión de la imagen indica una suavidad corneal reducida y una película lagrimal inestable. El grado de distorsión del anillo se clasificó de 0 a 2. Se observó un nivel de distorsión de anillo más alto en el grupo DED ( Figura 4 ), indicando una menor estabilidad al desgarro.

Las ratas se definen como tener ojo seco cuando al menos dos características clínicas del ojo seco son anormales. Entre las 24 ratas inmunizadas, 21 ratas desarrollaron DED al día 48. Los resultados fueron consistentes cuando se evaluaron al día 70.

El análisis de citometría de flujo muestra que el subgrupo de células T predominante en tejidos normales de globo ocular de rata son células T de memoria efectoras ( Figura 5 ). En los globos oculares de las ratas DED, ~ 70% del CD3+ T son células T efectoras de memoria, mientras que en ratas control, este número es ~ 50%. Los globos oculares de las ratas DED tienen células T de memoria efectoras significativamente más altas que las de las ratas de control ( Figura 6 ).

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Figura 1: Esquema del Diseño Experimental. LG: glándula lagrimal; DED: enfermedad ocular seca; CFA: adyuvante completo de Freund; IFA: adyuvante incompleto de Freund. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: El hilo de rojo fenol mide el volumen de desgarro. El hilo rojo de fenol se coloca en la esquina proximal de ambos ojos de rata durante 1 minuto y luego se retira. RepresentativoSe muestran las imágenes del hilo rojo de fenol, junto con una regla, de los grupos control y DED. ImageJ se usó para medir la longitud de la parte húmeda de los hilos rojos de fenol. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes representativas del daño epitelial corneal medido por tinción con fluoresceína. Cada córnea de rata se tiñó con fluoresceína al 0,2% durante 1 min y se enjuagó con al menos 1 ml de solución salina. Las imágenes fueron tomadas bajo un microscopio de imágenes oculares con luz azul cobalto. La primera columna muestra imágenes representativas de las córneas de control. La segunda columna contiene imágenes representativas de tinción corneal de ratas con características de DED. Los puntos fluorescentes verdes indican epitelio corneal L daño. Todas las imágenes fueron producidas en la misma escala de color. La cuantificación de la tinción con fluoresceína se realizó de acuerdo con el área y la densidad de las manchas verdes. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes representativas de la córnea que muestran la reflexión del iluminador del anillo. La lentitud corneal / lágrima de la rata se midió mediante un iluminador de anillo. El grado de distorsión del anillo en las imágenes capturadas es una medida de la estabilidad relativa del desgarro. La columna de la izquierda muestra las imágenes representativas en los animales de control, y la columna de la derecha muestra imágenes representativas después de la inducción del ojo seco. Barra de escala = 1 mm.Ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Gráficos de puntos derivados del análisis de citometría de flujo. Las células T aisladas de tejidos del globo ocular se tiñeron con un panel de anticuerpos. En la CD45 + CD3 + 7AAD - población, CD3 + 7-AAD - T células fueron cerradas. Entre las células T CD3 + 7-AAD, se determinaron las poblaciones de linfocitos T de memoria central, y de memoria efectoras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Perfil de subpoblación de células T en los globos oculares. CD3 + CD45RC+ Células T CD3 + CD45 - CD44 + CD62L - memoria T efectoras T (T EM ) y células CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + de memoria central T (T CM ) se presentan como el porcentaje de células T CD3 + . Los resultados son de 3 ratas de control y 6 de DED ratas. Se obtuvieron resultados similares a partir del análisis de células T de glándulas lacrimales aisladas (datos no mostrados). Se utilizó la prueba t de Student para la comparación estadística. Las barras de error representan el SD. * P <0,05, ** p <0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Un paso crítico de este protocolo es asegurar la homogeneidad de la emulsión. En emulsiones bien preparadas, los antígenos están completamente recubiertos con aceite, lo que garantiza la liberación lenta del antígeno inyectado y la estimulación inmune continua. Otra característica crítica de este protocolo es el uso de ratas Lewis. Lewis ratas son más sensibles al desarrollo de la enfermedad autoinmune que otras cepas [ 27] .

Este protocolo ha sido modificado a partir de dos protocolos publicados anteriormente, que ya sea sólo lagarto glándula extracto o recombinante Klk1b22 [ 20 , 21] . En el protocolo actual, la ovoalbúmina más extracto de glándula lagrimal se utilizan como el antígeno, y las células inmunitarias específicas del antígeno se atraen a la superficie ocular y la glándula lagrimal, induciendo daño de tejido local. El ojo seco se desarrolla lentamente, alcanzando ~ 85% al ​​día 48 después de la inmunización inicial. Desafío antigénico alOjo y glándula lagrimal en el día 48 exacerba el ojo seco y asegura su cronicidad hasta el día 70.

Comparado con el Klk1b22 recombinante en el modelo DED inducido por Klk, el extracto de glándula lagrimal y la ovoalbúmina usados ​​en el modelo actual son más baratos y más fáciles de obtener. El extracto de glándula lagrimal contiene también otras proteínas, aparte de Klk, que pueden inducir autoinmunidad, por lo que este extracto es teóricamente más potente que el método Klk para inducir DED. También hemos tratado de inmunizar a las ratas sólo con extracto de glándula lagrimal; Aunque estas ratas inmunizadas desarrollaron DED, no hubo un aumento significativo de las células T de memoria efectoras en tejidos del globo ocular en comparación con los controles.

La limitación de esta técnica es que se tarda 70 días en alcanzar el modelo. Las células T de memoria efectoras son los subconjuntos principales de células T en el ojo normal de rata. En este modelo, DED autoinmune da lugar a un aumento en células T de memoria efectoras CD3 + en el globo ocular. Los medicamentos queSuprimen de forma eficaz las células T de memoria efectoras, tales como inhibidores selectivos del canal de potasio Kv1.3, pueden por lo tanto tener un beneficio terapéutico en el DED 28 autoinmune.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés. LT recibió financiamiento previo y / o regalos de Alcon, Allergan, Santen, Bausch y Lomb, Eyelens y Eyedetec.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a la Sra. Tin Min Qi ya la Dra. Veluchamy Amutha Barathi ya su equipo por su ayuda en el manejo de los animales. Este trabajo fue apoyado por NHIC-I2D-1409007, Fundación SingHealth SHF / FG586P / 2014, y NMRC / CSA / 045/2012.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivoscóctel de
la proteasaSigma-AldrichP2714-1BTL
Pierce BCA Protein Assay KitThermal Scientific23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Becton, Dickinson y compañía231141
el adyuvante completo de FreundBecton, Dickinson y compañía231131
ovoalbúminaSigma-AldrichA5503-10G
adyuvante de Freund incompleto Sigma-AldrichF5506-6X10ML
toxina de la tos ferina Sigma-AldrichP7208-50UG
solución de fluoresceína sódicaBausch & Lomb U.K LimitedNA
strong>Name>CompanyNúmero de catálogoComentarios
>Equipment
SonicatorSonics Vibra-Cell
fenol hilo rojoTianjin Jingming Nuevo desarrollo tecnológico Co. LTD.
Microscopio estereoscópico NA con iluminador de luz anular y cámaraCarl ZeissMicroscopio NA
Micro IV Laboratorios de Investigación de PhoenixNA
inhibidores de <

Referencias

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