Uso de transmisión óptica extraordinaria para cuantificar marcadores cardíacos en suero humano

Sensores químicos basados en arreglos de discos de nanohole han sido objeto de numerosas investigaciones desde que se publicó el primer informe sobre transmisión óptica extraordinaria (EOT) por Ebbesen et en 1998¹. Cuando la luz incide sobre arreglos periódicos de nanohole estructuras de dimensiones sub-longitud de onda, mayor la transmisión ocurre a longitudes de onda específicas. Esto ocurre cuando la luz del incidente parejas con onda de Bloch superficie polaritones (BW-SPP) o localizada plasmones de superficie (LSP)².

El principio físico subyacente aprovechado cuando biodetección con tales matrices periódicas es simple. Adsorción de moléculas sobre o cercana a la interfase del metal cambia la constante dieléctrica del medio en contacto con el metal, a su vez cambiando la ubicación de las bandas de transmisión en el espectro. El espectro se puede ajustar por nano-ingeniería de la forma, tamaño y separación distancia^3,4,5. Por diseño, sensores basados en EOT tienen bandas características en sus espectros que facilitan tareas específicas^6,7,8 durante la investigación de eventos de enlace molecular. Esto es una ventaja crucial sobre plataformas de resonancia (SPR) de plasmón superficial disponible en el mercado.

Sensores con EOT típicamente involucran una fuente de luz alineada ópticamente tal que un haz colimado es incidente sobre la superficie de detección. Técnicas para generar nanohole grandes superficies, como plantillas de copolímero e interferencia y litografía nanosphere, tienen pobre reproducibilidad⁹. Debido a estas limitaciones en la fabricación precisa de grandes superficies que muestran el fenómeno EOT, un microscopio óptico fue requerido para posicionar correctamente el detector y la fuente de luz. Para simplificar la técnica, la litografía de alta calidad nanoimprinting fue empleado (NIL)¹⁰ . Esto permitió la producción de sensores grandes superficies¹¹ (escala de mm), eliminando la necesidad de un microscopio buscar la superficie de detección en un chip. En cambio, este sensor se podría interconectar fácilmente con un cable óptico de fibra estándar.

Desde los picos de transmisión para esta matriz nanohole están contenidos en el espectro visible a la región del infrarrojo cercano (NIR), se adapta perfectamente a la detección de eventos de enlace de biomoléculas en un ambiente acuoso. Se simuló el comportamiento óptico de la matriz nanohole. El resultado entonces se verificó a través de estudios con líquidos estándar índices de refracción (RI). Esta matriz entonces fue utilizada para medir la concentración de troponina cardíaca I (cTnI) en el complejo fondo de suero humano. cTnI es el criterio clínico para el diagnóstico de infarto agudo de miocardio.

Con este sensor, es posible detectar y cuantificar la cTnI en suero humano en un límite de detección (LOD) de 0.55 ng/mL, que es clínicamente relevante. La detección es mucho más rápida que la más utilizada la tecnología en este dominio, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Además, la superficie de detección puede fácilmente ser regenerada y por lo tanto reutilizados. Por lo tanto, este trabajo demuestra la promesa de nanohole matrices como viable tecnología point-of-care (POC) para biodetección en biofluidos complejo.

1. fabricación de los sensores y adquisición de los datos

1. Preparación del molde de níquel
   1. Capa una capa de nm de grosor 220 de haz de electrones negativos resistir en una oblea de 600 μm de espesor 4 en silicio. Escriba la matriz nanohole diseñado sobre esta oblea mediante un sistema de litografía de haz de electrón.
      1. Para acelerar el haz e escribir, escribir los patrones con un dotmap bajo (N) de 20k para cada tamaño de campo de 300 μm (A) (es decir, allí son 0,4 billones puntos asignados en cada área de² 300 μm, y cada punto o bien ser expuesto por e-beam o no dependiendo del diseño del patrón). La dosis de exposición de resistir e la viga para resistir a μC 110 cm⁻² y escribir a una corriente (I) de 800 PA.
         Nota: En la escritura de e-beam, la dosis de exposición (D) es controlada por el tiempo de exposición para cada punto (_puntode T), calculada por . Para la dosis de exposición a 110 μC cm⁻², el tiempo de vivienda e la viga en cada punto expuesto es 0,5 μs¹². Puesto que la matriz de captura un área de 1,8 mm², hay un total de 36 parches de 300 μm² zonas suturan a forma un array de nanohole grande, oro.
   2. Desarrollar la resistencia sumergiendo la oblea de silicio de 4 pulgadas en la solución de revelado para 10 s y dejando la oblea seca en aire.
   3. Depositar una capa de la semilla de un metal, tales como níquel, cobre o aluminio, en la oblea de silicio.
   4. Electrochape la oblea en un sistema de revestimiento en un baño de Sulfamato de níquel. Llevar a cabo la electrodeposición en dos pasos. En el primer paso, duración 95 min, utilizar una densidad de corriente de 0.7 A dm⁻²; esta completamente llena la nanopatrones níquel. En el segundo paso, duración 125 minutos, utilizar 12 A dm⁻² para llegar a 300 μm como el espesor de molde final níquel (20 nm). Que el valor de pH a 3.5-3.8 y que la temperatura es entre 52 y 54 ° C.
   5. Separar el molde de níquel del substrato de silicio mediante la aplicación de fuerza mecánica suave. Sumerja el molde de níquel en 100 mL de reactivo de retiro photoresist positivo durante la noche para lavar el residuo de resistir e-beam.
   6. El molde de níquel de alimento en un horno y seco a 100 ° C para 3 h limpiar en un plasma aguafuerte sistema con gas de₂ O a 10 sccm y 100 W durante 3 minutos.
2. Fabricación de la nanoestructura oro
   1. 150 μL de heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl triclorosilano (FDTS) de la capa en el molde de níquel en una uno mismo-montaje máquina de capa de monocapa (SAM) a 80 ° C.
      Nota: Esto formará una capa de anti-pegamento, que permitirá la separación del molde de la fotoresistencia ("desmoldeo") después de completar el paso de nanoimprinting. El tiempo de vaporización debe ser 180 s y el tiempo de reacción debe ser 900 s.
   2. Pie de imprenta nanopatrones sobre un 4 - en oblea de vidrio que ha sido recubierta con una capa de nm de espesor 300 de foto-curable NIL resistir utilizando a un imprinter nano a una presión de 10 bar y una temperatura de 40 ° C durante 10 minutos.
   3. Transferir el molde, la fotoprotección y la oblea del vidrio a la luz UV curado sistema y photocure con 75 mW cm^-2 de la exposición UV de 30 s.
      Nota: Si se han seguido todos los pasos correctamente, el molde de níquel debe fácilmente ser demolded de la fotoresistencia.
   4. En un ion reactivo aguafuerte sistema (RIE), realizar un etch en blanco de la fotoresistencia en el substrato de cristal, con un flujo de gas de₂ O de 10 sccm, 50 W 2 s para exponer el vidrio en las áreas de sangrado.
   5. Depositar una capa de nm de espesor 5 de cromo (Cr) para la adherencia del metal y una capa de 100 nm de oro (Au) para el sensor plasmónica en la oblea del vidrio en una máquina de deposición de haz de electrones. Utilice una tasa de deposición de 1 Å s⁻¹ para Cr y 2 Å s⁻¹ para Au.
   6. Realizar el despegue de la fotoresistencia por plasma de₂ O grabado por 3 min, seguida por un paso de Sonificación del 15-s en acetona.
   7. Cortar la muestra en fichas de 5 x 5 mm. La matriz nanohole ocupará la central 2 mm × 2 mm de la viruta.
3. Adquisición de los datos
   1. Configurar el aparato para realizar mediciones ópticas tal que un haz de luz blanca que sale a través del extremo de la fibra óptica de transmisor es colimado y es incidente sobre la superficie del sensor (nanohole array) a 90°.
      Nota: La luz es transmitida a través de la matriz nanohole todo.
   2. Recoger la señal transmitida con el receptor de fibra óptica y grabarlo con un espectrómetro UV-visible de funcionamiento dentro de la gama de 300 a 1000 nm.
   3. Configurar el tiempo de adquisición para cada fotograma a 20 ms. promedio 100 marcos para obtener el espectro final para reducir el ruido en las mediciones.
   4. Utilizar software de trazado para analizar los datos basándose en los picos de transmisión previamente identificado (utilizando un método basado en Lorentz).

2. sensor prueba de sensibilidad a granel

1. Depositar el líquido estándar de la RI en la célula del líquido, con el RI varía de 1.31 a 1,39.
2. Sumerja la viruta del sensor en el estándar líquido de RI y alinearse con el haz de luz blanca. Obtener el espectro de transmisión.
3. Limpiar la viruta del sensor después de cada medición con un reactivo de limpieza tensoactivos y secarla con gas nitrógeno.

3. sensor modificación superficial

1. Antes de las modificaciones químicas, limpie las virutas del sensor por inmersión secuencial en isopropanol, acetona y agua desionizada. Seco a temperatura ambiente en una corriente de gas nitrógeno seco.
2. Incubar las virutas del sensor en una solución de etanol de 0,4 mM 10-carboxi-1-decanethiol y 1,6 mM 1-octanethiol de 12 h a temperatura ambiente.
   Nota: Esto formará una amina reactiva autoensamblaje monocapa (SAM).
3. Utilizar el etanol para enjuagar bien y secar a temperatura ambiente.
4. Hacer una mezcla de 75 mM sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) y 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC). Sumerja las fichas en esta mezcla durante 15 minutos.
   Nota: Esto activará el grupo carboxílico del SAM.
5. Spot 50 μl de 200 solución de anticuerpo anti-troponina μg/mL en un tampón de acetato pH 4.5 en la superficie del sensor e incubar durante 30 minutos.
6. Desactivar los ésteres sumergiendo la viruta del sensor en la solución de etanolamina-HCl de 1 M durante 15 min.
7. Enjuague el chip con agua desionizada y secar en una corriente de gas nitrógeno seco a temperatura ambiente.

4. ensayo de cTnI

1. Bloquear cualquier atascamiento no específico telescopio 100 μl de solución de albúmina de suero bovino (BSA) de 1% sobre la superficie.

5. medición de resonancia (SPR) de plasmón superficial

1. Ejecutar el chip de sensor SPR multiplexado en el sistema SPR con tampón PBS-T.
   Nota: La composición del tampón de PBS-T es fosfato de Na de 20 mM, 150 mM NaCl y 0.05% Tween 20. El pH es 7.4.
2. Utilizar estándar de cTnI y el anticuerpo, como se describe en el paso 4.
3. Activar 3 de los 6 canales disponibles con una mezcla de (0,2 M) de EDC y sulfo-NHS (0,05 M) por 5 min realizar una inyección de 5 min de 50 μg/mL de anticuerpo 560 y una inyección de 5 min de la solución de etanolamina-HCl de 1 M.
4. Girar 90° la viruta del sensor e inyectar los estándares de cTnI a diferentes concentraciones (75 30, 7.5 y 2.5 ng/mL).
5. Observa la conjugación del anticuerpo en los puntos de interacción en el chip en tiempo real a través de la lectura de la SPR.
6. Regenerar el chip mediante la inyección de 50 mM glicina-HCl (pH 2) durante 1 minuto.

La configuración óptica para medición se muestra en la figura 1A. Una imagen de la matriz nanohole real se da en la figura 1B. Para entender la física de conducir el proceso de detección, se utilizó el software de simulación de COMSOL para simular la distribución de la plasmónica campo en un ambiente acuoso. Los resultados de la simulación fueron entonces relacionadas con la medición real. Un estudio previamente publicado contiene detalles de los supuestos y los parámetros utilizados en la simulación11,13. Las dimensiones físicas que se utilizan para simular el campo plasmónica para la matriz nanohole era como sigue: p = 400 nm, D = 150 nm y T = 100 nm. Absorción y efectos de la dispersión también se tienen en cuenta14 al calcular el espectro de transmisión. El espectro simulado es comparado con el espectro medido experimentalmente en la figura 1. La simulación y los espectros medidos transmitan la existencia de cuatro bandas de 450 a 850 nm. La banda a 495 nm corresponde a la transición interbanda de oro. Las tres bandas posteriores, de aquí en adelante llamadas bandas I-III en orden creciente de longitud de onda, se encuentra a 560 nm, 645 nm y 712 nm, respectivamente. Bandas-III fueron observados para tener una alineación aceptable a las bandas medidas experimentalmente, en 558 nm, 638 nm y 724 nm. Como los nanoholes fabricados casi de forma circulares, estas bandas no deben ser sensibles a la polarización de la luz incidente. Además, la simulación COMSOL permite la visualización directa de la distribución de cerca de campo de estas bandas como que ocurriría en una celda unidad de la estructura periódica (figura 1). La unidad en la barra de color es la distribución de campo óptico (V/m) expresada en una escala logarítmica. La intensidad máxima observada fue alrededor de 4.7 (50.119 V/m). En comparación con la intensidad de la incidencia en la simulación (4.340 V/m), esta magnitud representa una mejora del 11.5-fold campo. Los campos electromagnéticos para las bandas que i y III estábamos localizados en la superficie del sustrato de vidrio. En cambio, banda II fue localizada predominantemente en el borde superior de la nanohole y fue elegido para la detección de la bioanalyte. Figura 1E muestra los espectros de transmisión de la matriz nanohole en líquidos conocidos índices de refracción, que varió de 1.31 a 1,39. Tres bandas de transmisión, correspondiente a las bandas I, II y III, se observaron en la gama del espectro de 400-900 nm. Un cambio de rojo se observó un cambio en la RI. La magnitud del cambio seguido la venda de la secuencia II > banda I > banda III. Figura 1F es una consolidación de la red observada cambia de bandas I, II y III. La sensibilidad a granel calculado para banda fue 322 nm/RIU, para banda II 345 nm/RIU y para banda II fue 202 nm/RIU.

Figura 2A contiene el esquema del fenómeno de la percepción en acción. Figura 2B muestra el cambio en los espectros de transmisión después de que las moléculas de troponina se unen a la superficie del chip funcionalizados. A bajas concentraciones, hay un cambio lineal en la banda con el nivel de troponina. El cambio en la posición de la banda puede colocarse a un isoterma obligatorio con un valor de2 R de 0.995. Sobre la observación más cercana, 30 ng/mL parece ser la concentración en la cual el isoterma indica el inicio de la saturación (figura 2).

Figura 3A muestra la sensorgram de la interacción de suero con la superficie del chip de un chip modificado de GLC en una configuración de XPR36. La captura de cTnI es demostrada por el aumento de la señal. En consecuencia, la disociación de cTnI en un medio de SAFT (1 x PBS, 0,05% tween 20) puede observarse como las disminuciones de la señal de glicina de inyectables s. 120-660 (la solución de regeneración) durante 1 min reducción la señal a 0, que indica la regeneración de la superficie de detección a través de la completa retirada de cTnI. En el recuadro de la Figura 3Ase muestra el sensorgram para la posterior Asociación de cTnI a la superficie del chip regenerado. Se utilizó el mismo protocolo (es decir, sumergir en solución de glicina de 1 min) para regenerar la superficie de la matriz de nanohole. Figura 3B muestra que la posición de banda 2 cambia a su posición original, confirmando así el éxito de la etapa de regeneración.

Figura 1 : Caracterización de la matriz nanohole. Simplificado (A) esquema de la instalación experimental. Imagen de microscopio electrónico de barrido (B) de la matriz nanohole. (C) comparación entre el espectro simulado y el espectro de transmisión medido experimentalmente en un ambiente acuoso. Distribución (D) el campo cercano como simulada de COMSOL para las bandas I y III, visto en una vista de sección. El rojo representa la distribución de cerca de campo más fuerte. Es la unidad que se muestra en la barra de color | E |, la distribución del campo óptico, en escala logarítmica. (E) experimentalmente medir espectros de transmisión de la matriz nanohole en ambientes con líquidos de índice de refracción estándar (1.31 a 1,39). (F) a granel las sensibilidades de las bandas de tres transmisión (I-III) a los cambios en la RI en la visible a la gama NIR. Cuadrado negro: banda I, círculo rojo: Banda II, triángulo azul: Banda III. Se ha modificado la figura de Ding et al. 14 bajo una licencia CC BY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Matriz nanohole utilizada como un biosensor. (A) esquema de la matriz nanohole siendo utilizada como un biosensor para detectar cTnI. (B) el cambio en la transmisión de espectro del biosensor a interactuar con cTnI humano en una concentración de 30 ng/mL en un fondo de suero. Azul: antes de interacción, rojo: después de la interacción. El círculo punteado indica la banda siendo rastreada. (C) el cambio en la longitud de onda para la banda II a diferentes concentraciones de troponina (2,5 ng/mL 7,5 ng/mL, 30 ng/mL y 75 ng/mL).Las barras de error muestran la desviación estándar entre n = 3 virutas usadas para cada medición. Se ha modificado la figura de Ding et al. 14 bajo una licencia CC BY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Regeneración de la superficie del sensor. (A) un sensorgram SPR de XPR36 que muestra la inyección de analito (cTnI) seguida por la inyección de glicina para regenerar la superficie del sensor. Medidas de detección posterior de diferentes concentraciones de cTnI en el contexto de suero se muestran en el recuadro. La barra roja representa el valor inicial, mientras que la barra negra muestra la medición después de la regeneración de la superficie con el protocolo descrito en el texto. (B) el cambio en las longitudes de onda de la banda observada después de la regeneración de un chip de biosensor nanohole. Σ: desviación estándar de los cambios en la longitud de onda de la posición de la banda. Se ha modificado la figura de Ding et al. 14 bajo una licencia CC BY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores tienen intereses financieros que compiten.