Aquí, describimos un nuevo enfoque para infligir la lesión cerebral traumática de cabeza cerrada en Drosophila melanogaster . Nuestro método tiene la ventaja de entregar directamente impactos repetitivos con fuerza ajustable a la cabeza sola. Una mayor exploración del sistema de invertebrados ayudará a iluminar la patogénesis de la encefalopatía traumática crónica.
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Artículo de método
Un nuevo método para modelar la encefalopatía traumática crónica
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Resumen
Resumen
La encefalopatía traumática crónica (CTE) es una enfermedad neurodegenerativa establecida que está estrechamente asociada con la exposición a lesiones traumáticas cerebrales leves y repetitivas (mTBI). Los mecanismos responsables de sus complejos cambios patológicos siguen siendo en gran medida evasivos, a pesar de un reciente consenso para definir los criterios neuropatológicos. En este trabajo se describe un método novedoso para desarrollar un modelo de CTE en Drosophila melanogaster ( Drosophila ) en un intento de identificar los genes clave y las vías que conducen a la acumulación de tau hiperfosforilada característica y la muerte neuronal en el cerebro. Los impactos de fuerza ajustable para infligir heridas cerradas leves se entregan directamente a la cabeza de mosca, sometiendo la cabeza a aceleración y deceleración rápidas. Nuestro método elimina los problemas potenciales inherentes con otros modelos de mTBI de Drosophila ( por ejemplo, la muerte animal podría ser inducida por daño aOtras partes del cuerpo oa los órganos internos). Cuanto menor sea el trabajo y el costo de cuidados intensivos de los animales, la vida corta y herramientas genéticas extensas hacen la mosca de la fruta ideal para estudiar la patogénesis CTE y que sea posible realizar a gran escala, genoma amplia genética y pantallas farmacológicas. Anticipamos que la caracterización en curso del modelo generará ideas mecanicistas importantes sobre la prevención de enfermedades y enfoques terapéuticos.
Introducción
La encefalopatía traumática crónica (CTE) ha sido reconocida recientemente como un trastorno neurodegenerativo distinto, separado de otras tauopatías como la enfermedad de Alzheimer 1 . A diferencia de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías comunes-cuyos factores de riesgo más importantes son la edad avanzada y una historia familiar de demencia, CTE, como se indica por su nombre, implica una estrecha asociación con una historia de trauma cerebral, Como boxeadores y futbolistas, así como en veteranos militares 2 , 3 , 4 , 5 . Se cree que es iniciado por repetidos golpes concussive y subconcussive a la cabeza. Los pacientes pueden presentar síntomas y signos tales como déficits cognitivos, cambios de humor y comportamiento, y disfunción del movimiento, que se superponen significativamente con la enfermedad de Alzheimer, frontotemporalDemencia, demencia de cuerpos de Lewy y enfermedad de Parkinson 6 . En cambio, los exámenes post-mortem del tejido cerebral revelan un patrón distinto de acumulación de tau hiperfosforilada que rodea pequeños vasos sanguíneos en las profundidades de los surcos corticales, característica patognomónica que no se observa en otras condiciones degenerativas 7 . Sin embargo, hasta ahora, se sabe muy poco acerca de la patogénesis que conduce a la manifestación de la enfermedad. Esto se debe en gran parte a la falta de un modelo animal fiel - sólo recientemente se han generado modelos de roedores 5 , 8 . Estos organismos modelo tienen las desventajas de la atención costo-intensiva y una vida relativamente larga, que no son bien-adaptados para los estudios de la enfermedad neurodegenerative.
En comparación con los homólogos de mamíferos, los animales invertebrados como Drosophila son una excelente alternativa, con su mantenimiento rentable,Extensas herramientas para diseccionar determinantes genéticos y una vida relativamente corta 9 . Sorprendentemente, la mosca y el cerebro humano comparten las vías moleculares y celulares evolutivamente conservadas, así como las similitudes anatómicas 10 , 11 , 12 . Dos ingeniosos modelos de Drosophila para estudiar la lesión cerebral traumática han sido reportados previamente 13 , 14 . El primer dispositivo "High Impact Trauma" (HIT) diseñado por Katzenberger y sus colegas contenía moscas de movimiento libre en un vial de plástico que estaba atado al extremo libre de un resorte metálico 13 , 15 . Cuando el vial de plástico se inclinó verticalmente y se soltó, golpeó una almohadilla de poliuretano e impartió un traumatismo a las moscas cuando rebotaron en la pared del vial y se recuperaron. En contraste, Barekat y sus colegas diseñaron un método de entrega diferenteLa plataforma de homogeneización Omni Bead Ruptor-24 14 . Las moscas fueron incapacitadas con CO 2 y colocadas en un tubo de tornillo de 2 mL que se aseguró al homogeneizador y se sometió a condiciones de agitación preprogramadas. Un beneficio de usar el sistema homogeneizador de tejidos es que el experimentador podría modular la intensidad de la lesión, la duración de la lesión y el número de episodios de lesiones. Sin embargo, ambos regímenes sufren el mismo inconveniente: las lesiones primarias en la cabeza se infligen aleatoriamente en términos de localización y fuerza del impacto. Además, ambos métodos dieron como resultado una mortalidad considerable, causada por daños colaterales inevitables a otras partes del cuerpo y órganos internos. Aquí, describimos un nuevo método para inducir mTBI en las moscas de la fruta. Nuestro aparato consiste en un impactador balístico propulsado por gas. En comparación con los modelos 14 , 15 de Drosophila existentes, nuestro método tiene la ventaja, Dirigido solamente al cabezal de mosca libre, permitiendo así el control preciso de varios factores, tales como la severidad del impacto, el intervalo de tiempo entre impactos y el número total de impactos sostenidos.
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Protocolo
1. Montaje del Dispositivo de Huelga ( Figura 1 )
- Retire el émbolo de una jeringa de tuberculina de 1 ml. Corte el barril en la marca de 1 mL.
- Retire una barrera de aerosol (3 mm de altura x 4 mm de diámetro) de una punta de pipeta de 200 μL y úsela como un impactador. Coloque el impactador dentro del cilindro de la jeringa. Golpee suavemente el cañón para mover el impactador al extremo de la punta, con el lado plano que cubre la abertura de la boquilla.
- Conecte el extremo de la punta del cañón a un tubo de plástico que esté conectado al regulador de flujo de dióxido de carbono (CO 2 ) de una estación de anestesia Drosophila .
- Sujete el cañón verticalmente y sujételo a un soporte de sujeción estándar para que el impactador permanezca en la parte inferior del cañón.
- Modifique una punta de pipeta de 200 μL para hacer el soporte de la mosca.
- Corte 4 mm de la punta para hacer una abertura de 0.8 mm de diámetro, permitiendo que sólo la cabeza de la mosca para ser expuestos.
NOTA: El thoRax y todas las otras partes del cuerpo de la mosca se mantendrá dentro de la punta de la pipeta.
- Corte 4 mm de la punta para hacer una abertura de 0.8 mm de diámetro, permitiendo que sólo la cabeza de la mosca para ser expuestos.
- Modifique una punta de pipeta de 1000 μL y una tapa de aguja de 1 ml para hacer el conector.
- Cortar 44 mm de la abertura de la punta. Tome una longitud de 6 mm de una tapa de la aguja de la jeringa de 1 ml y empuje firmemente en el segmento restante de la punta de la pipeta de 1000 μL.
2. Funcionamiento del dispositivo Strike
- Anestesiar una sola hembra de 2 días de edad que usa CO 2 en una almohadilla de mosca.
- Suavemente transferirlo al sostenedor de la mosca usando un cepillo fino. Toque suavemente el soporte para que el cabezal volador se ve fuera del extremo de la punta. Si la probóscide de la mosca está expuesta fuera de la punta, suavemente doblarla de nuevo dentro de la punta con una aguja de jeringa de 1 ml embotada.
NOTA: Asegúrese de mantener la probóscide mosca en el interior del soporte. De lo contrario, la mosca puede morir de una lesión de probóscide de succión. - Apriete la mosca hoHacia el cilindro de la jeringa con el conector de manera que el cabezal volador esté hacia abajo.
- Ajuste la presión del gas a 100 kPa. Ajuste el caudal según el diseño del experimento.
- Encienda y apague rápidamente el interruptor del interruptor del regulador de flujo para que el impactador golpee la cabeza de la mosca una vez.
- Levante el porta mosquitera y muévalo sobre una almohadilla. Invertir el sostenedor de la mosca y golpee suavemente el lado para dejar la mosca para fuera. Dejar la mosca en un frasco vacío para recuperarse.
3. Seguimiento de Movimiento Video-asistido
- Llenar una placa de Petri de 6 cm de diámetro con elastómero de silicio transparente para hacer la arena de seguimiento. Deje un espacio de 3 mm entre el silicio y la tapa del plato para permitir que las moscas caminen libremente pero no vuelen.
- Anestesiar cuatro moscas de la farsa o grupo tratado cada vez y colocarlos en la arena. Dejar las moscas a 22 ° C durante 1 h.
- Coloque una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) por encima de las arenas y grabe durante 5 min.
- Analizar las trayectorias de movimiento registradas utilizando el software Ctrax (disponible gratuitamente en Caltech) 16 . Exportar los datos de seguimiento en un formato de programación (por ejemplo, Matlab) y analizar los datos basados en la distancia recorrida por cada cuadro 17 . Calcular la distancia media de marcha de cada mosca y combinarla con todas las demás moscas registradas / grupo para obtener una distancia media acumulada recorrida por la población de archivos en el mismo grupo.
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Resultados
Para establecer un modelo de CTE utilizando Drosophila para adultos, determinamos la eficacia de nuestro dispositivo al infligir una sola lesión de cabeza cerrada. Para eliminar las variaciones relacionadas con el genotipo, el sexo o la edad, se utilizaron 2 días de edad Canton-S WT moscas hembra en el experimento. Podríamos controlar fácilmente la resistencia del impactador regulando el caudal de CO 2 a una presión de gas constante de 100 kPa. Las moscas expuestas a ...
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Discusión
Los modelos animales que modelan fielmente las características del CTE, incluidas las alteraciones neurofisiológicas, los signos neuropatológicos y los déficits neuroconductuales, son esenciales para descubrir los mecanismos de la enfermedad y para desarrollar objetivos diagnósticos y terapéuticos. Es comprensible que ningún modelo animal de una enfermedad humana sea perfecto para imitar todos los puntos finales clínicamente relevantes. Sin embargo, creemos que un modelo de CTE robusto debe satisfacer los siguientes tre...
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Divulgaciones
Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins fondo de inicio de facultad a LC
Agradecimientos
Los autores no tienen nada que revelar.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Barrera de aerosol | USA Scientific | 1120-8810 | Utilizado como impactador |
| 200 μ L Punta de pipeta | USA Scientific | 1111-0706 | Utilizado como soporte de cabeza de mosca |
| 1000 μ L Punta de pipeta | USA Scientific | 1122-1830 | Utilizada como conector |
| mL Jeringa de tuberculina | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Placas de Petri | Fisher Scientific FB0875713A | Utilizada como regulador de flujo de arenas de seguimiento | |
| Genesee Scientific | 59-122WC | ||
| Sujetador/soporte de abrazadera estándar | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Cepillo fino | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Elastómero de silicona | Dow Corning | 4019862 | |
| Cámara CCD Microsoft | HD-5000 | ||
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
