Artículo de método

Protocolo de seguimiento de vídeo a la pantalla Químicos de disuasión para las abejas de miel

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DOI:

10.3791/55603

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12 de junio de 2017

 , 
1Entomology, Virginia Tech, 2Entomology, University of Nebraska-Lincoln

En este artículo

Resumen

La pérdida de colonias de abejas representa un desafío para los servicios de polinización de cultivos. Las prácticas actuales de protección de los polinizadores justifican un enfoque alternativo para minimizar el contacto de las abejas melíferas con los plaguicidas dañinos usando químicos repelentes. Aquí, proporcionamos métodos detallados para un protocolo de rastreo visual para detectar impedimentos para las abejas.

Resumen

La abeja melífera europea, Apis mellifera L. , es un polinizador económico y agrícola importante que genera miles de millones de dólares anualmente. El número de colonias de abejas ha ido disminuyendo en los Estados Unidos y en muchos países europeos desde 1947. Varios factores juegan un papel en esta disminución, incluida la exposición no intencional de las abejas melíferas a los plaguicidas. El desarrollo de nuevos métodos y regulaciones se justifica para reducir la exposición de los pesticidas a estos polinizadores. Un enfoque es el uso de químicos repelentes que disuaden a las abejas melíferas de un cultivo recientemente tratado con pesticidas. Aquí, describimos un protocolo para discernir la disuasión de las abejas de miel expuestas a ciertas sustancias químicas repelentes. Los recogedores de abejas se recolectan y pasan hambre durante la noche en una incubadora 15 h antes de la prueba. Las abejas individuales se colocan en placas de Petri que tienen un cubo de azúcar-agarosa (tratamiento de control) o un cubo de azúcar-compuesto de agarosa (tratamiento repelente) colocado enA la mitad del plato. La placa de Petri sirve como la arena que se coloca debajo de una cámara en una caja ligera para registrar las actividades de la locomotora de la abeja de la miel usando software que sigue del vídeo. Se analizaron un total de 8 tratamientos de control y 8 repelentes durante un periodo de 10 min con cada tratamiento se duplicó con nuevas abejas melíferas. Aquí, demostramos que las abejas melíferas se disuaden de los cubos de azúcar-agarosa con un tratamiento compuesto, mientras que las abejas se atraen a los cubos de azúcar-agarosa sin un compuesto añadido.

Introducción

La abeja europea, Apis melliferaL. , Es un insecto económico y agrícola importante que proporciona servicios de polinización que se valoran en más de $ 200 mil millones en todo el mundo 1 . En los Estados Unidos y Europa, el número de colonias de abejas ha ido disminuyendo. Los Estados Unidos han perdido ca. El 60% de las colonias de abejas melíferas administradas desde 1947-2008, mientras que Europa ha perdido ca. 27% desde 1961-2007 2 , 3 . Hay una serie de factores que podrían ser responsables del aumento del número de pérdidas de colonias, incluyendo pero no limitado a, infestaciones de parásitos, infecciones de patógenos, prácticas apícolas y uso de pesticidas 2 - 4 .

Las abejas pueden estar expuestas a pesticidas a través de dos vías principales. La exposición a plaguicidas fuera de la colmena puede ocurrir cuando los individuos que buscan alimento entran en contacto con cultivos queHan sido rociados con productos químicos para protegerlos de las plagas. La exposición a plaguicidas dentro de la colmena puede ocurrir cuando los apicultores utilizan productos químicos para controlar plagas y patógenos en la colmena, como ácaros, bacterias y microsporidios 4 . Se han identificado residuos de plaguicidas en muestras de cera, polen y abejas de miel de 24 colmenares de Estados Unidos y Canadá 5 , 6 . Los efectos del contacto de los plaguicidas con las abejas de miel incluyen la toxicidad aguda, así como los efectos subletales como la parálisis, la desorientación y los cambios de comportamiento y salud 1 , 7 . Dado que la agricultura moderna requiere el uso de plaguicidas para mantener un alto rendimiento de los cultivos, estos productos químicos seguirán siendo utilizados en el futuro 2 . Para proteger mejor a las abejas de la exposición a los plaguicidas, es necesario elaborar nuevos protocolos y reglamentos 5 .Un posible enfoque para la protección es el uso de repelentes para reducir la exposición de las abejas melíferas a los pesticidas mientras se busca alimentos.

Los repelentes de insectos (RI) se han utilizado típicamente como medidas de protección contra las mordeduras personales contra los vectores de enfermedades de los artrópodos 8 . El IR más utilizado y exitoso, desarrollado hace más de 60 años, es DEET 8 , 9 . Se considera que es el estándar de oro para las pruebas de repelencia de insectos y es utilizado por la Organización Mundial de la Salud y la Agencia de Protección Ambiental como un control positivo para el nuevo repelente de selección [ 10] . Además, se ha encontrado que el DEET dispersa las abejas de la miel de una amenaza a su colonia 11 . Los atributos actuales asociados con los RI personales incluyen: (1) efecto duradero contra un amplio número de artrópodos; (2) no irritante para el usuario cuando se aplica a la piel o la ropa; (3) inodoro oOlor agradable; (4) ningún efecto en la ropa; (5) ninguna apariencia aceitosa cuando se aplica a la piel y para soportar sudor, lavado y limpieza por el usuario; (6) ningún efecto sobre los plásticos de uso común; Y (7) químicamente estables y asequibles para un uso generalizado 12 . Un repelente utilizado para las abejas de miel sólo necesitaría algunos de estos atributos tales como efectos duraderos, no irritante para los aplicadores, olor inodoro o agradable, químicamente estable y asequible para su uso generalizado, y no tóxico para las abejas melíferas. Sin embargo, antes de explorar estos atributos en profundidad, se necesita un método para seleccionar compuestos para la repelencia / disuasión de una manera de alto rendimiento. Aquí, describimos un protocolo para un ensayo de laboratorio para detectar compuestos para la disuasión de las abejas, un paso importante para determinar la repelencia. El siguiente protocolo se modifica a partir de un estudio previo que describe un método de seguimiento visual para evaluar los efectos subletales de los plaguicidas sobre las abejas mieleras 13 . HoweEste protocolo difiere en que está diseñado para medir los efectos de los repelentes candidatos que podrían disuadir a las abejas de la miel de los cultivos tratados con pesticidas. No hay protocolos recomendados para las pruebas de laboratorio de disuasivos químicos para las abejas melíferas y, por lo tanto, este protocolo proporciona un enfoque sencillo para la detección de dichos compuestos.

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Protocolo

1. Preparar cubos de azúcar-agarosa

  1. Se pesan 8 g de azúcar y se colocan en un matraz Erlenmeyer de 50 ml.
  2. Llenar el matraz Erlenmeyer con 20 ml de agua desionizada. Disolver el azúcar haciendo girar el frasco.
  3. Pesar 170 mg de agarosa y añadirlo a la solución de azúcar.
  4. Calentar la solución de azúcar-agarosa en un microondas en la parte superior durante 25 s. Disolver la agarosa en la solución de azúcar.
  5. Dejar enfriar el frasco y la solución de azúcar-agarosa.
    NOTA: El frasco debe estar frío al tacto, pero no permita que la solución se solidifique.
    1. Para preparar un cubo de azúcar-agarosa para el tratamiento de control, vierta la solución de azúcar-agarosa semi-enfriada en un molde para pesar el barco.
      NOTA: El molde del barco de pesaje tiene las dimensiones 1,5 x 1,5 x 0,3 cm 3 .
    2. Para preparar un cubo de compuesto azúcar-agarosa para el tratamiento repelente, añada la cantidad deseada de compuesto a la disolución semi-enfriada ( por ejemplo , 1% de DEET en sUgar-agarosa (v / v)). Remueva el matraz para mezclar en el compuesto y luego vierta la solución en un molde de barco de pesaje.
      NOTA: Se prepararán ocho moldes de control y ocho moldes de prueba en este punto. Los moldes de control no contienen repelente.
  6. Enfriar los cubos de azúcar-agarosa en los moldes en un refrigerador durante 5-10 min. Retire los cubos de azúcar-agarosa solidificados de los moldes del barco de pesada y colóquelos en un recipiente de plástico con una toalla de papel humedecida.
  7. Coloque los recipientes en un refrigerador para el almacenamiento. Los cubos de azúcar-agarosa deben usarse dentro de los 7 días de preparación.

2. Programación del Software de Seguimiento de Video y Configuración Experimental

  1. En Configuración del experimento en la barra Explorador de experimentos (en el software de seguimiento, vea la Tabla de materiales), que se encuentra a la izquierda de la pantalla, asegúrese de que la cámara correcta está seleccionada y de que la grabación de video está centrada en las arenas de la placa de petri.
    1. Si la grabación de vídeo necesita estar centrada, vaya a los ajustes de la cámara y bajo los controles AOI y seleccione las opciones central X y Y central.
  2. En Configuración de experimentos, cambie el número de arenas a 16. En Funciones de seguimiento, seleccione Detección de punto central.
  3. Seleccione Ajustes de Arena para configurar el área deseada para el ensayo.
    1. Coloque las 16 placas de Petri en un patrón de 4 x 4 encima de una caja de luz, colocada debajo de la cámara ( Figura 1 ).
      NOTA: Estos platos se utilizan para crear la arena de grabación y están vacíos.

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Figura 1: Disposición de la placa de Petri en la caja de luz. Las placas de Petri se disponen en un bloque de 4 x 4 en la parte superior de la caja de luz. Esta disposición facilita la identificación de los tratamientos de control y repelentes para el vProtocolo de seguimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. En la Configuración de la Arena, use el botón de fondo de agarre, ubicado en el panel de herramientas del lado derecho, para tomar una foto de las 16 placas de Petri. Esto se utilizará como la plantilla para configurar la arena.
  2. Seleccione "Crear elipse" en la barra de herramientas en la parte superior de la pantalla de configuración de Arena y crear un círculo que coincida con el diámetro de una de las placas de Petri en la imagen agarrada. Coloque el marcador Arena 1 en el círculo ( Figura 2 ).

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Figura 2: Captura de pantalla de la configuración de Arena de software de seguimiento visual. La observación de rayas diagonales dentro del círculo proporciona la confirmación del área de detección en el círculo. UN Se proporciona un marcador de zona 1 para cada cuadrado y define la zona objetivo para cada placa de Petri. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Seleccione "Grupo de Zona 1" ubicado bajo Arena 1 en el panel de herramientas del lado derecho. Seleccione "Crear Rectángulo" en la barra de herramientas en la parte superior de la pantalla. Cree un cuadrado de 30 x 30 píxeles usando esto y luego colóquelo en el centro del círculo que se creó en el paso anterior. Seleccione "Agregar zona" de la barra de herramientas superior y luego haga clic en el centro del cuadrado. Mueva el marcador de la Zona 1 de modo que esté en el cuadrado.
    NOTA: El cuadrado creado es la zona de alimentación y no es un requisito que la zona de alimentación sea exactamente del mismo tamaño que la lista, siempre y cuando sea ligeramente mayor que el cubo de azúcar-agarosa.

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Figura 3: Captura de pantalla de Completed Arena Settings. Los ajustes de arena completados deben parecerse a este ejemplo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Seleccione "Arena 1" en el panel de herramientas del lado derecho y luego haga clic en el escenario completo duplicado. En el menú desplegable, seleccione "Todas las demás arenas" y haga clic en Aceptar. Mueva las configuraciones duplicadas de arena a las placas petri restantes en la imagen agarrada (Figura 3).
    1. Seleccione "Arena 1" y luego seleccione "Calibrar Escala" en la barra de herramientas superior. Dibuje la línea de calibración a través del diámetro de la placa de Petri Arena 1. Cambiar la medida del diámetro a 9 cm (diámetro de las placas de Petri que se utilizan). Seleccione "Validate Arena Settings" en el panel de herramientas de la derecha.
  2. Seleccione "Configuración de detección "en la barra de control de la izquierda.
  3. Seleccione "Ajustes de detección 1" y luego seleccione "Escala de grises" en el menú desplegable ubicado en la caja de herramientas del lado derecho. Bajo detección, establezca el rango para que sea 0 a 83 ( Figura 4A ).
  4. Haga clic con el botón derecho en "Configuración de detección" y realice una nueva configuración denominada "Configuración de detección 2". Asegúrese de que "Gray Scaling" aún esté seleccionado, pero no cambie los otros parámetros.
    NOTA: Habrá grandes círculos amarillos en la ventana de video sobre los arenas. Esto ayudará a disponer las placas Petri en las posiciones correctas antes de la grabación ( Figura 4B ).

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Figura 4: Captura de pantalla de los ajustes de detección 1 y 2. ( A ) Muestra cómo se verá la arena con la escala de gris corregidaMiel abeja objeto en una placa de Petri. ( B ) Muestra el área de detección de arena para que el posicionamiento de las placas de petri pueda hacerse entre ensayos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Seleccione "Trial List" en el Explorador Experimental y haga clic en "Add Variable" en la barra de herramientas superior. Nombre la variable definida por el usuario como "Tratamiento". Seleccione la barra desplegable "Valores predefinidos" en la columna de tratamiento definida por el usuario y agregue C (control) y T (tratamiento) como Valores predefinidos. Seleccione el botón "Agregar ensayos" situado en la barra de herramientas superior. Añada dos ensayos, luego para cada arena seleccione si se trata de un campo de control (C) o arena de tratamiento (T) ( Figura 5 ).

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FiGure 5: Captura de pantalla de la lista de ensayos. El etiquetado de los arenas correctamente es importante aquí, ya que el programa utiliza la información aquí para separar los datos para analizarlos estadísticamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Seleccione "Perfil de datos" en el panel Explorador de experimentos. En la columna de la izquierda, seleccione "Tratamiento" ubicado bajo el encabezado "Variables independientes definidas por el usuario". Esto agregará un cuadro "Filtro" en el área con el diagrama de flujo. Seleccione "C" en el cuadro emergente y luego coloque el filtro recién creado entre el cuadro "Inicio" y el cuadro "Resultado 1". Las flechas del diagrama de flujo deben ajustarse para que apunten desde el cuadro de inicio al filtro y finalmente al resultado 1.
    1. Repita el paso 2.12, sin embargo esta vez seleccione "T" para el filtro y luego seleccione"Resultado" en la sección "Elementos comunes". Mueva los cuadros recién creados al área del diagrama de flujo y conecte las casillas con flechas ( Figura 6 ).

figure-protocol-5
Figura 6: Captura de pantalla del perfil de datos. Esto muestra cómo se debe configurar el diagrama de flujo para obtener la separación apropiada en el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Guarda el archivo.

3. Recoge a las personas que son abejas

  1. Póngase ropa de protección y seleccione una colmena para recolectar abejas melíferas (sobre todo forrajeras).
  2. Retire la cubierta exterior e interior de la colmena. Utilice una herramienta de colmena para seleccionar un marco del cuerpo de colmena superior que no contenga cría.Levante suavemente el marco fuera de la caja de la colmena.
  3. Inspeccione el marco para la reina de la abeja de la miel. Si ella no está allí, barrer a los trabajadores de la abeja de la miel desde el marco en un contenedor para el transporte. Recoja suficientes individuos para poder ejecutar dos ensayos completos para cada compuesto que se va a analizar (se utilizan 16 individuos por ensayo con controles).
    NOTA: Los individuos recolectados deben ser principalmente buscadores; Sin embargo, puede haber otras personas de edad como las abejas enfermeras incluidas en la colección.
  4. Tome nota de la hora en que las abejas fueron removidas. Colóquelas en una caja de plástico de 9 cm x 7 cm x 9 cm que contenga agujeros de aire y colóquelas en una incubadora a 32 ° C y 70% de humedad relativa.
  5. Morir de hambre las abejas por 15 h.
    NOTA: Esto suele funcionar mejor si las abejas se recogen la noche anterior a la prueba.

4. Realizar un ensayo de seguimiento visual

  1. Inicie el programa de seguimiento visual y abra elD archivo experimental que se creó para este ensayo.
  2. Seleccione "Ajustes de detección 2".
  3. Coloque los cubos de azúcar-agarosa de control en los centros de 8 de las 16 placas de Petri. Repita este proceso con los cubos de azúcar-agarosa-compuesto (disuasivo) en los 8 platos restantes.
  4. Use una pinza para quitar una sola abeja de la caja de plástico y colóquela en una de las placas de Petri de control.
  5. Repita el paso 4.4 para las restantes 15 placas de Petri.
  6. Coloque todos los platos en la caja de luz y colocarlos de modo que las áreas de detección de arena (que se muestran en la pantalla de la computadora cuando se selecciona la detección 2) encajen en cada una de las arenas de la placa de Petri. Ilumine la caja de luz desde abajo por una serie de luces LED establecidas en el espectro rojo. Rodeó toda la caja y la cámara con una hoja de plástico negro para eliminar la luz externa y reducir las sombras dentro de las arenas.
  7. Después de haber fijado las placas de petri, asegúrese de que "Ajustes de detección 1" sea elSeleccionado.
    NOTA: En este punto, el software de rastreo visual debe recoger sólo las abejas melíferas dentro de las arenas de la placa Petri.
  8. Seleccione "Adquisición" en el Explorador de experimentos. Pulse el botón verde "Iniciar prueba" situado en el cuadro emergente Control de adquisición de la derecha para comenzar la grabación.
  9. Ejecute el ensayo durante 10 minutos y luego haga clic en el botón rojo "Stop Trial" en el cuadro popup Control de adquisición para detener la grabación.
  10. Retire los individuos de las placas de petri y colóquelos en un recipiente separado para que no se prueben dos veces.
  11. Repita los pasos 4.4-4.10 para la segunda prueba en el mismo compuesto.
    NOTA: Este método puede ser modificado para aumentar el número de abejas por tratamiento según lo necesite el usuario.
  12. Seleccione Estadísticas en el Explorador de experimentos y, a continuación, haga clic en calcular.
  13. Exportar los datos a un software de gestor de datos y luego analizar los datos de importancia mediante el uso de un one-wAy de la varianza con el post-test de Tukey, y una prueba t no pareada usando el programa de software estadístico preferido.

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Resultados

Se desarrolló un protocolo de seguimiento visual para registrar la cantidad de tiempo que las abejas de miel pasaron en una zona objetivo con azúcar-agarosa (tratamiento de control) o cubo de azúcar-compuesto de agarosa (tratamiento disuasorio). El tiempo registrado se analizó utilizando un programa de software estadístico y el tiempo medio invertido ± error estándar en la zona objetivo se indica como un gráfico de barras. En este protocolo se utilizó el DEET, el patrón oro para pruebas ...

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Discusión

Este protocolo de rastreo visual proporciona un enfoque sencillo para detectar disuasiones químicas para las abejas de la miel de una manera relativamente rápida y fácil. No existen protocolos recomendados para las pruebas de laboratorio de disuasivos químicos para las abejas melíferas. Los estudios previos semi- y de campo completo han examinado los repelentes de abejas 14 , 15 ; Sin embargo, los protocolos descritos consumen mucho tiempo, requieren mucho traba...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Thomas Kuhar por el uso del software y equipo de seguimiento visual. Damos las gracias a James Wilson y Scott O'Neal por su asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matraz Erlenmeyer de 50 mLKimax26500-50utilizado para hacer los terrones de azúcar/agarosa
SugarKroger, cualquier producto similar será suficiente,
agua desionizadaadquirida internamente
AgaroseApex20-102utilizada para hacer los terrones de azúcar/agarosa
Molde para cubos de agarosa (Weigh Boat)cualquier molde que proporcione al investigador un terrón de azúcar/agarosa de 1,5 cm x 1,5 cm x 0,3 cm será suficiente:
software de seguimiento visualEthoVision XTNoldus
LED de 633 nm, CyronHTP904EEstas luces se colocaron en una caja de luz construida para iluminar las arenas desde abajo. La caja era una simple estructura de madera con una cubierta de plástico esmerilado/plexiglás que permitía que la luz se dispersara hacia arriba sin ningún deslumbramiento.
Portátil o PCDellInspiron One 2305necesario para el software de seguimiento de vídeo. Cualquier dispositivo de PC capaz de ejecutar el software de seguimiento visual será suficiente.
Sons IncV0126cualquier capucha y chaqueta protectora será suficiente
con la herramienta HiveDadant & Sons IncM00757utilizado para abrir la colmena de abejas melíferas
Contenedor para abejas melíferascualquier recipiente adecuado para albergar y almacenar abejas melíferas será suficiente
Pinzas de peso pluma punta estrechaBioquip4748utilizado para seleccionar abejas melíferas individuales 9
cm (diámetro) Placa de PetriFisher Scientific S01778arena utilizada para contener abejas melíferas individuales durante el seguimiento de video
Dispositivo de grabación (cámara)BasleracA-1300-60gmcualquier dispositivo que pueda grabar el sujeto claramente y transferir el archivo a una computadora será suficiente
GraphPad PrismaGraphpadcualquier paquete de software estadístico será suficiente
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Referencias

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