Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Summary

Este manuscrito detalla la fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos: construcciones tridimensionales de tamaño micrométrico compuestas por extensos tramos axonales alineados que abarcan la (s) población (es) neuronal (es) agregada (s) encerrada (s) en un hidrogel tubular. Estos andamios vivos pueden servir como relés funcionales para reconstruir o modular circuitos neuronales o como bancos de pruebas biofidelic imitando la neuroanatomía de la sustancia gris-blanca.

Abstract

La recuperación funcional rara vez ocurre después de la lesión o la degeneración inducida por la enfermedad dentro del sistema nervioso central (SNC) debido al entorno inhibitorio y la capacidad limitada para la neurogénesis. Estamos desarrollando una estrategia para abordar simultáneamente la pérdida de la vía neuronal y axonal dentro del SNC dañado. Este manuscrito presenta el protocolo de fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos (micro-TENNs), construcciones implantables que consisten en neuronas y tramos axonales alineados que abarcan la luz de la matriz extracelular (ECM) de un cilindro de hidrogel preformado de centímetros de micrómetros de diámetro que puede extenderse centímetros en longitud. Los agregados neuronales están delimitados a los extremos del recubrimiento tridimensional y están atravesados ​​por proyecciones axonales. Los micro-TENNs se encuentran en una posición única como estrategia para la reconstrucción del SNC, emulando aspectos de la citoarquitectura del conector cerebral y proporcionando potencialmente medios para el reemplazo de la red. El neuLos agregados ronales pueden sinapsar con el tejido huésped para formar nuevos relés funcionales para restaurar y / o modular circuitos perdidos o dañados. Estas construcciones también pueden actuar como andamios vivos pro-regenerativos capaces de explotar mecanismos de desarrollo para la migración celular y la búsqueda axonal, proporcionando pistas estructurales y solubles sinérgicas basadas en el estado de regeneración. Los micro-TENN se fabrican vertiendo el hidrogel líquido en un molde cilíndrico que contiene una aguja centrada longitudinalmente. Una vez que el hidrogel se ha gelificado, la aguja se retira, dejando una micro-columna hueca. Se añade una solución de ECM a la luz para proporcionar un entorno adecuado para la adhesión neuronal y el crecimiento axonal. Las neuronas disociadas se agregan mecánicamente para una siembra precisa dentro de uno o ambos extremos de la micro-columna. Esta metodología produce confiablemente construcciones miniatura autónomas con tramos axonales de proyección larga que pueden recapitular características de la neuroanatomía cerebral. Synaptic immUnolabeling y los indicadores de calcio genéticamente codificados sugieren que los micro-TENNs poseen amplia distribución sináptica y la actividad eléctrica intrínseca. En consecuencia, los micro-TENNs representan una estrategia prometedora para la reconstrucción neuroquirúrgica dirigida de las vías cerebrales y también pueden aplicarse como modelos biofidelicos para estudiar los fenómenos neurobiológicos in vitro .

Introduction

Una característica común de los trastornos y enfermedades del sistema nervioso central (CNS), como lesión cerebral traumática (TBI), lesión de la médula espinal (SCI), accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson es la desconexión de las vías axonales y células neuronales Pérdida ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Por ejemplo, cuando un accidente cerebrovascular isquémico no se trata, se estima que los axones se pierden a una velocidad de 7 millas de ....

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Pensilvania y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Michael J. Crescenz y se adhieron a las directrices establecidas en la Política del Servicio de Salud Pública de NIH sobre Cuidado Humano y Uso de Laboratorio Animales (2015).

1. Desarrollo del hidrogel de agarosa (componente acelular de micro-TENNs)

1. Preparación de la solución de agarosa
   1. Dentro de un gabinete de bioseguridad, prepare depósitos para las micro-columnas transfiriendo 20 mL de solución s....

Results

Micro-TENNs fueron monitoreados mediante microscopía de contraste de fase para evaluar su citoarquitectura y el crecimiento axonal ( Figura 4 ]. Dentro de unidireccional, de 2 mm de largo micro-TENNs, agregados neuronales se restringieron a un extremo de la micro-columna y proyecta un haz de axones a través del núcleo interno. Los axones abarcaban toda la longitud de la columna 5 días in vitro (DIV) ( Figura 4A ). Hubo una mayor tasa de crecimie.......

Discussion

Las lesiones y enfermedades del SNC típicamente dan como resultado la pérdida o disfunción de las vías axonales de larga distancia que comprenden el conector cerebral, con o sin degeneración neuronal concomitante. Esto se ve agravado por la limitada capacidad del SNC para promover la neurogénesis y la regeneración. A pesar de la búsqueda de estrategias de reparación como el factor de crecimiento, la célula y el suministro de biomateriales como abordajes individuales o combinatorias, estas técnicas no son capaces de expl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cortadora láser	Universal Laser Systems	PLS4.75	Se utiliza para fabricar el molde de microcanal cortado con láser.
Dispositivo de fabricación de microcolumnas cortado con láser	Hecho a medida	--------------	Póngase en contacto con nuestro grupo de investigación si está interesado. Dimensiones y planos proporcionados en el manuscrito.
Tornillos	--------------	--------------	#4-40 con un diámetro de rosca de 3,05 mm
Tuercas	--------------	--------------	#4-40 con un diámetro de rosca de 3,05 mm
Aguja de acupuntura (180 µ m diámetro)	Lhasa Medical	sj.16X40	El diámetro puede variar según el tamaño deseado para el lumen de la microcolumna.
Placa de Petri	Fisher	08772B
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Pipeta serológica desechable de poliestireno	Fisher	13-678-11D
Agarosa	Sigma	A9539-50G
Tubo capilar (398 µ m diámetro)	Fisher	21170D	El diámetro puede variar según el tamaño deseado para la carcasa de la microcolumna.
Placa calefactora	Fisher	SP88857200
Barra magnética	Fisher	1451352
Micropipeta	Sigma	Z683884-1EA
Aguja de calibre 25 mm	Fisher	14-826-49
Microbisturí	Roboz Surgical	RS-6270
Tijeras	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Esterilizador de perlas calientes	Sigma	Z378550-1EA
Estereoscopio	Nikon	SMZ800N	Se utiliza para todos los pasos de disección y para la fabricación de micro-TENN.
Cola de rata tipo I colágeno	Corning 354236		Mantener a 4 º C y retírelo solo cuando sea necesario. Use hielo para preservar su temperatura cuando esté en uso.
Tubo de microcentrífuga	Fisher	02-681-256
Laminina de ratón	Corning	354232	Mantener a 4 º C y retírelo solo cuando sea necesario. Use hielo para preservar su temperatura cuando esté en uso.
Medio neurobasal	Invitrogen	21103049	Medio basal para el cultivo de células neuronales prenatales y embrionarias. Tienda en 4º C y cálido a 37 º C antes de usar.
Hidróxido de sodio (NaOH)	Fisher	SS2661
Ácido clorhídrico (HCl)	Fisher	SA48-1
Papel tornasol	Fisher	09-876-18
Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS)	Invitrogen	14170112	Almacene a 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen 25200056		Almacene a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
Desoxirribonucleasa pancreática bovina (DNasa) I	Sigma	10104159001	Almacene a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
B-27 Suplemento	Invitrogen	12587010	Suplemento añadido al medio Neurobasal para el cultivo de neuronas hipocampales y corticales. Almacenar a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
L-glutamina	Invitrogen		35050061 Tienda a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
Sprague Dawley día embrionario 18 ratas	Charles River	Strain 001
Pipeta Pasteur	Fisher	22-042816
tubo de centrífuga de 15 mL	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
centrífuga	Fisher	05-413-115
Hemocitómetro	Fisher	02-671-6
Impresora 3D Objet30	Stratasys	--------------	Se utiliza para fabricar los moldes piramidales de micropozos.
Molde de pozo piramidal impreso en 3D	Hecho a medida	--------------	Póngase en contacto con nuestro grupo de investigación si está interesado. Dimensiones y planos proporcionados en el manuscrito.
Polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado	Fisher	NC9285739	Viene en kit con elastómero y agente de curado. Úselo dentro de una campana de gases químicos.
Embudo	Fisher	10-348C
Bulbo de pipeta de 1 ml	Sigma Z509035
Microespátula	Fisher	S50821
placa de cultivo de 12 pocillos	EMESCO	1194-353043
Horno	Fisher	11-475-154
Incubadora	Fisher	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Almacenar en -80ºC. Virus adenoasociado (AAV) disponible comercialmente con el indicador de calcio GCaMP6f.
Formaldehído 40%	Fisher	F77P-4	El formaldehído es un compuesto tóxico conocido por ser cancerígeno y debe desecharse en un recipiente separado.
Triton X-100	Sigma	T8787	Tensioactivo no iónico utilizado para permeabilizar membranas celulares.
Suero de caballo	Gibco	16050-122
Anticuerpo primario anti-Tuj-1/beta-III tubulina de ratón	Sigma	T8578-200UL	Almacene en -20ºC.
Anti-sinapsina 1 anticuerpo primario	de conejo Synaptic Systems	106-001	Almacenar a -20ºC.
Burro anti-ratón 568 anticuerpo secundario	Invitrogen	A10037	Almacenar en 4ºC.
Burro anti-conejo 488 anticuerpo secundario	Invitrogen	A21206	Almacenar en 4ºC.
Hoechst 33342, Trihidrocloruro	Invitrogen	H3570	Tienda en 4ºC.  Hoechst es un mutágeno conocido que debe tratarse como cancerígeno. Por lo tanto, debe desecharse en un contenedor separado.
Microscopio confocal de escaneo láser A1RSI	Nikon	--------------	Se utiliza para tomar las reconstrucciones confocales de construcciones inmunomarcadas.
Microscopio Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	Se utiliza para tomar imágenes de contraste de fase. Con adquisición de imágenes digitales utilizando una cámara QiClick interconectada con el software Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
Microscopio de fluorescencia de alta velocidad Microscopio	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti emparejado con una cámara ANDOR Neo/Zyla para la obtención de imágenes de calcio.
Software NIS Elements AR 4.50.00	Nikon Instruments	--------------	Se utiliza para identificar transitorios de calcio a partir de las grabaciones tomadas con el microscopio de fluorescencia de alta velocidad.