Artículo de método

Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

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DOI:

10.3791/55609

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31 de mayo de 2017

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1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito detalla la fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos: construcciones tridimensionales de tamaño micrométrico compuestas por extensos tramos axonales alineados que abarcan la (s) población (es) neuronal (es) agregada (s) encerrada (s) en un hidrogel tubular. Estos andamios vivos pueden servir como relés funcionales para reconstruir o modular circuitos neuronales o como bancos de pruebas biofidelic imitando la neuroanatomía de la sustancia gris-blanca.

Resumen

La recuperación funcional rara vez ocurre después de la lesión o la degeneración inducida por la enfermedad dentro del sistema nervioso central (SNC) debido al entorno inhibitorio y la capacidad limitada para la neurogénesis. Estamos desarrollando una estrategia para abordar simultáneamente la pérdida de la vía neuronal y axonal dentro del SNC dañado. Este manuscrito presenta el protocolo de fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos (micro-TENNs), construcciones implantables que consisten en neuronas y tramos axonales alineados que abarcan la luz de la matriz extracelular (ECM) de un cilindro de hidrogel preformado de centímetros de micrómetros de diámetro que puede extenderse centímetros en longitud. Los agregados neuronales están delimitados a los extremos del recubrimiento tridimensional y están atravesados ​​por proyecciones axonales. Los micro-TENNs se encuentran en una posición única como estrategia para la reconstrucción del SNC, emulando aspectos de la citoarquitectura del conector cerebral y proporcionando potencialmente medios para el reemplazo de la red. El neuLos agregados ronales pueden sinapsar con el tejido huésped para formar nuevos relés funcionales para restaurar y / o modular circuitos perdidos o dañados. Estas construcciones también pueden actuar como andamios vivos pro-regenerativos capaces de explotar mecanismos de desarrollo para la migración celular y la búsqueda axonal, proporcionando pistas estructurales y solubles sinérgicas basadas en el estado de regeneración. Los micro-TENN se fabrican vertiendo el hidrogel líquido en un molde cilíndrico que contiene una aguja centrada longitudinalmente. Una vez que el hidrogel se ha gelificado, la aguja se retira, dejando una micro-columna hueca. Se añade una solución de ECM a la luz para proporcionar un entorno adecuado para la adhesión neuronal y el crecimiento axonal. Las neuronas disociadas se agregan mecánicamente para una siembra precisa dentro de uno o ambos extremos de la micro-columna. Esta metodología produce confiablemente construcciones miniatura autónomas con tramos axonales de proyección larga que pueden recapitular características de la neuroanatomía cerebral. Synaptic immUnolabeling y los indicadores de calcio genéticamente codificados sugieren que los micro-TENNs poseen amplia distribución sináptica y la actividad eléctrica intrínseca. En consecuencia, los micro-TENNs representan una estrategia prometedora para la reconstrucción neuroquirúrgica dirigida de las vías cerebrales y también pueden aplicarse como modelos biofidelicos para estudiar los fenómenos neurobiológicos in vitro .

Introducción

Una característica común de los trastornos y enfermedades del sistema nervioso central (CNS), como lesión cerebral traumática (TBI), lesión de la médula espinal (SCI), accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson es la desconexión de las vías axonales y células neuronales Pérdida 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Por ejemplo, cuando un accidente cerebrovascular isquémico no se trata, se estima que los axones se pierden a una velocidad de 7 millas de axones por minuto [ 5] . En el caso de TBI, que aproximadamente 1,7 millones de personas experimentan cada año sólo en los EE.UU., la degeneración axonal puede seguir ocurriendo años después del trauma, ya que la lesión inicial precipita un estado neurodegenerativo a largo plazo [ 4] . Agravando estos efectos deletéreos, el SNC tiene una capa severamente limitadaCiudad para la regeneración 1 , 7 , 8 , 9 . Después de la lesión, se desarrolla un ambiente inhibitorio que se caracteriza por la falta de orientación dirigida a objetivos distantes, la presencia de inhibidores asociados a mielina que impiden el crecimiento de neuritas y la formación de una cicatriz glial por astrocitos reactivos 8 , 10 , 11 , 12 . La cicatriz gliales sirve como una barrera bioquímica y física para la regeneración, con moléculas como la condroitina sulfato proteoglicanos que obstruyen la proliferación de axones [ 8 , 11] . Además, aunque se han encontrado células madre neurales en el SNC adulto, la producción de nuevas neuronas es limitada, ya que sólo se ha encontrado evidencia consistente de neurogénesis en el bulbo olfatorio, en el hipocampoLa zona subgranular, el área periventricular y el canal central de la médula espinal 13 , 14 . Estos obstáculos impiden la recuperación funcional de las neuronas perdidas y la arquitectura de la sustancia blanca después de una lesión o enfermedad, dando como resultado los efectos a menudo cambiantes y prolongados de estas condiciones.

A pesar de la falta de capacidad regenerativa en el SNC adulto, se ha demostrado que la regeneración axonal es posible si se presentan muestras ambientales adecuadas a las neuronas huésped 15 , 16 , 17 , 18 . Los investigadores han intentado administrar y manipular factores de crecimiento ( por ejemplo, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento glial dependiente y factor neurotrófico 3) y otras moléculas de orientación para estimular la plasticidad y la regeneración del axón 14 ,/ Sup> 18 , 19 . Aunque estos estudios han confirmado que los axones adultos son capaces de responder a factores de crecimiento, estas estrategias están limitadas por la baja permeabilidad de la barrera hematoencefálica y los gradientes espaciales y temporales específicos necesarios para promover la regeneración 14 , 18 , 19 . Otros enfoques se han basado en la hiperactivación de factores de transcripción relacionados con la regeneración en las neuronas del SNC. Por ejemplo, la sobreexpresión del factor de transcripción Stat3 estimuló la regeneración axonal en el nervio óptico 20 . Sin embargo, tanto la entrega de biomoléculas como la sobreexpresión de factores de transcripción no reemplazan a las poblaciones neuronales perdidas. Las estrategias basadas en células se han centrado principalmente en trasplantar células madre neurales (NSC) en el SNC, aprovechando su capacidad para reemplazar las neuronas del SNC, liberar factores tróficos,Y apoyar los intentos de neurogénesis que se producen después de la lesión [ 17] . A pesar de esto, todavía existen retos apremiantes que impiden este enfoque, incluyendo la dificultad de sobrevivir, integrarse con el huésped y mantenerse espacialmente restringido al área lesionada 6 , 14 , 17 , 21 . Además, la administración celular sola es incapaz de restablecer la citoarquitectura de las vías axonales dañadas o perdidas. Un enfoque alternativo que aborda los problemas que enfrentan las estrategias de entrega de células y fármacos / sustancias químicas es la combinación de estos enfoques con el uso de biomateriales 14 , 22 , 23 . Los biomateriales tales como hidrogeles son capaces de emular las propiedades bioquímicas y físicas de la matriz extracelular (ECM), ayudando en la liberación celularD retención dentro de la zona lesionada, y la entrega de factores de crecimiento y otras moléculas bioactivas con liberación controlada [ 22] . Las características atractivas de estas estrategias basadas en el biomaterial han dado como resultado evidencia de regeneración axonal in vivo tras el trasplante de andamios al área lesionada 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Sin embargo, las estrategias de biomateriales acelulares no reemplazan a las neuronas perdidas; Cuando se usan como vehículos de suministro para células precursoras neuronales, gliales o neuronales, los biomateriales son incapaces de reconstituir redes axonales de larga distancia. El desafío de desarrollar un enfoque que aborda tanto la degeneración de la vía axonal como la pérdida neuronal asociada con lesión y enfermedad del SNC sigue siendo 31.

Nuestro grupo de investigación informó anteriormente el desarrollo de implantable micro-tejidos ingeniería redes neuronales (micro-TENNs), que son un tipo de "andamiaje" que consiste en cuerpos de células neuronales restringido a uno o ambos extremos de un agarose hidrogel-ECM microc columna , Con tramos axonales alineados que se extienden a lo largo del interior de este encajonamiento tridimensional (3D) 1 , 10 , 31 , 32 . Una de las principales diferencias entre esta técnica y los enfoques anteriores es que la citoarquitectura de los micro-TENNs se crea completamente in vitro y se trasplanta después 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . La fabricación in vitro ofrece un amplio control espacial y temporal del fenotipo y orientación celular, propiedades mecánicas / físicas, señales bioquímicas y factores exógenos, lo que beneficia la integración de estos andamios con el huésped después de la implantación 41 , 42 . Los micro-TENNs son anatómicamente inspirados porque emulan la neuroanatomía del cerebro, mostrando tramas axonales similares a las que unen distintas regiones funcionales del cerebro ( Figura 1A ) 1 . Por lo tanto, esta estrategia puede ser capaz de reemplazar físicamente los tractos de la materia blanca perdida y las neuronas después de la implantación en una región lesionada. Esta técnica también está inspirada en mecanismos de desarrollo en los que los "andamios naturales" formados por células gliales radiales y axones pioneros actúan como guías de trayectoria para célulasMigración desde la zona subventricular y el crecimiento axonal, respectivamente 43 . Estos mecanismos se recapitulan en los tramos axonales alineados de micro-TENNs, que puede presentar las vías vivas para la migración de células neuronales y la regeneración axonal por Axon mediada axonal outgrowth ( Figura 1C ] [ 43] . Además, esta estrategia aprovecha la integración sináptica entre las neuronas micro-TENN y los circuitos nativos, formando nuevos relés que pueden contribuir a la recuperación funcional ( Figura 1B ) [ 43] . La capacidad de formación de sinapsis también puede conceder a este enfoque la capacidad de modular el SNC y responder al tejido del huésped de acuerdo con la retroalimentación de la red. Por ejemplo, las neuronas optogeneticamente activas en los andamios vivos pueden ser estimuladas para modular las neuronas huésped a través de interacciones sinápticas ( Figura 1D ).

Además, la estructura tubular basada en el biomaterialEl desarrollo de micro-TENNs ofrece un ambiente adecuado para la adhesión celular, el crecimiento, la extensión neurítica y la señalización, mientras que las dimensiones en miniatura de las construcciones permiten potencialmente una implantación mínimamente invasiva y proporcionan un microenvimiento parcialmente secuestrado para la integración gradual en el cerebro. De hecho, publicaciones recientes han demostrado el potencial de micro-TENNs para imitar las vías neurales después de la implantación en el cerebro de rata. Después de la microinyección estereotáxica, hemos informado anteriormente la evidencia de micro-TENN supervivencia neuronal, el mantenimiento de la arquitectura del tracto axonal, y la extensión neurita en la corteza del anfitrión a por lo menos 1 mes in vivo [ 10 , 31] . Además, el etiquetado con sinapsina proporcionó evidencia histológica de integración sináptica con tejido nativo 10 , 31 . En general, los micro-TENN pueden ser especialmente adecuados para reconstruir y modular los dañosCNS sustituyendo las neuronas perdidas, integrándose sinápticamente con los circuitos del huésped, restaurando la citoarquitectura axonal perdida y, en ciertos casos, proporcionando axones regeneradores con las señales de detección de trayectos apropiadas.

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Figura 1: Principios e inspiración detrás del desarrollo de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos (micro-TENNs). ( A ) Los micro-TENNs imitan la citoarquitectura de la conexión cerebral (púrpura), en la cual regiones funcionalmente distintas están conectadas por largos tramos axonales alineados de una manera unidireccional (rojo, verde) o bidireccional (azul). A modo de ejemplo, los micro-TENNs podrían reconstituir las conexiones perdidas en las vías corticotalámica y nigroestriatal o en la vía perforante desde la corteza entorrinal al hipocampo (adaptado de Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagrama de una unidireccionL y micro-TENN bidireccional (rojo y azul, respectivamente) que se integran sinápticamente con el circuito del anfitrión (morado) para servir como un relé funcional entre ambos extremos de una lesión. ( C ) Esquema de los tractos axonales de un micro-TENN unidireccional (verde) que sirve como guía para la regeneración axónica facilitada de los axones del huésped (púrpura) hacia un objetivo con el que interactúa el micro-TENN. ( D ) Diagrama conceptual del uso de micro-TENNS optogeneticamente activos como neuromoduladores, aprovechando la integración sináptica con neuronas excitadoras o inhibidoras (parte inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El manuscrito actual detalla la metodología utilizada para fabricar micro-TENNs usando neuronas corticales cerebrales derivadas de forma embrionaria. Cabe destacar que los micro-TENN podrían fabricarse con otros tipos de células neurales. Por ejemploAmpliamente, los informes iniciales del desarrollo exitoso de micro-TENN incluyeron neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) 32 . Las microcolumnas de hidrogel pueden ser generadas ( Figura 2A ) añadiendo agarosa líquida a un conjunto de canales cilíndrico cortado por láser hecho a medida oa tubos capilares, conteniendo ambos agujas de acupuntura alineadas. La aguja forma el lumen y determina el diámetro interior (ID) de la micro-columna, mientras que el ID del tubo capilar y el diámetro de los cilindros en el dispositivo de corte por láser dictan el diámetro exterior (DO) de las construcciones. La DO y la ID se pueden elegir de acuerdo con la aplicación deseada seleccionando diferentes diámetros para los tubos de dispositivo / capilar y las agujas de acupuntura, respectivamente. La longitud de las micro-columnas también se puede variar; Hasta la fecha, hemos informado de la construcción de micro-TENNs de hasta 20 mm de longitud 10 y están buscando activamente longitudes aún más largas. Después de los geles de agarosa y la acupuntura nSe retiran las eedles, se añade una solución ECM que consiste generalmente en colágeno tipo I y laminina en el lumen de las construcciones ( Figura 2C ). El núcleo de ECM proporciona un andamio para soportar la adhesión de células neuronales y el crecimiento axonal. Inicialmente, las neuronas corticales de rata primaria se colocaron en las micro-columnas utilizando suspensiones de células disociadas [ 10 , 31 , 32] . Sin embargo, este enfoque no produjo la citoarquitectura objetivo en todos los casos, que se definió como los cuerpos celulares neuronales restringidos a los extremos de las micro-columnas, con la luz central compuesta de puros alineados axonal tracts. Desde entonces, el uso de un método de agregación neuronal forzada (basado en protocolos adaptados de Ungrin et al .) Ha permitido una fabricación más fiable y consistente de micro-TENNs con la estructura ideal ( Figura 2B ] [ 44] . Además de describir las, Este artículo mostrará contraste de fase representativo y imágenes confocales de micro-TENNs que demuestran la formación de tractos axonales a lo largo del tiempo, así como la citoarquitectura objetivo final. Este manuscrito también se ampliará en los aspectos notables del protocolo y los desafíos restantes y las direcciones futuras de la tecnología micro-TENN.

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Figura 2: Diagrama esquemático del proceso de fabricación de micro-TENN en tres etapas. ( A ) Desarrollo del hidrogel de agarosa: (i) Inicialmente, se inserta una pequeña aguja de acupuntura ( por ejemplo , 180-350 μm de diámetro) en los canales cilíndricos de un molde moldeado por láser hecho a medida o un tubo capilar ( por ejemplo, , 380 - 700 mu m de diámetro). En el paso siguiente, la agarosa líquida en DPBS se introduce en los canales cilíndricos o tubos capilares. (Ii) Después de los geles de agarosa, se retira la aguja yEl molde se desmonta para producir las microcolumnas huecas de agarosa. (Iii) Estas construcciones se esterilizan a continuación y se almacenan en DPBS. ( B ) Cultivo de neuronas primarias y el método agregado: (i) La agregación neuronal se realiza en matrices de pocillos piramidales, moldeados a partir de moldes impresos en 3D, que encajan en los pocillos de una placa de cultivo de 12 pocillos. (Ii) Los micro-TENN incluyen neuronas primarias de rata disociadas de cerebros fetales de ratas día 18 embrionarias. Después de la disociación tisular con tripsina-EDTA y DNasa I, se prepara una solución celular con una densidad de 1,0-2,0 x 106 células / ml. (Iii) se transfieren 12 μl de esta solución a cada pocillo de la matriz de pocillos piramidales. La placa que contiene estos micro pocillos se centrifuga para producir agregados celulares. (Iv) Estos se incuban a continuación durante la noche antes del chapado en las microcualas. ( C ) Fabricación de núcleos de ECM y siembra de células: (i) Antes de la siembra de células, una solución de ECM que contiene 1 mg / ml de colágeno tipo I y 1 mg / mlLaminina se transfiere al interior de los micro-TENNs y se deja polimerizar. (Ii) Dependiendo de si se están fabricando micro-TENNs unidireccionales o bidireccionales, un agregado se coloca en uno o ambos extremos de la micro-columna, respectivamente. (Iii) Después de un período de incubación para promover la adhesión, los micro-TENN se cultivan en placas de Petri inundadas con un medio basal neuronal embrionario suplementado. (Iv) Después de 3-5 días en cultivo, la estructura final del micro-TENN debe demostrar los agregados celulares en los extremos de la micro-columna, con los tractos axonales que abarcan su longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Pensilvania y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Michael J. Crescenz y se adhieron a las directrices establecidas en la Política del Servicio de Salud Pública de NIH sobre Cuidado Humano y Uso de Laboratorio Animales (2015).

1. Desarrollo del hidrogel de agarosa (componente acelular de micro-TENNs)

  1. Preparación de la solución de agarosa
    1. Dentro de un gabinete de bioseguridad, prepare depósitos para las micro-columnas transfiriendo 20 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a cada una de dos placas de Petri de 10 cm. Esterilizar fórceps finos y microscalpels con un esterilizador de cuentas calientes.
    2. Pesar 3 g de agarosa y transferirlo a un vaso de precipitados estéril dentro del gabinete de bioseguridad. Añadir 100 mL de DPBS para una concentración final de 3% peso / volumen (p / v). Incluya una barra magnética limpia y cubra el vaso con aluminioNumfil
    3. Con una placa caliente / agitador, caliente el vaso de precipitados a 100 ° C y agite a 120-200 rpm para disolver completamente la agarosa (la solución cambiará de nublada a transparente). Mantener el calentamiento y la agitación después para evitar la gelificación y cambiar la temperatura de calentamiento según sea necesario para evitar quemar la agarosa.
      NOTA: La fabricación con el dispositivo de corte por láser y los tubos capilares se presenta a continuación en las subsecciones 1.2 y 1.3, respectivamente. Proceda a la subsección 1.4 después de finalizar los pasos descritos en cualquiera de las subsecciones. Para ambos métodos de fabricación de micro-columnas, agregue rápidamente la agarosa líquida, ya que la agarosa se solidifica rápidamente a medida que se enfría. Cuando esterilice con un autoclave en cualquiera de los siguientes pasos, use las condiciones estándar aplicadas a la cristalería.
  2. Preparación de microcolumna utilizando un dispositivo de corte por láser
    NOTA: El dispositivo de corte por láser se corta de acrílico transparente usando un cortador de láser CO 2 comercial. El fabricanteCación de estructuras y dispositivos mediante el corte por láser está bien documentada para una serie de aplicaciones de ingeniería e investigación 45 , 46 , 47 . Este molde ( figura 3 ) consiste en una disposición de cinco canales cilíndricos, cada uno con un diámetro de 398 μm y una longitud de 6,35 mm. Estas matrices cilíndricas están formadas a lo largo de su longitud por dos piezas: una mitad inferior (longitud: 25,4 mm, ancho: 6,35 mm, altura: 6,0 mm) y una mitad superior (longitud: 31,5 mm, ancho: 6,35 mm, altura: 12,7 mm ), Como se muestra en las Figuras 3A y 3B , respectivamente. Las dos mitades pueden ser fijadas juntas por las tapas anterior y posterior observadas en la Figura 3C (longitud: 31,5 mm, ancho: 6,35 mm, altura: 12,7 mm), que presentan cuatro orificios de alineación que coinciden con dos orificios en la parte superior e inferior Piezas y que ayudan a asegurar todas las piezas juntas cuando se atornilla. Estas tapas también incCinco agujeros, concéntricos a los canales cilíndricos, en los cuales pueden insertarse las agujas de acupuntura para formar el lumen de las microcuñas.
    1. Esterilizar el dispositivo mostrado en la Figura 3 cubriéndolo con papel de aluminio y autoclave. Montar el dispositivo como se muestra en la Figura 3D alineando las tapas anterior y posterior con sólo la mitad inferior y sujetando las tres partes con dos tornillos # 4 - 40 y tuercas (diámetro de rosca: 3,05 mm) en los orificios de alineación inferiores.
    2. Introduzca completamente una aguja de acupuntura (diámetro: 180 μm, longitud: 30 mm) en los orificios de las agujas en la tapa anterior o posterior del dispositivo ( Figura 3D ). Con una micropipeta, vierta suficiente agarosa líquida (~ 1 ml para los cinco canales) en la mitad inferior para llenar completamente cada una de las mitades del canal cilíndrico.
    3. Coloque inmediatamente la pieza de la mitad superior del dispositivo sobre la mitad inferior y aplique presión hasta que esté firmemente enLugar para completar los canales cilíndricos (la fricción entre las tapas y la pieza superior mantendrá este último en su lugar). Espere ~ 5 min a temperatura ambiente después de la adición de agarosa para permitir su gelificación dentro de los canales del dispositivo.
    4. Extraiga manualmente la aguja de cada uno de los agujeros en las tapas del dispositivo. Quite los tornillos y separe manualmente las dos tapas y la mitad superior de la pieza de la mitad inferior, donde esta última mantendrá las microcolumnas del hidrogel.
    5. Utilice fórceps finos para quitar suavemente las microcortinas de los canales de la pieza de la mitad inferior y colóquelas en la placa de Petri previamente preparada que contiene DPBS (paso 1.1.1). Reutilizar el dispositivo para otra ronda de fabricación de micro-columnas. Continúe con la subsección 1.4.
  3. Fabricación de microcristalinas con tubos capilares
    1. Transferencia de tubos capilares de vidrio (diámetro: 398,78 μm, longitud: 32 mm) al interior del gabinete de bioseguridad. Romper manualmente elTubos largos en fragmentos de 2,0-2,5 cm y insertar completamente una aguja de acupuntura (diámetro: 180 mu m, longitud: 30 mm) en cada fragmento ( Figura 2A ).
    2. Transferir 1 ml de agarosa líquida del vaso de precipitados a la superficie de una placa de Petri vacía. Sosteniendo el tubo capilar y la aguja introducida, coloque un extremo del tubo en contacto con el depósito de agarosa líquido para llenarlo por acción capilar. Agitar el tubo para promover el aumento capilar.
      NOTA: Llenar los tubos capilares con agarosa líquida tan alto como lo permita la acción capilar; Después, estas micro-columnas se pueden cortar en construcciones más pequeñas dependiendo de la longitud deseada. El pool de agarosa de 1 mL se usa típicamente para un solo tubo, ya que la agarosa se enfría y se gelifica rápidamente, impidiendo la acción capilar adicional.
    3. Cuando el líquido deja de subir, retire el tubo capilar de la piscina y colóquelo horizontalmente sobre la superficie de una placa de Petri. Espere 5 minutos para dejar que el gel de agarosa dentro de los tubos
    4. Coloque el pulgar y el dedo índice a cada lado del tubo y presione contra él. Utilice la otra mano para sacar rápidamente la aguja mientras usa el pulgar y el dedo índice para evitar que la propia micro columna se deslice fuera del tubo. Inserte una aguja de calibre 30 en el tubo capilar para empujar lentamente la micro-columna hacia fuera en un plato que contenga DPBS (paso 1.1.1).
  4. Recorte y esterilización de micro-columnas
    1. Delicadamente transferir una micro-columna de DPBS a un plato vacío con pinzas finas. Agregue 10 μl de DBPS a la parte superior de la micro-columna con una micropipeta para evitar el secado. Coloque el último plato debajo de un estereoscopio para obtener una guía visual.
      NOTA: A lo largo del protocolo, el secado o deshidratación con microcolumna se refiere a la adquisición de una estructura arrugada que es visualmente distinguible de la apariencia hidratada típica de estas construcciones. Las micro-columnas deshidratadas se adhieren firmemente a la superficie de las placas de Petri y cNo se pueden mover fácilmente, mientras que las construcciones hidratadas tienden a deslizarse a través de la superficie después de ser manipuladas con fórceps. En la figura 8A se muestra una imagen de contraste de fase de una microc columna completamente seca.
    2. Recortar la micro-columna con un microscalpel para acortarlo a la longitud deseada (aquí, 2-5 mm). Transportar la micro-columna recortada con fórceps finos a la otra placa Petri de DPBS preparada en el paso 1.1.1.
    3. Repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2 para cada micro-columna fabricada.
    4. Esterilizar las micro-columnas en las placas Petri que contienen DPBS bajo luz ultravioleta (UV) durante 1 h. Almacenar las placas de Petri a 4 ° C antes de la adición de ECM y el recubrimiento celular.

2. Cultura de Neuronas Primaria y Método de Agregación de Células Forzadas

  1. Preparación de la matriz piramidal de micro-pozos
    NOTA: En esta sección se emplea un molde impreso 3D que consiste en una base cilíndrica (diámetro: 2,2 cm, altura: 7,0 mm) aY nueve pirámides cuadradas en la parte superior (lado de la longitud: 4,0 mm, ángulo de inclinación: 60 °), organizado en una matriz de 3 x 3, como se muestra en la Figura 3E . El proceso de fabricación aditivo que utiliza impresoras 3D comercialmente disponibles está bien documentado. Software de diseño asistido por computadora se puede utilizar para diseñar el molde. El archivo de diseño resultante se puede convertir digitalmente en una ruta de herramienta para una impresora 3D. Cada impresora tiene especificaciones diferentes, y las instrucciones para configurar y operar una impresora 3D varían en consecuencia.
    1. Utilice una broca de 3/32 "para perforar 16 agujeros en una matriz de 4 x 4 (longitud de lado: 4 cm, separación de agujeros: 1 cm), centrado en la tapa de una placa de Petri de 10 cm. La parte inferior de la cápsula de Petri para pesar 27 g de polidimetilsiloxano (PDMS) y 3 g de agente de curado (para una proporción de 1:10) Se agita con una micro espátula para distribuir el agente uniformemente.
    2. Cubra el PDMS / agente de curado con la tapa perforada. Conecte un extremo de una manguera a la vacuuM de la campana e introduzca el otro extremo en el tallo de un embudo (diámetro de la boca: 10 cm, longitud del vástago: 3 cm, diámetro del vástago: 1,5 cm).
    3. Haga una abertura con una broca de 3/32 "en la parte superior de un bulbo de pipeta de 1 ml e inserte y asegure una punta de micropipeta de 1.000 μl en la abertura (con el extremo puntiagudo hacia arriba) Coloque la bombilla y la punta en la manguera y tire La manguera hacia arriba hasta que el bulbo sella la manguera en el vástago del embudo.
    4. Coloque el embudo sobre la tapa perforada del plato y asegure la manguera con un soporte robusto disponible. Abra la válvula de vacío durante 5 minutos a la succión y llevar las burbujas de aire a la superficie.
    5. Cierre la válvula, retire el embudo y golpee la placa de Petri contra la superficie de la campana de humos ~ 3 veces para estallar cualquier burbuja de aire restante.
    6. Coloque un molde piramidal bien impreso 3D en cada uno de los pozos en una placa de cultivo de 12 pocillos, con las pirámides apuntando hacia arriba. Vierta el PDMS / agente de curado en la parte superior de los moldes hasta que cada pocillo de tEl plato está lleno. Cubrir la placa de 12 pocillos con su tapa y transferirla a un horno durante 1 h a 60 ° C para secar.
    7. Retire con cuidado cada conjunto de pocillos de PDMS ( Figura 3F ) de la placa con una microespátula. Cubra las matrices PDMS con papel de aluminio y esterilice en autoclave. Dentro de un gabinete de bioseguridad, inserte una matriz de micro pocillos en cada pocillo de una placa de 12 pocillos ( Figura 2B ).
  2. Aislamiento neuronal cortical de fetos de rata
    1. Añadir ~ 20 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a cada uno de cuatro a seis platos de Petri de 10 cm (uno para cada tejido disecado) dentro de un gabinete de bioseguridad. Transferir estos platos a una campana de disección y colocarlos en hielo. Esterilice los instrumentos de disección, como microescalpeles, tijeras y fórceps, con un esterilizador de cuentas calientes.
    2. Medio basal de la neurona embrionaria pre-caliente + suplemento sin suero al 2% + L-glutamina 0,4 mM (denominado "medio de cultivo" aquíR) y tripsina al 0,25% + ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA) a 37ºC. Descongele la desoxirribonucleasa (DNasa) I colocándola a temperatura ambiente. Preparar 1,5 ml de una solución de DNAse I de 0,15 mg / ml en HBSS y mantener la solución sobre hielo.
    3. Eutanasiar una rata embrionaria-día-18 embarazada cronometrada por inhalación de dióxido de carbono y confirmar la muerte por decapitación. Transfiera la carcasa a una campana estéril de disección y colóquela ventral hacia arriba. Enjuague el abdomen a fondo con etanol al 70%.
    4. Abra el útero y retire los fetos (generalmente ~ 11) de los sacos amnióticos con tijeras y transfiéralos con fórceps a una placa de Petri que contenga HBSS frío, como se describe 48 . Coloque un bloque de granito enfriado (-20 ° C) debajo del estereoscopio. Coloque la placa de Petri en la superficie de este bloque frío para conservar la baja temperatura del HBSS durante todo el procedimiento de disección.
    5. Enjuague a los cachorros por batir el HBSS alrededor y luego transferirlos al siguiente plato limpioQue contiene HBSS. Con la ayuda del estereoscopio y los instrumentos de disección, retire secuencialmente las cabezas, los hemisferios cerebrales y los córtices de los fetos y transfiera cada tejido con fórceps a un nuevo plato lleno de HBSS después de cada disección 48 .
    6. Aspirar sólo los córtices con una pipeta Pasteur y colocar el tejido en un tubo estéril de centrífuga de 15 ml. Deseche los otros tejidos disecados. Enjuague las cortezas tres veces añadiendo y eliminando secuencialmente ~ 5 mL de HBSS con una pipeta serológica. Coloque el tubo sobre hielo cuando no esté en uso.
    7. Transferir las córtices con una pipeta Pasteur a un tubo de 15 mL que contenga tripsina-EDTA precalentada (4-6 cortezas por 5 mL de tripsina-EDTA). Agite manualmente el tubo una vez y colóquelo a 37 ° C. Invertir el tubo cada 3 min para evitar que el tejido se agrupe.
    8. Detener la exposición a la tripsina después de ~ 10 min eliminando el tejido con una pipeta Pasteur y transfiriéndola a una centrífuga limpia de 15 mltubo. Añadir la solución de 0,15 mg / ml de DNasa I (1,5 ml) al tubo con una pipeta.
    9. Utilice una pipeta Pasteur para romper manualmente los grumos de tejido y luego vórtice (~ 30 s) hasta que la solución aparezca homogénea y no haya fragmentos de tejido restantes en el líquido. Si no es posible homogeneizar completamente la solución, extraer los fragmentos insolubles tirando de ellos en la punta de una pipeta Pasteur.
    10. Centrifugar la solución celular homogénea obtenida en la etapa 2.2.9 a 200 xg durante 3 min. Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no alterar las células sedimentadas. Añadir 2 ml de medio de cultivo con una pipeta serológica y vórtice para resuspender las células.
    11. Contar el número de células en la solución preparada en el paso 2.2.10 usando un hemocitómetro; El rendimiento esperado es 3,0-5,0 x 106 células / hemisferio cortical. Preparar 1 ml o más de suspensión celular en medio de cultivo, con una densidad de 1,0-2,0 x 10 6 células / ml.
  3. Formación de agregados de células neuronales
    1. Con una micropipeta, añada 12 μl de la suspensión celular 1.0-2.0 x 10 6 / mL en cada micro-pocillo de la matriz PDMS (que se colocó en la placa en la etapa 2.1.7).
      NOTA: La concentración celular puede ajustarse dependiendo de la ID de la micro-columna y del tamaño del agregado celular deseado, ya que las concentraciones más altas producen agregados mayores.
    2. Centrifugar la placa a 200 xg durante 5 min para forzar la agregación de células en el fondo de los micro-pozos ( Figura 2B ). Añadir cuidadosamente ~ 2 ml de medio de cultivo a la parte superior de cada matriz PDMS para cubrir todos los micro-pocillos sembrados, teniendo cuidado de no perturbar las células agregadas.
    3. Si las células no se transducen con un vector viral, incubar la placa durante 12-24 h a 37 ° C y 5% de CO 2 y luego proceder a la sección 3. Si los agregados se transducen, omitir la incubación y pasar a la sección 2.4 .
  4. tranScción con un vector viral para observar la señalización del calcio
    Nota: Estos pasos se realizan para transducir neuronas con un vector viral que contiene un indicador de calcio genéticamente codificado (GECI). Los resultados que se muestran en este artículo se obtuvieron utilizando un virus adenoasociado (AAV) disponible comercialmente (serotipo 1) con GCaMP6f, un GECI con cinética rápida que consiste en proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina (CaM) y el péptido M13, Impulsado por el promotor de la sinapsina I humana. La solución del vector viral puede requerir dilución en DPBS estéril antes de la transducción, dependiendo de la concentración de la solución madre. La salud / morfología celular y la fuerza de la señal de GCaMP6f deben observarse en el tiempo para un rango de concentraciones de vectores. Este procedimiento de optimización debe ser realizado por cada investigador para determinar el título apropiado para sus propios cultivos celulares. El tiempo de expresión típico GCaMP6f es de 7-8 días después de la transducción que se produce durante la incubación realizada en stEp 2.4.2.
    1. Con una micropipeta, añadir el volumen requerido de solución de vectores virales (para una concentración final de ~ 3,0 x 10 9 copias genómicas por agregado) al medio de cultivo, cubriendo los agregados. Lentamente pipetee hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la solución del vector se distribuye homogéneamente a través del medio de cultivo.
    2. Incubar la placa con los micro-pocillos piramidales sembrados durante 24 h a 37 ° C y 5% de CO 2 para permitir la transducción viral de GCaMP6f.

3. Desarrollo del componente celular de los micro-TENN

  1. Fabricación de núcleo ECM
    1. Después de la incubación de agregados, agregar colágeno tipo I y laminina al medio de cultivo (para una concentración de 1 mg / ml cada uno) en un tubo de microcentrífuga para preparar la solución de ECM. Realice los pasos 3.1.2-3.1.4 a temperatura ambiente, pero mantenga el tubo con ECM sobre hielo cuando no esté en uso para prevenir la gelificación prematura.
      NOTA: El gasto típico es de 4 μl de solución ECM para cada micro-columna (longitud: 5 mm, ID: 180 μm).
    2. Ajustar el pH de la solución ECM transfiriendo 1-2 μL al papel de tornasol para verificar el pH inicial, añadiendo 1 μl de hidróxido de sodio 1 N (NaOH) y / o ácido clorhídrico 1 N (HCl) a la ECM, según sea necesario, Y repitiendo hasta que el pH sea de 7,2-7,4. Asegurar la homogeneización de la solución de ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo, evitando la formación de burbujas de aire.
    3. Transferir las micro-columnas con fórceps esterilizados de los platos en el paso 1.4.3 para vaciar las placas Petri de 35 ó 60 mm. Trabajar en 4-5 micro-columnas a la vez para prevenir la deshidratación. Conecte una punta de 10 μL unida a una punta de 1,000 μL a una micropipeta. Utilizando el estereoscopio para guiarlo visualmente, coloque la punta en un extremo de las microcuñas y la succión para extraer el DPBS residual y las burbujas de aire del lumen.
    4. Prepare rápidamente 4-5 μl de ECM en una micropipeta. Observando bajo un steReoscopio, coloque la punta de la micropipeta en uno de los extremos de las micro-columnas y descargue suficiente ECM para llenar el lumen. Confirme la ausencia de burbujas de aire en el lumen, ya que pueden inhibir el crecimiento axonal a través de la ECM. Si existen burbujas de aire, retire el ECM, como se explica en el paso 3.1.3, y agregue el ECM nuevamente.
    5. Para evitar la deshidratación, añada ~ 2 μL de ECM alrededor de cada micro-columna. Incubar las micro-columnas de hidrogel / ECM en las cápsulas de Petri a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 25 min. Proceda a la siembra de células inmediatamente después de la incubación.
      NOTA: El período de incubación en la etapa 3.1.5 pretende dar tiempo para la polimerización de colágeno y laminina dentro de las microcualas.
  2. La siembra de células neuronales en las micro-columnas
    NOTA: Para cambiar el medio de cultivo de los agregados transducidos, incline la placa, utilice una micropipeta para retirar el medio que se acumula en la pared del pozo, y luego añada lentamente ~ 1 ml contra el(Para evitar perturbar los agregados en los micro-pozos piramidales). Repita este cambio de medio una segunda vez.
    1. Después del período de incubación en la etapa 3.1.5, se transfieren aproximadamente 10-20 μl de medio de cultivo a dos áreas libres en las placas de Petri que contienen las microcuñas. Utilice una micropipeta para transferir individualmente los agregados a la placa de Petri que contiene las construcciones y muévalas con pinzas a una de las pequeñas charcas del medio de cultivo para preservar la salud celular.
    2. Mientras se observa bajo un estereoscopio, inserte un agregado en cada extremo de las microcuñas para micro-TENNs bidireccionales o en un extremo para una arquitectura unidireccional (como se desee) usando fórceps. Confirmar la colocación de los agregados en el interior de las micro-columnas utilizando el estereoscopio. Utilice fórceps para mover las micro-columnas sembradas a la otra piscina pequeña de medio de cultivo para evitar la deshidratación y preservar la salud agregada.
    3. Incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 45 min a unaLos agregados a adherirse a la ECM. Verificar que los agregados permanezcan en los extremos de las microcuñas usando el estereoscopio; Reintroducir los agregados celulares y repetir el paso de incubación según sea necesario.
    4. Inundar cuidadosamente las placas de Petri que contienen los micro-TENNs con medio de cultivo (3 ó 6 mL para una placa de Petri de 35 ó 60 mm, respectivamente) usando una pipeta serológica. Colocar los platos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 para el cultivo a largo plazo.
    5. Realice media media cambios cada 2 días con medio de cultivo. Retire cuidadosamente la mitad del medio viejo con una pipeta y utilice el estereoscopio para una guía visual para evitar la succión de los micro-TENN. Reemplazar lentamente añadiendo medio fresco precalentado con una pipeta.
    6. Para reutilizar las matrices de micro-pozos de PDMS, eliminar el medio de cultivo, hervir las matrices en agua desionizada durante 30 min, y esterilizar en un autoclave para otra ronda de formación de agregados y cultivo.
      NOTA: En los puntos de tiempo deseados, elLa citoarquitectura de micro-TENNs puede ser verificada utilizando microscopía de contraste de fase. En este caso, se utilizaron un tiempo de exposición de 5-8 ms y 10X (0,64 μm / pixel) y 20X (0,32 μm / pixel) para capturar las imágenes de contraste de fase. La fluorescencia asociada con los cambios de concentración de calcio en los micro-TENNs transducidos por virus se capturó utilizando un microscopio de fluorescencia de alta velocidad con un tiempo de exposición de 50 ms, un objetivo 10X (0,64 μm / píxel) y una luz de estado sólido con filtros pasabanda de ~ 480 Nm y ~ 510 nm para excitación y emisión, respectivamente, para visualizar la señal de fluorescencia GCaMP6f.

4. Inmunocitoquímica para Estudios In Vitro

Nota: Para las imágenes mostradas aquí, se usaron los siguientes anticuerpos primarios: tubulina anti-Tuj-1 / beta-III de ratón (1: 500) y anti-sinapsina-1 de conejo (1: 500) para el marcaje de axones y pre -sinápticos boutons, respectivamente. Los anticuerpos secundarios fueron burro anti- murciélago 568 (1: 500) y burro anti - conejo 488 (1: 500). Los volúmenes requeridos de las soluciones de anticuerpo primario y secundario preparadas, así como los volúmenes de las soluciones de formaldehído, suero de caballo y detergente, dependen del volumen requerido para cubrir completamente las construcciones. Estos volúmenes pueden minimizarse usando una pluma de barrera hidrófoba para limitar el área que rodea cada micro-columna.

PRECAUCIÓN: Esta sección emplea formaldehído y Hoechst. El formaldehído es un compuesto tóxico conocido como cancerígeno, y Hoechst es un mutagénico conocido. Por lo tanto, estos compuestos deben eliminarse en un recipiente de residuos apropiado. Siempre manipúleslos en una campana extractora de humos químicos mientras usas el equipo de protección personal apropiado, como una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes.

  1. Preparar una solución de 4,0% de volumen / volumen (v / v) de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) dentro de una campana de humo químico.
  2. Eliminar el medio de cultivo de las placas de PetriNg los micro-TENNs con una micropipeta. Añada suficiente volumen de la solución de formaldehído a los platos para cubrir completamente los micro-TENN. Remoje los micro-TENNs en la solución de formaldehído durante 35 minutos a 18-24 ° C para fijar las células dentro de las micro-columnas.
  3. Retire la solución de formaldehído al 4,0% de las cápsulas de Petri con una pipeta y deseche siguiendo las normas apropiadas de eliminación de materiales peligrosos.
  4. Realice dos enjuagues rápidos añadiendo suficiente PBS para cubrir completamente los micro-TENNs fijos y luego eliminar el PBS con una pipeta. Realizar un tercer enjuague largo remojando las construcciones en el PBS durante 10 min.
    PRECAUCIÓN: Deseche el PBS utilizado para el enjuague, ya que posiblemente contenga trazas de formaldehído.
  5. Preparar una solución al 0,3% v / v de detergente no iónico en suero de caballo al 4% v / v en PBS. Eliminar el PBS de las placas de Petri que contienen los micro-TENNs fijos y añadir un volumen suficiente de la solución de detergente al 0,3% para cubrir las construcciones. Remoje durante 60 minutos a 18-24 y #176; C para permeabilizar las células.
  6. Retire la solución detergente con una pipeta. Realice dos enjuagues rápidos añadiendo y eliminando posteriormente el PBS. Después, realice tres enjuagues más largos empapando las construcciones en PBS durante 5 min durante cada enjuague.
  7. Diluir los anticuerpos primarios en suero de caballo al 4%. Eliminar el PBS de las placas de Petri que contiene el fijo y permeabilized micro-TENNs. Añadir suficiente solución de anticuerpo primario a las micro-columnas para cubrirlos completamente. Seal las placas de Petri con parafilm para evitar la evaporación e incubar durante la noche (12-16 h) a 4 ° C.
  8. Retire la solución de anticuerpo primario de los platos y enjuague como se explica en el paso 4.6. En la oscuridad, preparar la solución de anticuerpos secundarios en 4,0% de suero de caballo. Añadir suficiente solución de anticuerpos secundarios para cubrir completamente las construcciones, cubrir los platos con papel de aluminio e incubar durante 2 h a 18-24 ° C.
  9. Preparar la solución de Hoechst (1: 10.000) en PBS para teñir los núcleos.
  10. Eliminar la solución de anticuerpos secundarios e incubar los micro-TENNS en la solución Hoechst durante 10 min a 18-24 ° C. Realice cinco enjuagues con PBS, cada uno durante 5-10 min. Incubar la placa de Petri con PBS para cubrir los micro-TENNs teñidos, envolver el plato en papel de aluminio y almacenar a 4 ° C hasta que se realice la proyección de imagen.
    NOTA: Las imágenes para los micro-TENN inmunomarcados se tomaron con un microscopio confocal láser con una resolución de 2,048 (~ 8 s / marco), una longitud de onda de 10X objetivo (0,64 μm / píxel), de excitación de 487 nm y ~ 525 nm para Fluorescencia verde, excitación de 561 nm y longitudes de onda de emisión de ~ 595 nm para fluorescencia roja, y ~ 3,22 μm / rebanada con ~ 60 rebanadas en promedio para las pilas z.

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Resultados

Micro-TENNs fueron monitoreados mediante microscopía de contraste de fase para evaluar su citoarquitectura y el crecimiento axonal ( Figura 4 ]. Dentro de unidireccional, de 2 mm de largo micro-TENNs, agregados neuronales se restringieron a un extremo de la micro-columna y proyecta un haz de axones a través del núcleo interno. Los axones abarcaban toda la longitud de la columna 5 días in vitro (DIV) ( Figura 4A ). Hubo una mayor tasa de crecimie...

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Discusión

Las lesiones y enfermedades del SNC típicamente dan como resultado la pérdida o disfunción de las vías axonales de larga distancia que comprenden el conector cerebral, con o sin degeneración neuronal concomitante. Esto se ve agravado por la limitada capacidad del SNC para promover la neurogénesis y la regeneración. A pesar de la búsqueda de estrategias de reparación como el factor de crecimiento, la célula y el suministro de biomateriales como abordajes individuales o combinatorias, estas técnicas no son capaces de expl...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El apoyo financiero fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) y F31-NS090746 (Katiyar)), la Fundación Michael J. Fox (Therapeutic Pipeline Program # 9998 (Cullen) El Premio Piloto del Centro de Neurociencias de Penn Medicine (Cullen), la Fundación Nacional de Ciencias (Becas de Investigación de Postgrado DGE-1321851 (Struzyna y Adewole)), el Departamento de Asuntos de Veteranos (Revista de Mérito de RR & D # B1097-I (Cullen) De Cirujanos Neurológicos y el Congreso de Cirujanos Neurológicos (Beca Codman 2015-2016 en Neurotrauma y Cuidados Críticos (Petrov)), y el Comando de Investigación Médica y Material del Ejército de los Estados Unidos (W81XWH-13-207004 (Cullen) y W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cortadora láserUniversal Laser SystemsPLS4.75Se utiliza para fabricar el molde de microcanal cortado con láser.
Dispositivo de fabricación de microcolumnas cortado con láserHecho a medida--------------Póngase en contacto con nuestro grupo de investigación si está interesado. Dimensiones y planos proporcionados en el manuscrito.
Tornillos----------------------------#4-40 con un diámetro de rosca de 3,05 mm
Tuercas----------------------------#4-40 con un diámetro de rosca de 3,05 mm
Aguja de acupuntura (180 µ m diámetro)Lhasa Medicalsj.16X40El diámetro puede variar según el tamaño deseado para el lumen de la microcolumna.
Placa de PetriFisher08772B
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)Invitrogen14200075
Pipeta serológica desechable de poliestirenoFisher13-678-11D
AgarosaSigmaA9539-50G
Tubo capilar (398 µ m diámetro)Fisher21170DEl diámetro puede variar según el tamaño deseado para la carcasa de la microcolumna.
Placa calefactoraFisherSP88857200
Barra magnéticaFisher1451352
MicropipetaSigmaZ683884-1EA
Aguja de calibre 25 mmFisher14-826-49
MicrobisturíRoboz SurgicalRS-6270
TijerasFine Science Tools14081-09
ForcepsWorld Precision Instruments501985
Esterilizador de perlas calientesSigmaZ378550-1EA
EstereoscopioNikonSMZ800NSe utiliza para todos los pasos de disección y para la fabricación de micro-TENN.
Cola de rata tipo I colágenoCorning 354236Mantener a 4 º C y retírelo solo cuando sea necesario. Use hielo para preservar su temperatura cuando esté en uso.
Tubo de microcentrífugaFisher02-681-256
Laminina de ratónCorning354232Mantener a 4 º C y retírelo solo cuando sea necesario. Use hielo para preservar su temperatura cuando esté en uso.
Medio neurobasalInvitrogen21103049Medio basal para el cultivo de células neuronales prenatales y embrionarias. Tienda en 4º C y cálido a 37 º C antes de usar.
Hidróxido de sodio (NaOH)FisherSS2661
Ácido clorhídrico (HCl)FisherSA48-1
Papel tornasolFisher09-876-18
Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS)Invitrogen14170112Almacene a 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen 25200056Almacene a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
Desoxirribonucleasa pancreática bovina (DNasa) ISigma10104159001Almacene a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
B-27 SuplementoInvitrogen12587010Suplemento añadido al medio Neurobasal para el cultivo de neuronas hipocampales y corticales. Almacenar a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
L-glutamina Invitrogen35050061 Tienda a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
Sprague Dawley día embrionario 18 ratasCharles RiverStrain 001
Pipeta PasteurFisher22-042816
tubo de centrífuga de 15 mLEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
centrífugaFisher05-413-115
HemocitómetroFisher02-671-6
Impresora 3D Objet30Stratasys --------------Se utiliza para fabricar los moldes piramidales de micropozos.
Molde de pozo piramidal impreso en 3DHecho a medida--------------Póngase en contacto con nuestro grupo de investigación si está interesado. Dimensiones y planos proporcionados en el manuscrito.
Polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curadoFisherNC9285739Viene en kit con elastómero y agente de curado. Úselo dentro de una campana de gases químicos.
EmbudoFisher10-348C
Bulbo de pipeta de 1 mlSigma Z509035
MicroespátulaFisherS50821
placa de cultivo de 12 pocillosEMESCO1194-353043
HornoFisher11-475-154
IncubadoraFisher13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373Almacenar en -80ºC. Virus adenoasociado (AAV) disponible comercialmente con el indicador de calcio GCaMP6f.
Formaldehído 40%FisherF77P-4El formaldehído es un compuesto tóxico conocido por ser cancerígeno y debe desecharse en un recipiente separado.
Triton X-100SigmaT8787Tensioactivo no iónico utilizado para permeabilizar membranas celulares.
Suero de caballoGibco16050-122
Anticuerpo primario anti-Tuj-1/beta-III tubulina de ratónSigmaT8578-200ULAlmacene en -20ºC.
Anti-sinapsina 1 anticuerpo primariode conejo Synaptic Systems106-001Almacenar a -20ºC.
Burro anti-ratón 568 anticuerpo secundarioInvitrogenA10037Almacenar en 4ºC.
Burro anti-conejo 488 anticuerpo secundarioInvitrogenA21206Almacenar en 4ºC.
Hoechst 33342, TrihidrocloruroInvitrogenH3570Tienda en 4ºC.  Hoechst es un mutágeno conocido que debe tratarse como cancerígeno. Por lo tanto, debe desecharse en un contenedor separado.
Microscopio confocal de escaneo láser A1RSI Nikon--------------Se utiliza para tomar las reconstrucciones confocales de construcciones inmunomarcadas.
Microscopio Eclipse Ti-S Nikon--------------Se utiliza para tomar imágenes de contraste de fase. Con adquisición de imágenes digitales utilizando una cámara QiClick interconectada con el software Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
Microscopio de fluorescencia de alta velocidad MicroscopioNikon--------------Nikon Eclipse Ti emparejado con una cámara ANDOR Neo/Zyla para la obtención de imágenes de calcio.
Software NIS Elements AR 4.50.00Nikon Instruments--------------Se utiliza para identificar transitorios de calcio a partir de las grabaciones tomadas con el microscopio de fluorescencia de alta velocidad. 

Referencias

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