Artículo de método

A Multi-agujero criovial Elimina congelación Artifacts cuando los tejidos musculares se sumergen directamente en nitrógeno líquido

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DOI:

10.3791/55616

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6 de abril de 2017

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1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento para congelar los tejidos musculares al sumergirse directamente en nitrógeno líquido. Este protocolo también pone de relieve un nuevo criovial que puede evitar el "efecto manta" de gas nitrógeno cuando los contactos de nitrógeno líquido la superficie del tejido de un espécimen.

Resumen

Los estudios sobre la fisiología del músculo esquelético se enfrentan al desafío técnico de procesar adecuadamente las muestras para obtener secciones con compartimentos citoplasmáticos claramente visibles. Otro obstáculo es la aposición estrecha de las miofibrillas a los tejidos circundantes. Debido a que el proceso de fijación del tejido y la inclusión en parafina conduce a la contracción de las fibras musculares, de congelación es un medio óptimos de endurecimiento tejido muscular para seccionar. Sin embargo, un problema comúnmente encontrado, la formación de cristales de hielo, se produce durante la preparación de secciones congeladas debido a la alto contenido de agua de los músculos. El protocolo que se presenta aquí describe primero un método simple y eficiente para congelar adecuadamente tejidos musculares sumergiéndolos en nitrógeno líquido. El problema con el uso de nitrógeno líquido solo es que causa la formación de una barrera de gas nitrógeno al lado del tejido, que actúa como un aislante e inhibe la refrigeración de los tejidos. Para evitar este efecto "manta de vapor", un necriovial w fue diseñado para aumentar la velocidad de flujo de líquido alrededor de la superficie del tejido. Esto se logró mediante la perforación de un total de 14 agujeros de entrada en la pared del vial. De acuerdo con la dinámica de burbujas, una mayor tasa de resultados de flujo de líquido en burbujas más pequeñas y menos posibilidades de formar una barrera a los gases. Cuando el nitrógeno líquido fluye en el criovial a través de los agujeros de entrada, la velocidad del flujo alrededor del tejido es lo suficientemente rápido para eliminar la barrera de gas. En comparación con el método de congelar los tejidos musculares usando isopentano previamente enfriado, este protocolo es más simple y más eficiente y se puede usar para congelar músculo de una manera rendimiento. Además, este método es óptimo para las instituciones que no tienen acceso a isopentano, que es extremadamente inflamable a temperatura ambiente.

Introducción

El músculo esquelético es el componente más valioso de un animal de producción de carne desde el punto de vista nutricional y procesamiento. En la industria de la carne, hay dos aspectos especialmente críticos: la eficiencia del crecimiento del músculo y la calidad de la carne resultante. Como componente principal del músculo, las fibras musculares están directamente relacionados con el crecimiento y la calidad de la carne fresca en animales 1. Por ejemplo, el número total de fibras (TNF) y el Área de sección transversal de fibras (CSAF) principalmente determinan la masa muscular y calidad de la carne; También, Tipo de fibra Composición (FTC) afecta en gran medida la calidad de la carne fresca 2. Por lo tanto, la manipulación de características de la fibra muscular en los animales es un método altamente eficaz para aumentar la rentabilidad del núcleo y competitividad de las explotaciones 1.

Hasta la fecha, varios factores intrínsecos y extrínsecos se han identificado para manipular, ambie fibra muscularics 1. Esta manipulación se puede lograr a través de la selección específica de los animales con genes específicos, tales como el gen de la miostatina en el ganado 3, el gen Callipyge en ovejas 4, y el RYR1 y genes IGF2 en cerdos 5. Además, el control de la dieta y los tratamientos con hormonas específicas juegan un papel importante en características de la fibra muscular 6. Por lo tanto, un enfoque que combina los factores genéticos y nutricionales podría ser capaz de mejorar el contenido de carne magra y calidad de la carne. Sin embargo, los estudios sobre las fibras musculares están limitados en la industria de la carne debido a la elucidación de la estructura de las fibras musculares todavía es un reto.

propiedades de la fibra muscular se identifican utilizando métodos histoquímicos, tales como el ensayo de la miosina adenosina trifosfatasa (ATPasa). Este método se basa en el hecho de que las enzimas encuentra en secciones delgadas (6-8 m) congelados defibras musculares se pueden hacer reaccionar químicamente con ciertos productos. Sin embargo, el contenido de agua de los músculos es mayor que 75% en cerdos, conejos, ratones y seres humanos, independientemente de la posición (es decir, la espalda, abdomen, o de las extremidades posteriores) 7. Tal alto contenido de humedad en los músculos causa un problema comúnmente encontrado - congelación artefactos - durante la preparación de criosecciones, como se describió previamente 8, 9. En la mayoría de los casos, es casi imposible para congelar adecuadamente los tejidos musculares en una línea de producción del matadero, de acuerdo con nuestra experiencia.

El protocolo que se presenta aquí describe un método simple y eficiente utilizado en nuestro laboratorio para congelar los tejidos musculares para cryosectioning en una forma de alto rendimiento. El punto culminante de este método es un nuevo criovial que está diseñado para tejidos musculares de flash-congelación en nitrógeno líquido. El flujo de trabajo actual puede facilitar simultáneamente tejidocongelación y de procesamiento para una excelente cryosection muscular, con un compartimiento citoplasmático claramente visible y la estrecha aposición de miofibras en el tejido circundante. Además, este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de opciones para el análisis del tejido porque el nitrógeno líquido no se mezcla con los tejidos.

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Protocolo

El método actual se ha establecido y validado para cosechar y almacenar más de 1.000 muestras de músculo para la tinción histológica en nuestro laboratorio. Todos los procedimientos que implican el cuidado y uso de animales a las directrices establecidas por el Ministerio de Agricultura de China.

1. Equipo para la recogida de muestras

  1. Etiquetar la identidad de la muestra en el vial criogénico.
    Nota: El vial criogénico está especialmente diseñado para congelar muestras de tejido fresco para el procedimiento de sección criogénica (Figura 1A). Los viales están hechas de polipropileno en un molde de fábrica (Figura 1C).
  2. Obtener el siguiente equipo: nitrógeno líquido en un tanque de nitrógeno líquido apropiado, gafas de seguridad o un protector de cara, guantes congelador, 10 cm fórceps, 25 pinzas cm, un enfriador de espuma de poliestireno (dimensiones internas: 20 cm de largo x 12 cm de ancho x 13,5 cm de alto ; dimensiones exteriores: 24 cm de largo x 16 cm de ancho x 15 cm de altura), película de plástico (2,5 cm de largo x 0,8 cm de ancho x 0,1 mm de espesor),un bisturí, y las cubiertas de unión A4 PVC (21 cm x 29,5 cm) (Figura 1B).

2. Preparación de muestras de músculo

  1. Llenar el enfriador de poliestireno con nitrógeno líquido 5 min antes de la recogida de muestras.
    NOTA: El gran columna de nitrógeno líquido es esencial porque parte del nitrógeno líquido hierve lejos y se convierte en gas cuando las muestras frescas toquen. Con el fin de reducir la frecuencia de transferencia de nitrógeno líquido para reponer la pérdida, un enfriador de espuma de poliestireno de tamaño apropiado debe ser adquirida por adelantado de acuerdo con el número de muestras.
  2. Una vez que se obtiene un espécimen, suavemente colocarlo en una pieza de la cubierta de unión A4 PVC y observar la dirección de las fibras musculares.
    NOTA: En este caso, hemos utilizado la sección transversal del músculo longissimus Doris desde la primera hasta la última vértebra lumbar en los cerdos. Los especímenes son de aproximadamente 12 cm de largo, 8 cm de ancho, y 5 cm de altura.
  3. Utilizar un bisturí para realizar dos incisiones paralelas a través de la I Modelon la dirección de las fibras musculares, de aproximadamente 3 cm de longitud y 0,6 cm de distancia. Recorte el músculo incisa en un rectángulo de aproximadamente 0,6 cm de ancho x 0,6 cm de alto x 1,5 cm de largo.
    NOTA: La fiabilidad de la medición de la superficie de sección transversal de las fibras musculares depende principalmente de la orientación de las fibras del músculo incisa.
  4. Utilice 10 fórceps cm para poner suavemente la muestra en un trozo de película de plástico, con el eje longitudinal del músculo paralelo incisa al borde largo de la película (Figura 2A).
    NOTA: La película de plástico tiene dos funciones: una función de sujeción que ayuda en la fijación de la orientación de las fibras musculares y una función de adherencia que impide que las grietas en la muestra debido a la rápida congelación.
  5. El uso de pinzas, coloque el tejido muscular en el medio inferior de un vial criogénico de marcado, sólo entre los agujeros de entrada, y luego tapa fuertemente el vial (Figura 2B).

3. Congelación y Almacenamiento de muestra de músculos

  1. El uso de 25 pinzas cm, sumergir rápidamente todo el vial criogénico en nitrógeno líquido en el enfriador de poliestireno pre-enfriado, a la espera hasta que el nitrógeno líquido no hierva (aproximadamente 10-20 s).
    NOTA: El criovial flotará cuando el nitrógeno líquido está hirviendo, por lo sumerja cuidadosamente el vial en el nitrógeno líquido en ebullición durante 10-20 s.
  2. La transferencia de las muestras de músculo a un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido o un congelador a -80ºC para almacenamiento a largo plazo.

4. Slide Preparación

  1. Preenfriar un criostato a entre -20 ° C y -22 ° C.
  2. Retirar y desechar la vieja cuchilla del micrótomo, limpiar el soporte de la cuchilla y la placa estabilizadora en el criostato, instalar una nueva cuchilla del micrótomo en el criostato, y establecer el espesor de corte a 8 m.
  3. Transferir la muestra del músculo en el vial criogénico del depósito de almacenamiento de nitrógeno líquido o -80 ° C congelador al criostato, su transporte en nitrógeno líquido o en hielo seco.
  4. Esperar 30 min para el espécimen se equilibre con la temperatura del criostato.
    NOTA: Cualquier equipo que pueda tocar la muestra debe ser pre-enfría, porque una alta temperatura puede causar la formación de cristales de hielo en la muestra.
  5. Montar la muestra en el soporte de la muestra bajo la formulación óptima temperatura de corte de glicoles y resinas solubles en agua (OCT). Cortar secciones 8-M.
    NOTA: Ajuste el ángulo de corte perpendicularmente a la orientación de las fibras musculares, debido a que el CSAF es el área de sección transversal de las fibras musculares.
  6. Montar las secciones hacia el centro de un portaobjetos de microscopio a temperatura ambiente. Inmediatamente colocar el portaobjetos en una caja de portaobjetos en un congelador a -80ºC. No permita que el portaobjetos se seque a temperatura ambiente.

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Resultados

La ilustración criovial y el equipo común de laboratorio para la congelación de los músculos durante la preparación de secciones congeladas se muestran en la Figura 1. Los crioviales están hechos de polipropileno en un molde de fábrica. Cada vial tiene un total de 14 agujeros de entrada: uno está en la tapa; otra es en la parte inferior; y los 12 forma de cuatro líneas paralelas restantes, cada uno con cuatro agujeros a 90º uno del otro. Estos orificios de entrada pueden...

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Discusión

A continuación, describimos una nueva, criovial múltiples orificios para la congelación y el almacenamiento de los tejidos musculares para llevar a cabo las evaluaciones histológicas de la función muscular. El paso modificado crítico en este protocolo es que la muestra en el criovial multi-agujero se sumerge directamente en nitrógeno líquido. A nuestro entender, esta es la manera más simple y rapidest obtener excelentes muestras congeladas para cryosectioning muscular entre los métodos de congelación existentes (ver los...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés, financiera o de otra manera, son declarados por los autores.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF): 31301950 y 31671288.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microtomo de criostato  Leica Leica CM1950
 NikonNikon DS-U3
  Vial criogénico     PelículaDiseñado por nosotros mismos
Nitrógeno líquido
Bisturí
10 cmcomún
25 cmcomún Vidrio
común
Guantesde congelador de uso comúnDe uso comulgado
Microscopio digital de plástico de uso común Pinza de de uso Pinza de de uso de seguridad de uso

Referencias

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