Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Junning Yang; Chuanshen Wu; Ioana Stefanescu; Arie Horowitz

doi:10.3791/55621

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

8.8K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/55621

⸱

22 de abril de 2017

Junning Yang¹ , Chuanshen Wu² , Ioana Stefanescu¹ , Arie Horowitz¹^,³

¹Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, ²Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, ³Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

En este artículo

Resumen

Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.

Resumen

Células madre embrionarias de ratón (CES) aislados a partir de la masa interna del blastocisto (típicamente al día E3.5), se pueden utilizar como sistema de modelo in vitro para estudiar el desarrollo embrionario temprano. En ausencia de factor inhibidor de leucemia (LIF), CES diferencian por defecto en las células precursoras neurales. Pueden ser amasaron en una de tres dimensiones (3D) agregada esférica denomina cuerpo embrioides (EB), debido a su similitud con el embrión etapa temprana. EBs se pueden sembrar en cubreobjetos recubiertos de fibronectina, donde se expanden por el crecimiento de dos extensiones (2D) dimensionales, o implantados en matrices de colágeno 3D donde continúan creciendo como esferoides, y se diferencian en las tres capas germinales: endodérmico, mesodérmico y ectodérmico. El cultivo de colágeno 3D imita el entorno in vivo más de cerca que la EBs 2D. El cultivo 2D EB facilita el análisis por inmunofluorescencia e inmunotransferencia para rastrear la diferenciación. Hemos desarrollado una diferenciación neuronal de dos pasosprotocolo ción. En el primer paso, EBs son generados por la técnica de gota colgante, y, simultáneamente, son inducidas a diferenciarse mediante la exposición a ácido retinoico (RA). En el segundo paso, la diferenciación neural avanza en un formato 2D o 3D en ausencia de AR.

Introducción

CES se originan a partir de la masa celular interna del blastocisto. Estas células son pluripotentes, es decir, tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula del organismo de origen. CES diferenciación in vitro es de gran interés como un sistema experimental para la investigación de las vías y mecanismos de desarrollo. Ofrece un modelo de sistema potente y flexible para probar nuevos enfoques terapéuticos para la corrección de la disfunción de las células y los tejidos. EB recapitulan muchos aspectos de la diferenciación celular durante la embriogénesis temprana. En particular, EBs se pueden utilizar cuando la letalidad embrionari....