LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica

Summary

Aquí se presenta un protocolo paso a paso de la longitud larga electrostática método (LERLIC-MS / MS) repulsión-hidrófilo interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem. Esta es una metodología novedosa que permite por primera cuantificación tiempo y caracterización de los glutamina y asparagina isoformas de desamidación por proteómica escopeta.

Abstract

Caracterización de la desamidación de proteínas es imprescindible para descifrar el papel (s) y las potencialidades de esta modificación postraduccional de proteínas (PTM) en la patología humana y otros contextos bioquímicos. Para llevar a cabo la caracterización de la desamidación de proteínas, hemos desarrollado recientemente una novela de longitud larga electrostática interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem repulsión-hidrófilo (LERLIC-MS / MS) método que puede separar la glutamina (Gln) y asparagina isoforma (Asn) productos de desamidación de compuestos modelo a muestras biológicas muy compleja. LERLIC-MS / MS es, por lo tanto, la primera estrategia proteómica escopeta para la separación y cuantificación de las isoformas de desamidación de Gln. También demostramos, como novedad, que el protocolo de procesamiento de muestras descrito aquí estabiliza el intermedio de succinimida que permite su caracterización por LERLIC-MS / MS. Aplicación de LERLIC-MS / MS, como se muestra en este artículo de vídeo puede ayudar a dilucidar el momento desconocidaarrays n moleculares de desamidación de proteínas. Además, LERLIC-MS / MS proporciona una mayor comprensión de las reacciones enzimáticas que abarcan la desamidación en fondos biológicas distintas.

Introduction

La desamidación es una modificación postraduccional de proteínas (PTM) que introduce una carga negativa a la cadena principal de proteína a través de la modificación de la asparagina (Asn) y / o residuos de glutamina (Gln) ^1. Esta modificación mientras que afecta a los residuos de Asn genera el ácido isoaspártico productos isómeros (isoAsp) y N ácido aspártico (Asp) a una común relación 3: 1 ^2. No obstante, esta relación puede ser alterado por la intervención de la enzima de reparación metiltransferasa-L isoaspartilo (PIMT) ^{3, 4.} Del mismo modo, la desa....

Protocol

1. Embalaje El anión de intercambio de longitud larga columna (LAX) Capilar

(Nota: A pesar de la columna puede ser de LAX en el hogar lleno como se describe en este protocolo, columnas LAX también están disponibles comercialmente, véase la Tabla de Materiales y Reactivos para más detalles).

1. Suspender 50 mg de material de embalaje de intercambio aniónico débil en 3,5 ml de tampón de embalaje (Tabla 1) para preparar la suspensión.
2. Montar el extremo de la columna capilar (50 cm de longitud - 200 m de diámetro interno ID del tubo ()) usando una de hembra a hembra apropiado, una f....

Results

La desamidación de residuos Gln y Asn se considera una modificación de proteínas degenerativa (DPM) implicado en varias enfermedades crónicas y fatales ^14. Se ha demostrado que este PTM puede predecir la vida media y degradativas estados de anticuerpos y otras moléculas en el cuerpo humano y fondos biológicas similares ^{1, 15.} La importancia de la desamidación de proteínas, de hecho, va más allá del context.......

Discussion

En este video-artículo se presenta un protocolo paso a paso de LERLIC-MS / MS ^3, un método para llevar a cabo la caracterización en profundidad y para determinar con precisión la extensión de la desamidación de proteínas y los procesos enzimáticos que participan en esta modificación de la proteína. LERLIC-MS / MS se basa en el uso de una de longitud larga (50 cm) LAX bajo el principio de cromatografía electrostática de repulsión-hidrófilo interacción (ERLIC) ^27. El uso de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 y micro; m 100-Å (material a granel)	PolyLC Inc.	Pedido
Columna capilar de intercambio iónico de larga longitud 50 cm - 200 µ m ID	PolyLC Inc.	Pedido
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µ m ID x 50 cm de longitud	SGE Analytical Science bajo Trajan Scientific Australia	620050
Racor hembra a hembra para tubos de 1/16" de diámetro exterior	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Tuerca hembra para microférula	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microférula	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Bomba de presión NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC sistema	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Tubos de bloqueo seguro	Eppendorf	T9661-1000EA
Perlas de acero inoxidable. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. No estéril.	Siguiente Centrífuga	Advance SSB14B
	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Baño Circulante Digital Estándar Calentado, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 cartucho de desalinización 50 mg	Aguas	WAT020805
Concentrador de vacío	Eppendorf		Concentrador Plus
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Espectrómetro de masas Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	Incubadora TCSI-SS2
INCUCELL	MMM Grupo	INCUCELL111
Tripsina modificada de grado de secuenciación	Promega	V5111
Comprimidos de cóctel de inhibidores de la proteasa	Roche	11836170001 (ROCHE)
Solución tampón de fosfato 10x (diluida a 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Acetato de amonio	Sigma-Aldrich	A1542
Desoxicolato de sodio	Sigma-Aldrich	D6750
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Yodoacetamida	Sigma-Aldrich	i6125
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Hidróxido de amonio	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitrilo grado HPLC	Sigma-Aldrich	675415
Grado de HPLC de isopropanol	Sigma-Aldrich	675431
Grado de HPLC	Sigma-Aldrich	14263