Aquí se presenta un protocolo paso a paso de la longitud larga electrostática método (LERLIC-MS / MS) repulsión-hidrófilo interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem. Esta es una metodología novedosa que permite por primera cuantificación tiempo y caracterización de los glutamina y asparagina isoformas de desamidación por proteómica escopeta.
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Artículo de método
LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica
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En este artículo
Resumen
Resumen
Caracterización de la desamidación de proteínas es imprescindible para descifrar el papel (s) y las potencialidades de esta modificación postraduccional de proteínas (PTM) en la patología humana y otros contextos bioquímicos. Para llevar a cabo la caracterización de la desamidación de proteínas, hemos desarrollado recientemente una novela de longitud larga electrostática interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem repulsión-hidrófilo (LERLIC-MS / MS) método que puede separar la glutamina (Gln) y asparagina isoforma (Asn) productos de desamidación de compuestos modelo a muestras biológicas muy compleja. LERLIC-MS / MS es, por lo tanto, la primera estrategia proteómica escopeta para la separación y cuantificación de las isoformas de desamidación de Gln. También demostramos, como novedad, que el protocolo de procesamiento de muestras descrito aquí estabiliza el intermedio de succinimida que permite su caracterización por LERLIC-MS / MS. Aplicación de LERLIC-MS / MS, como se muestra en este artículo de vídeo puede ayudar a dilucidar el momento desconocidaarrays n moleculares de desamidación de proteínas. Además, LERLIC-MS / MS proporciona una mayor comprensión de las reacciones enzimáticas que abarcan la desamidación en fondos biológicas distintas.
Introducción
La desamidación es una modificación postraduccional de proteínas (PTM) que introduce una carga negativa a la cadena principal de proteína a través de la modificación de la asparagina (Asn) y / o residuos de glutamina (Gln) 1. Esta modificación mientras que afecta a los residuos de Asn genera el ácido isoaspártico productos isómeros (isoAsp) y N ácido aspártico (Asp) a una común relación 3: 1 2. No obstante, esta relación puede ser alterado por la intervención de la enzima de reparación metiltransferasa-L isoaspartilo (PIMT) 3, 4. Del mismo modo, la desa....
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Protocolo
1. Embalaje El anión de intercambio de longitud larga columna (LAX) Capilar
(Nota: A pesar de la columna puede ser de LAX en el hogar lleno como se describe en este protocolo, columnas LAX también están disponibles comercialmente, véase la Tabla de Materiales y Reactivos para más detalles).
- Suspender 50 mg de material de embalaje de intercambio aniónico débil en 3,5 ml de tampón de embalaje (Tabla 1) para preparar la suspensión.
- Montar el extremo de la columna capilar (50 cm de longitud - 200 m de diámetro interno ID del tubo ()) usando una de hembra a hembra apropiado, una f....
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Resultados
La desamidación de residuos Gln y Asn se considera una modificación de proteínas degenerativa (DPM) implicado en varias enfermedades crónicas y fatales 14. Se ha demostrado que este PTM puede predecir la vida media y degradativas estados de anticuerpos y otras moléculas en el cuerpo humano y fondos biológicas similares 1, 15. La importancia de la desamidación de proteínas, de hecho, va más allá del context.......
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Discusión
En este video-artículo se presenta un protocolo paso a paso de LERLIC-MS / MS 3, un método para llevar a cabo la caracterización en profundidad y para determinar con precisión la extensión de la desamidación de proteínas y los procesos enzimáticos que participan en esta modificación de la proteína. LERLIC-MS / MS se basa en el uso de una de longitud larga (50 cm) LAX bajo el principio de cromatografía electrostática de repulsión-hidrófilo interacción (ERLIC) 27. El uso de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de Educación de Singapur (Nivel 2: Grant ARC9 / 15), Consejo Nacional de Investigación Médica de Singapur (NMRC-DE-GRI-0003 hasta 2016), y el NTU-NHG Aging Research Grant ( subvención ARG / 14017). Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento y más sincero agradecimiento al Dr. Andrew Alpert y equipo para PolyLC amablemente nos proporcionó los materiales de embalaje que hicieron posible este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PolyCAT 3 y micro; m 100-Å (material a granel) | PolyLC Inc. | Pedido | |
| Columna capilar de intercambio iónico de larga longitud 50 cm - 200 µ m ID | PolyLC Inc. | Pedido | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µ m ID x 50 cm de longitud | SGE Analytical Science bajo Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Racor hembra a hembra para tubos de 1/16" de diámetro exterior | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Tuerca hembra para microférula | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microférula | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Bomba de presión NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC sistema | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Tubos de bloqueo seguro | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Perlas de acero inoxidable. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. No estéril. | Siguiente Centrífuga | Advance SSB14B | |
| Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | ||
| Baño Circulante Digital Estándar Calentado, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 cartucho de desalinización 50 mg | Aguas | WAT020805 | |
| Concentrador de vacío | Eppendorf | Concentrador Plus | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Espectrómetro de masas Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | Incubadora TCSI-SS2 | |
| INCUCELL | MMM Grupo | INCUCELL111 | |
| Tripsina modificada de grado de secuenciación | Promega | V5111 | |
| Comprimidos de cóctel de inhibidores de la proteasa | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Solución tampón de fosfato 10x (diluida a 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Acetato de amonio | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Ditiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Yodoacetamida | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Ácido fórmico | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Hidróxido de amonio | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrilo grado HPLC | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Grado de HPLC de isopropanol | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Grado de HPLC | Sigma-Aldrich | 14263 |
Referencias
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....
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Reimpresiones y permisos
